Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro - NỘI DUNG NGHIÊN CỨ- 123docz.net

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro

2.3.1.1. Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh

Khử trùng hạt

- Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất.

- Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn 700

trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm dung dịch Javen 60% lắc đều trong 20 - 25 phút, sau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần.. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ.

Tạo mô sẹo

Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250

C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức:

t cp

N N

Ci (%)

Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%)

Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy

Tái sinh cây

Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển.

Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức:

sv r c N N R  (%)

Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%) Nr là tổng số mô tái sinh cây Nsv là tổng số mô nuôi cấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Kéo dài chồi đậu xanh

Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần. Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn.

Tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần.

2.3.1.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô

Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý.

Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức:

f d f L W W W W   (%)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trong đó: WL:độ mất nước (%)

Wf: khối lượng mô tươi (mg)

Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg)

Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây

Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7).

+ Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức: t sv v N N S  (%) Trong đó: Sv: tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv: số mô sống sót Nt: tổng số mô xử lý

+ Tỷ lệ tái sinh cây:

sv r c N N R  (%)

Trong đó: Rc: khả năng tái sinh cây (%) Nr: số mô tái sinh cây

Nsv: số mô sống sót

Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc

Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250C  10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Phƣơng pháp ra cây

Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên.

Các bước ra cây được tiến hành như sau:

- Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch.

- Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1: 1,5: 1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm.

- Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc.

- Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm.

2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng

Các dòng đậu xanh được trồng thành từng lô thí nghiệm riêng. Chế độ chăm sóc giống nhau ở các dòng và giống gốc. Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn sinh trưởng trong vụ xuân hè. Đánh giá đặc điểm nông học của các dòng qua các chỉ tiêu : Chiều cao cây, số cành/ cây, số quả/ cây, số hạt chắc/quả, thời gian ra hoa, thời gian kết quả... Quả mỗi dòng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

được đánh dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng vụ tiếp theo.

2.3.3. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu

Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu (x), phương sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu (Sx), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [11].

2.3.4. Phuơng pháp sinh học phân tử

2.3.4.1. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ lá cây đậu xanh

- Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá đậu xanh theo phương pháp của Gawel và cs(1991)

- Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%.

- Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ Biomate3 ở bước sóng 260nm/280nm. Nồng độ ADN trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:

Nồng độ ADN (ng/µl) = OD260 × 50 × HSPL (2.5) Độ sạch ADN = OD260 / OD280 (2.6) HSPL: Hệ số pha loãng

50: Hằng số

OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260nm OD280 : Chỉ số đo dược ở bước sóng 280nm

2.3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD

Phản ứng RAPD được tiến hành với 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp bởi hãng Invitrogen, các mồi có trình tự dài 10 nucleotit, thông tin về trình tự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các mồi được trình bày ở bảng 2.1.

Phản ứng RAPD được tiến hành theo phương pháp của William và CS (1990) [55]. Phản ứng RAPD được thực hiện trong 25µl dung dịch chứa 12,5µl đệm PCR matermix + 1µl mồi + 1 µl DNA khuôn (50ng/ µl) +9,05 µl H2O. Phản ứng RAPD được tiến hành trên máy PCR Amplied Bio Systems (USA/ Singpore).

Điện di ADN tổng số và sản phẩm RAPD trên gel agarose 0,8% và 1,5%, nhuộm Ethiđium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.

2.3.4.3. Phân tích số liệu RAPD

Bảng 2.2. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi M1 5’ AACCGACGGG 3’ M6 5’ GTGTCTCAGG 3’

M2 5’ GGGGGTCGTT 3’ M7 5’ CAGCACCCAC 3’

M3 5’ TACCACCCCG 3’ M8 5’ GGAAGTCGCC 3’

M4 5’ GGCGGACTGT 3’ M9 5’ CCTCAGTGTA 3’

M5 5’ TCGGCGATAG 3’ M10 5’ CTATGCCGAC 3’ Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD của các dòng chọn lọc với các mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho phân tích số liệu. Tiêu chuẩn hóa sản phẩm RAPD theo qui ước:

Số 1: xuất hiện các phân đoạn ADN Số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Các số liệu này được xử lý trên máy tính bằng chương trình NTSYpc version 2.0 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998), để lập ra biểu đồ so sánh sự khác nhau giữa dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ CHỌN DÕNG CHỊU HẠN Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU

3.1.1. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của hai giống đậu xanh

Khả năng tạo mô sẹo được đánh giá sau 10 ngày nuôi cấy. Sau 10 ngày nuôi cấy mô sẹo được cắt nhỏ với kích thước 3 mm2

và cấy trên môi trường tái sinh. Khả năng tái sinh được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy.

