Nghiên cứu quy trình nhân nhanh một số giống mía mới bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

Giống mía mới nhân bằng cấy mô sạch bệnh dịch được coi là vật liệu thiết yếu trong hệ thống giống của công nghiệp mía đường ở nhiều nước trên thế giới.. Do vậy, việc ch n đoán bệnh và ng

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

VŨ ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG MÍA MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-o0o -

VŨ ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG MÍA MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS TS Đỗ Năng Vịnh

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào Mọi sự giúp

đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các thông tin, tài liệu trình

bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc và được phép công bố

Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên thực hiện

Vũ Anh Tuấn

Để hoàn thành tốt luận án này trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc GS.TS Đỗ Năng Vịnh đã tạo mọi điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu

Đồng thời tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Trần Thị Hạnh đó trực tiếp

hướng dẫn tôi thực hiện các thí nghiệm, Cùng toàn thể các Anh chị em cán bộ

phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật - Viện Di Truyền Nông

Nghiệp đó nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo đã dạy bảo và giúp đỡ tận

tình trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, động viên to lớn của gia

đình và các bạn thành viên trong lớp cao học

Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên cao học

Vũ Anh Tuấn

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ASEAN Association of Southest Asian Nations

MS Môi trường Murashige and Skoog, 1962

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Mười quốc gia sản xuất mía hàng đầu thế giới

2 Bảng 3.1 Tỷ lệ mô phân sinh mía bật chồi trên môi trường

3 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP lên hệ số nhân chồi của các

4 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến hệ số nhân chồi của

5 Bảng 3.4

Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến quá trình nhân nhanh chồi của giống mía LS2 sau 4 tuần nuôi cấy

50

6 Bảng 3.5

Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến quá trình nhân nhanh chồi của giống mía LS1 sau 4 tuần nuôi cấy

50

7 Bảng 3.6

Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến quá trình nhân nhanh chồi của giống mía MY5514 sau 4 tuần nuôi cấy

51

8 Bảng 3.7

Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến quá trình nhân nhanh chồi của giống mía QĐ93159 sau 4 tuần nuôi cấy

51

9 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của số chồi trong cụm chồi đến hệ số

10 Bảng 3.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến qúa trình kéo

dài chồi của các giống mía sau 2 tuần nuôi cấy 55

11 Bảng 3.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến qúa trình kéo

dài chồi của các giống mía sau 2 tuần nuôi cấy 56

12 Bảng 3.11

Ảnh hưởng của NAA và hàm lượng đường khác nhau đối với sự hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy LS1, LS2

58

13 Bảng 3.12

Ảnh hưởng của NAA và hàm lượng đường khác nhau đối với sự hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy của hai giống MY5514, QĐ93159

58

14 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy đến sự ra rễ của

chồi mía trên môi trường lỏng sau 2 tuần nuôi cấy 61

15 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nền giâm đến khả năng phát triển

của cây con trên vườn ươm của giống LS1 62

16 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nền giâm đến khả năng phát triển

của cây con trên vườn ươm của giống LS1 63

23 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nền giâm đến khả năng phát triển

của cây con trên vườn ươm của giống MY5514 63

24 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của nền giâm đến khả năng phát triển

của cây con trên vườn ươm của giống QĐ93159 64

DANH MỤC HÌNH VẼ

1 Hình 3.1 Biểu hiện bệnh trắng lá và chồi cỏ ở các mẫu thu thập 32

2 Hình 3.2 Thu thập mẫu nghi nhiễm bệnh chồi cỏ ở Tam Hợp,

36

5 Hình 3.5 Cây phân loại các chủng phytoplasma gây bệnh chồi cỏ 37

6 Hình 3.6 Kết quả phân tích nested-PCR các mẫu mía thu thập ở

Tân Châu sử dụng c p mồi c p mồi SGSVN-Fwd1/Rev 39

7 Hình 3.7

So sánh trình tự 16s rDNA của chủng SCWLVN-TN với các chủng SCWLBDVN A và SCWLCN-Yuetang-86-386 (B)

41

8 Hình 3.8 Cây phân loại các chủng phytoplasma gây bệnh trắng lá 41

9 Hình 3.9 Các phản ứng khác nhau của mẫu tái sinh từ nuôi cấy

10 Hình 3.10 Một số hình ảnh tái sinh cụm chồi từ nuôi cấy chồi đỉnh

11 Hình 3.11 Biểu đồ ảnh hưởng của BAP lên hệ số nhân chồi của

12 Hình 3.12 Ảnh hưởng của BAP lên nhân chồi của các giống

QĐ93159, LS1, My5514 và LS2 từ trái sang phải 47

13 Hình 3.13 Biểu đồ ảnh hưởng của kinetin đến hệ số nhân chồi của

14 Hình 3.14 Giống LS1 trên môi trường nhân chồi có Kinetin 49

15 Hình 3.15

Biều đồ ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của 04 giống LS1, LS2, MY5514, QĐ93159

52

16 Hình 3.16 Biểu đồ Ảnh hưởng của số chồi trong cụm chồi đến hệ

17 Hình 3.17 Ảnh nhân chồi của các giống với mật độ 5 chồi/ cụm 54

18 Hình 3.18 Ảnh hưởng của BAP đến quá trình kéo dài chồi của các

19 Hình 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành

20 Hình 3.20 Biểu đồ ảnh hưởng của NAA và hàm lượng đường

khác nhau đến sự hình thành rễ của các giống mía 59

29 Hình 3.21 Bình nuôi cấy ra rễ mật độ 30 cây/bình 62

30 Hình 3.22 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất đến sinh trưởng và

phát triển của cây sau cấy mô ở ngoài vườn ươm 64

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH VẼ iv

MỤC LỤC vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đ t vấn đề 1

2 Mục tiêu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đ c điểm sinh học, phân loại và di truyền học của cây mía Saccharum officinarum liên quan đến quá trình nhân giống 4

1.1.1 Nguồn gốc 4

1.1.2 Phân loại 4

1.1.3 Đ c điểm di truyền nhiễm sắc thể ở mía và quá trình nhân giống 5

1.1.4 Vấn đề sâu bệnh ở mía 6

1.2 Vai trò của giống mía và cơ cấu giống đối với sản xuất 7

1.3 Tình hình sản xuất mía đường trên thế giới và nước ta 8

1.3.1.Tình hình sản xuất mía đường trên thế giới 8

1.3.2.Tình hình sản xuất mía đường trong nước 10

1.3.3 Những nguyên nhân, tồn tại của ngành mía đường hiện nay 12

1.3.4 Tình hình hình sâu bệnh hại chính 12

1.4 Những vấn đề đại cương về công nghệ cấy mô mía 14

1.4.1 Các phương pháp tạo giống sạch bệnh cơ bản dựa trên kỹ thuật cấy mô 14

1.4.2 Công nghệ tế bào hiệu quả cao trong phục tráng giống, tạo giống sạch bệnh và nhân giống nhanh 14

1.4.2.1 Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh 14

1.4.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô lá non ở chồi đỉnh 15

1.4.2.3 Phương pháp nhân giống mía thông qua nuôi cấy mô sẹo 16

1.4.3 Các hướng nghiên cứu cải thiện công nghệ vi nhân giống thực vật 17

1.4.4 Thành tựu nhân nhanh giống bằng cấy mô qui mô công nghiệp 17

1.4.4.1 Nhân giống nhanh bằng cấy mô rút ngắn thời gian chọn giống và nhanh chóng đưa các giống mới chọn tạo vào sản xuất lớn, đại trà 17

1.4.4.2 Nhân giống nhanh bằng cấy mô phục tráng giống tốt và bảo

đảm sạch bệnh 18

1.4.4.3 Nghiên cứu chuyển gen ở mía 19

1.4.5 Bảo quản quỹ gen giống mía in vitro 19

1.4.5.1 Các trung tâm bảo quản quỹ gen 19

1.4.5.2 Bảo quản tập đoàn mía in vitro 19

1.5 Công nghệ nhân giống mía bằng cấy mô và vấn đề nguyên liệu của công nghiệp mía đường 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24

2.3.1.1 Phương pháp sàng lọc cây mía nhiễm bệnh 24

2.3.1.2 Chọn mẫu và xử lý mẫu đưa vào nuôi cấy mô 28

2.3.1.6.Môi trường, điều kiện nuôi cấy 31

2.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi 31

2.4 Phương pháp theo dõi và xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Nghiên cứu ch n đoán một số bệnh dịch hại mía bằng kỹ thuật PCR phục vụ cho phát hiện bệnh và nguồn gen nhiễm bệnh chồi cỏ mía, trắng lá mía 32

3.1.1 Ch n đoán bệnh do phytoplasma 32

3.1.2 Ch n đoán bệnh chồi cỏ 32

3.1.3 Ch n đoán bệnh trắng lá 38

3.2 Tạo nguồn vật liệu ban đầu Chồi cấp I từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi nách 43

3.2.1 Khử trùng vật liệu 43

3.2.2 Phản ứng của các giống mía khác nhau trên môi trường khởi tạo 43

3.3 Nhân nhanh các giống mía trên các môi trường nhân chồi khác nhau 45

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP lên hệ số nhân chồi 46

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin phối hợp với BAP lên hệ số nhân

chồi 47

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến quá trình hình thành chồi của các giống mía sau 4 tuần 49

3.3.4 Nghiên cứu tương tác của các chồi trong cùng một cụm chồi đối với sinh trưởng và đẻ nhánh của chồi nuôi cấy 53

3.4 Nghiên cứu cải thiện môi trường tạo rễ và cây mía hoàn chỉnh 54

3.4.1 Nghiên cứu vai trò của môi trường kéo dài chồi hay còn gọi là môi trường tiền ra rễ đối với nhân giống mía 54

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của 04 giống LS1, LS2, MY5514, QĐ93159 57

3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy đối với sự ra rễ 60

3.7 Tóm tắt Sơ đồ quy trình công nghệ nhân nhanh giống mía 65

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Đề nghị: Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được ứng dụng triển khai vào nhân nhanh giống mía in vitro để cung cấp giống mía mới, sạch bệnh cho các vùng nguyên liệu mía trong nước 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 76

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo Cục Trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), những năm gần đây giá đường và giá mía đều giảm Điển hình như vụ ép 2014-2015, giá thu mua mía

10 chữ đường (CCS) tại ruộng chỉ từ 750.000 đồng đến 900.000 đồng/tấn, giảm so với

vụ trước từ 100.000 đồng đến 150.000 đồng/tấn Các địa phương và doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh mía đường đã xây dựng nhiều chính sách hỗ trợ người trồng mía, nhưng do giá mía thấp dẫn đến diện tích mía năm 2014 đã giảm 4.100 ha Diện tích mía nguyên liệu được ký hợp đồng đầu tư tiêu thụ sản ph m với các đơn vị sản xuất chế biến và kinh doanh đường vụ ép vừa qua đạt 255.891 ha, giảm 10.943 ha so với vụ

ép trước

Định hướng đến năm 2015 sẽ phát triển ổn định diện tích mía cả nước 300 nghìn ha, đưa năng suất bình quân lên 65 tấn/ha, sản lượng mía nguyên liệu 17,2 triệu tấn; sản lượng đường 1,75 triệu tấn, đáp ứng đủ nguyên liệu trong nước và có thể dư thừa để xuất kh u Để duy trì và thúc đ y tăng sản lượng mía, từ nhiều năm nay, Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã xác định được 4 nhân tố quan trọng: giống mía, phòng trừ sâu bệnh, tưới tiêu, cơ giới hoá canh tác, trong đó giống mía được đ t lên hàng đầu

Việc ứng dụng công nghệ tế bào trong chọn tạo và nhân giống đã được áp dụng rộng rãi trên quy mô toàn cầu từ nhiều năm nay do các ưu việt của công nghệ này:

a Công nghệ tế bào nhân giống bảo đảm an toàn trong nhập nội giống không mang theo nguồn bệnh

Nhiều giống mía nhập nội đã bị nhiễm các bệnh nấm, vi khu n, virus, trứng các loài sâu thậm chí chưa hề có ở nước ta theo ngọn giống, dẫn đến thoái hoá giống, giảm năng suất và tăng chi phí thuốc phòng trừ sâu bệnh Do vậy, việc nhập nội giống dứt khoát phải qua kiểm dịch và ch n đoán bệnh để loại trừ khả năng đưa các bệnh mới về nước Nhập nội thông qua giống nuôi cấy mô sạch bệnh là biện pháp an toàn trong cung cấp giống sạch bệnh

b Công nghệ tế bào làm sạch bệnh, phục tráng, trẻ hoá, tăng năng suất mía một cách đáng kể Giống qua cấy mô có năng suất tăng lên 10 - 30 % so với giống trồng bằng ngọn chưa qua cấy mô kinh nghiệm của Trung quốc, Ấn độ, Đài loan, Israel, Pháp Giống mía mới nhân bằng cấy mô sạch bệnh dịch được coi là vật liệu thiết yếu trong hệ thống giống của công nghiệp mía đường ở nhiều nước trên thế giới Nhiều nước và vùng lãnh thổ như Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Israel, Pháp, Australia đều sử dụng công nghệ nuôi cấy mô như một mắt xích ổn định, an toàn trong cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hoá học, tăng năng suất và giảm chi phí sản xuất

Do vậy, việc ch n đoán bệnh và nghiên cứu nhân nhanh các giống mía mới bằng phương pháp nuôi cấy mô phục vụ cho sản xuất mía đường ở Việt Nam là một

đòi hỏi hết sức bức bách của sản xuất Chính vì thế tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu quy trình nhân nhanh một số giống mía mới bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào”

Đề tài đã góp phần xây dựng phương pháp ch n đoán 2 bệnh dịch nguy hiểm ở mía bệnh chồi cỏ mía và bệnh trắng lá mía ; đồng thời tham gia xây dựng quy trình nhân nhanh và phục tráng 4 giống mía ưu tú cho sản xuất

2 Mục tiêu

Thông qua các quy trình ch n đoán bệnh dịch và nhân nhanh 4 giống mía sạch bệnh, chất lượng cao, cung cấp giống an toàn cho các vùng trồng mía nguyên liệu trọng điểm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

3.1 Ý nghĩa khoa học:

Đề tài đã góp phần xây dựng quy trình kiểm tra 2 bệnh dịch bệnh chồi cỏ mía

và bệnh trắng lá mía Các chủng bệnh chồi cỏ và trắng lá mía do chúng tôi phát hiện ở Nghệ An chồi cỏ và Tây Ninh Trắng lá có trình tự giống với các chủng của Thái Lan và khác biệt với các chủng đã được các tác giả khác phát hiện trong nước Đề tài

góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật phục tráng, nhân nhanh 4 giống mía sạch bệnh bằng Công nghệ nuôi cấy mô

Kết quả nghiên cứu có thể làm tài liệu tham khảo có giá trị cho việc giảng dạy

và nghiên cứu khoa học về bệnh Phytoplasmas ở mía và các phương pháp phục tráng, nhân giống mía và nhập nội giống mía mới

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm sinh học, phân loại và di truyền học của cây mía Saccharum

officinarum liên quan đến quá trình nhân giống

1.1.1 Nguồn gốc

Trong tác ph m “Nguồn gốc của cây trồng” De Camdelle viết: “Cây mía được trồng đầu tiên ở vùng Đông Nam Á, rồi từ đó qua châu Phi và châu Mỹ” (de Candolle

A (1884) Theo Sharpe and Peter 1998 , mía là cây bản địa ở vùng nhiệt đới Đông

Nam Á và Nam Á Các loài mía khác nhau có thể đã phát sinh ở các vùng khác nhau, Saccharum barberi có nguồn gốc ở Ấn Độ, loài S edule and S officinarum ở New

Guinea [59] Theo "Giáo trình cây mía" của Vụ Đào tạo Bộ Giáo dục Cuba 1963 cho biết một tác ph m của Trung Quốc thế kỷ II trước công nguyên Dr Bretschneider và một tác ph m Trung Quôc khác thế kỷ IV mô tả cây mía như sau: "Cây Kan-che (kan

là ngọt, che là tre; Kan-che là cây tre ngọt sinh trưởng ở Cochinchina vùng Nam Bộ Việt Nam có đường kính lớn vài pul 1 pul = 2,5 cm , trông giống cây tre và rất ngọt Nước lấy ra từ thân cây đem phơi nắng sau vài ba ngày sẽ chuyển thành đường" Tác giả Lý Văn Ni Đài đường thông tin ngày 2/8/1976 viết: "Cây mía và nghề chế biến đường cổ xưa ở Trung Quốc đã được du nhập từ Giao Chỉ Việt Nam " Theo tác giả Trịnh Khương Đề tài 18B.02.05, 1991 , cây mía và đường thủ công của ta đã từng được sử dụng làm cống ph m cho các triều đình phong kiến phương Bắc từ năm 206 trước công nguyên thời Hán Cao Đế và cũng là m t hàng khuyến khích xuất kh u được miễn thuế của triều đình các chúa Nguyễn sau này

1.1.2 Phân loại

Các loài mía thuộc ngành thực vật hạt kín Magnoliophyta , lớp một lá mầm Monocotyledneae , họ Gramineae, chi Saccharum, tên khoa học thường gọi cây mía

là Saccharum officinarum Linn

Theo Brandes (1958)[21], chi Saccharum bao gồm 6 loài chính:

- Saccharum officinarum phân bố rộng rãi ở khắp các vùng trồng mía trên thế giới

- S sinense chủ yếu trồng ở Trung Quốc

- S.barberi được trồng ở Bắc Ấn Độ S edule trồng ở Tân Ghinê và Melaneum

- Hai loài hoang dại là: S robustum và S spontaneum

Các giống mía hiện nay đều là con lai phức tạp với những đ c tính tổng hợp từ các loài mía trồng và mía dại khác nhau dưới đây:

- S officinarum

- S barberi - mía Ấn Độ

- S sinense - mía Trung Quốc

Hai loài mía dại:

- S spontaneum

- S robustum

Các gen tích luỹ đường có nguồn gốc từ S officinarum, S Barbari và S Sinense Loài dại S spontaneum tham gia các tổ hợp lai với các gen chống chịu bệnh

và điều kiện môi trường khắc nghiệt, gen tiềm năng năng suất cao với sinh khối lớn

1.1.3 Đặc điểm di truyền nhiễm sắc thể ở mía và quá trình nhân giống

Mía là cây công nghiệp có số lượng nhiễm sắc thể cũng như sự biến động di truyền nhiễm sắc thể rất lớn Nghiên cứu tế bào cho thấy kích thước nhiễm sắc thể ở mía thường nhỏ, nhưng số lượng nhiễm sắc thể rất lớn và rất biến động, dễ thay đổi Theo Bremer[24-25], tất cả những loài mía đều là thể đa bội polyploide Ông chỉ ra

rằng bộ nhiễm sắc thể của S.officinarum là 2n = 80, các giá trị khác của bộ nhiễm sắc thể có được là do lai tạo giữa các giống của S.officinarum với những giống của các

loài mía khác nhau

Bremer đưa ra giả thiết rằng có thể có 3 loại genom cơ bản ở mía x=8, x=6 và

x=10 Hầu hết ở các loài Saccharum, các giống và các dòng mía hiện nay đều là các

dạng đa bội thể và lệch bội thể của số lượng nhiễm sắc thể cơ bản này Ví dụ 2n=16x=128,v.v Nói chung ở mía có sự biến dị rất lớn về số lượng nhiễm sắc thể, thấp nhất là 2n=40

Sự biến động số lượng nhiễm sắc thể ở mía thường do ba nguyên nhân

1 Do lai giữa các loài

2 Do một số dòng có tần số biến dị số lượng nhiễm sắc thể lớn trong quá trình phân bào giảm nhiễm

3 Do biến dị tế bào soma xảy ra trong quá trình nhân giống vô tính ở mía [38-39]

Các loại mía trồng và mía dại nói chung có 2 khả năng nhân giống: nhân giống hữu tính bằng hạt và nhân vô tính, các đ c tính nhân giống này ở mía có liên quan mật thiết với di truyền nhiễm sắc thể Nhân giống hữu tính cho phép lai chéo giữa các loài, tạo ra con lai, nhân vô tính, trong đó có nhân giống bằng cấy mô bảo tồn các đ c tính sau lai Phương pháp nhân giống phụ thuộc rất nhiều vào đ c tính của hệ gen Các giống

có số lượng nhiễm sắc thể lớn, lẻ và có mức bội thể lẻ như cây mía thường phải duy trì bằng phương pháp nhân giống vô tính do những rối loạn trong phân bào giảm nhiễm

1.1.4 Vấn đề sâu bệnh ở mía

Theo thông báo của FAO gần đây 1993 hàng năm thiệt hại do sâu bệnh gây ra với cây mía khá lớn, có khi tới 45% sản lượng Theo kết quả điều tra của ngành mía đường cho thấy: chỉ riêng sâu bệnh hại mía đã làm giảm sản lượng đến 20%

Mía bị nhiễm nhiều bệnh hại khác nhau, gây ra bởi khoảng 100 loài nấm bệnh,

10 loài vi khu n, 10 loài virus và khoảng 50 loài tuyến trùng khác nhau trên toàn thế giới Các loài virus hại mía chủ yếu là virus mía lùn Sugarcane dwarf virus), Virus Sọc Trắng Chlorotic streak virus , Virus gây bệnh Fiji Sugarcane Fiji disease virus), Bệnh Khảm mía Sugarcane mosaic virus , Virus Sọc Ngô Maize streak virus, chủng gây bệnh ở mía Các bệnh tương tự virus do Phytoplasma gây ra gồm: Bệnh Chồi Cỏ Mía (Sugarcane Grassy Shoot Phytoplasma ; Bệnh Bạc lá mía Leaf Chlorosis ; Bệnh trắng lá (White leaf disease - WLD); bệnh Vàng lá mía (Sugarcane yellow leaf phytoplasma - SCYLP) (Ajay et al., 2012; )[14], [17], [44-45]; Bệnh Bật mầm sớm Early Bud Sprouting , Bệnh Lùn đốt RSD- Ratoon stunting disease) do clavibacter xyli subsp xyli (Cxx) gây ra[58], [64]

Dựa vào tác nhân gây bệnh có thể chia làm 5 loại chính như sau:

Các loại bệnh do virus và tác nhân tương tự virus gây ra rất nguy hiểm, chúng lây lan nhanh, bệnh truyền theo cây giống nhân vô tính từ thế hệ này sang thế hệ khác Bệnh virus và tương tự virus là nguyên nhân chủ yếu gây thoái hóa giống và là bệnh dịch khó kiểm soát nhất ở mía [35], [64], [91] Bệnh Chồi cỏ mía Sugarcane Grassy Shoot Disease -SCGS là một trong các bệnh nguy hại nhất ở mía, mức thiệt hại từ 5 đến 20% năng suất mía trồng năm đầu và sẽ tăng rất nhanh ở năm sau ratoon crops Bệnh SCGS đã gây thiệt hại 100 % sản lượng ở một số vùng Đông Nam Á và

Tóm lai, đối với mía là cây sinh sản vô tính, các bệnh truyền nhiễm có thể lây lan

dễ dàng theo ngọn, nhất là bệnh do virus Do vậy, biện pháp nhân giống bằng cấy mô cần được áp dụng phổ biến để loại trừ nhiều bệnh nguy hiểm ở mía và bảo quản nguồn gen khỏi lây bệnh bởi các vectơ truyền bệnh trong tự nhiên

1.2 Vai trò của giống mía và cơ cấu giống đối với sản xuất

Theo cam kết mở cửa trong ASEAN, đến năm 2018, Việt Nam sẽ phải hoàn toàn xóa bỏ hạn ngạch thuế quan từ ASEAN, và thuế nhập kh u sẽ giảm từ 80% xuống còn 5% Khi đó, đường nhập kh u Thái Lan sẽ cạnh tranh và có ảnh hưởng lớn tới thị trường đường trong nước Theo Cục trồng trọt, Bộ NNPTNT, giá mía nguyên

liệu chiếm từ 70-80% giá thành sản xuất đường nhưng giá mua mía nguyên liệu của Việt Nam thường đắt hơn Thái Lan từ 200.000 đến 300.000 đồng/tấn

Trong sản xuất mía, giống mía giữ một vai trò hết sức quan trọng, là biện pháp hàng đầu trong hệ thống kỹ thuật thâm canh tăng năng suất Một giống mía tốt thể hiện

ở năng suất cây và hàm lượng đường cao, chống chịu những điều kiện bất lợi của tự nhiên sâu, bệnh, khô hạn, ngập úng Do tập quán nhân giống vô tính bằng ngọn, dễ truyền bệnh từ thế hệ này sang thế hệ khác, một vài giống mía tốt qua quá trình canh tác lâu dài đã bị thoái hoá và giảm năng suất Trong khi năng suất mía ở các nước đạt rất cao Nhiều giống mía cho năng suất trung bình trên 100 tấn/ ha trên quy mô lớn, năng suất cao có thể đạt 300 tấn/ha; năng suất tiềm năng lên đến 400 tấn/ha[81]

Các giống mía ROC của Đài Loan, các giống Quế đường của Trung Quốc, các giống H62-4671, H50-7209 của Hawai, và các giống K84-69, K84-200, K82-83, K88-92 của Thái Lan là những giống mới có năng suất và hàm lượng đường cao, thích ứng rộng, hơn hẳn so với hầu hết các giống Việt Nam

Do vậy, việc nhập và chọn lọc các giống mía mới từ nước ngoài và áp dụng các biện pháp nhân giống nhanh, an toàn sâu bệnh là cấp bách đối với sản xuất Công tác giống mía bao gồm:

- Chọn và nhân nhanh những bộ giống mía thích hợp cho các vùng sinh thái khác nhau, ví dụ, chọn giống chịu hạn cho vùng miền Đông Nam Bộ, chịu úng phèn cho vùng Tây Nam Bộ, chọn giống chịu thâm canh cho các vùng đất tốt

- Chọn cơ cấu giống mía phù hợp: Đối với từng vùng sản xuất bao giờ cũng cần những nhóm giống: chín sớm, chín trung bình, chín muộn và cơ cấu giống thích ứng theo từng thời vụ

- Xây dựng hệ thống nhân giống sạch bệnh dựa trên công nghệ chân đoán bệnh và công nghệ nuôi cấy mô tế bào

1.3 Tình hình sản xuất mía đường trên thế giới và nước ta

1.3.1.Tình hình sản xuất mía đường trên thế giới

Sản lượng mía toàn cầu niên vụ 2013- 2014 đạt 1.877 triệu tấn Brazil dẫn đầu

thế giới trong sản xuất mía đường với sản lượng năm 2013 đạt 739,267 triệu tấn Ấn

Độ là nước sản xuất lớn thứ hai với 341,2 triệu tấn, Trung Quốc sản xuất lớn thứ ba với 125,5 triệu tấn Năng suất mía trung bình trên toàn thế giới trong năm 2013 là 70,77 tấn/ ha Năng suất mía trung bình ở Úc là khoảng 92 tấn/ha, ở Brazil là 79 tấn/

ha Trong điều kiện thời tiết và đất đai thích hợp, bằng sử dụng công nghệ mới, năng suất lên đến 150 tấn/ha ở quy mô thương mại Peru được xem là quốc gia trồng mía hiệu quả nhất trên thế giới đã với năng suất mía bình quân toàn quốc 133,71 tấn/ ha

[FAO, 2015][22]

Bảng 1.1 Mười quốc gia sản xuất mía hàng đầu thế giới (FAO, 2015)

Quốc gia Sản lượng Nghìn tấn

1.3.2.Tình hình sản xuất mía đường trong nước

+ Sản xuất mía đường tại Việt Nam

Tại Hội nghị tổng kết sản xuất mía đường niên vụ năm 2015 – 2016 Theo báo cáo của cục trồng trọt - Bộ Nông và phát triển Nông thôn về “kết quả sản mía đường, thực trạng và giải pháp phát triển thời gian tới”, diện