Kết quả cho thấy, cả 2 giống đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy và tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống khá cao từ 86,36% - 95,67%, trong đó tỷ lệ tạo mô sẹo của giống VN 93-1 là 86,36%; còn giống VC 1973A là 95,67%. Tỷ lệ tái sinh lại thấp hơn rất nhiều, dao động từ 12,54% - 18,32%. Trong đó giống VN 93-1 có tỷ lệ tái sinh cao nhất là 18,32%. Giống VN 93-1 có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn nhưng tỷ lệ tái sinh lại cao hơn so với giống VC – 1973A.

Mô sẹo của hai giống đậu xanh có màu vàng trắng, mô sẹo cứng và khô có khả năng tái sinh cao hơn so với những mô có màu nâu đen, mô sẹo mọng nước. Chúng tôi nhận thấy rằng khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống [12], [15].

3.1.2. Độ mất nƣớc và khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo phôi các giống đậu xanh

Để xây dựng quy trình chọn dòng chịu hạn, chúng tôi đã xác định ngưỡng chịu hạn của mô sẹo. Khi tiến hành xác định khả năng chịu hạn của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các giống ở mức độ mô sẹo thông qua các chỉ tiêu về mức độ mất nước, khả năng chịu mất nước và tái sinh cây của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo với các ngưỡng 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục.

3.1.2.1. Mức độ mất nƣớc của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô

Để chọn ra các dòng tế bào có khả năng chịu mất nước, các nhà khoa học tiến hành cho các tế bào mô sẹo bị mất nước lý học bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy. Ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9, 11 giờ liên tục, lượng nước trong mô giảm dần tới mức không thể bay hơi được nữa.

Kết quả xác định khả năng chịu mất nước của mô sẹo dưới tác động của thổi khô đối với các giống VN93-1; VC1973A ở các ngưỡng thời gian là 0, 3, 5, 7, 9,11 giờ liên tục được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô (% khối lượng tươi)

Giống 0 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 9 giờ 11 giờ

VN93-1 0,00 45,84 70,28 82,75 91,79 98,32 VC1973A 0,00 50,62 78,15 85,44 94,19 95,84

Độ mất nước của mô tăng theo thời gian thổi khô ở tất cả các giống. Ở các ngưỡng xử lý từ 3 giờ đến 9 giờ, giống VC1973A đều có mức độ mất nước cao hơn giống VN93-1. Tuy nhiên, ở ngưỡng 11 giờ thổi khô mức độ mất nước của mô sẹo giống VN93-1 là 98,32% cao hơn so với giống VC1973A (95,84%). Sự khác biệt này có thể do mô sẹo giống VC1973A chứa hàm lượng chất khô lớn hơn. Mức độ mất nước cao nhất ở ngưỡng xử lý 3 giờ và 5 giờ. Ở các ngưỡng thổi khô 7 giờ, 9 giờ, 11 giờ, độ mất nước của mô giảm dần. Nhìn chung, tốc độ mất nước giữa các giống không có sự sai khác đáng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

kể. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của các tác giả khi chọn dòng tế bào chịu thổi khô ở lúa, ở lạc [4], [7], [10], [15], [18].

0 20 40 60 80 100 120 0 3 5 7 9 11

Thời gian thổi khô (Giờ)

Tỷ lệ m ất nƣ ớc (%) VN93-1 VC1973A

Hình 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô

3.1.2.2. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo

Tỷ lệ sống sót của mô sẹo phôi đậu xanh được đánh giá sau khi nuôi phục hồi 1 tuần. Quan sát khả năng phục hồi mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lí bằng thổi khô được cấy lên môi trường tái sinh chúng tôi thấy, sau 2-3 ngày những mô sẹo sống sót đã hút nước và sinh trưởng bình thường. Những mô sống sót có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, sau 1 tuần kích thước mô sẹo đã lớn hơn khối mô trước khi xử lý. Những mô bị chết có màu đen hoặc trắng, kích thước không thay đổi. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo các giống sau khi xử lý bằng thổi khô được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2.

Kết quả hình 3.2 và hình 3.2 cho thấy, Tỉ lệ sống sót của mô sẹo tỷ lệ nghịch với thời gian xử lí, thời gian xử lý càng dài tỷ lệ sống sót của mô sẹo càng giảm Sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ thổi khô, tỷ lệ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót của giống VN93- 1 lớn hơn giống VC1973A. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô giảm nhanh ở ngưỡng 9 giờ và 11 giờ thổi khô. Ở ngưỡng 11 giờ, khả năng sống sót của giống VN93- 1 là 5,38%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trong khi giống VC1973A không có khối mô nào sống sót.

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần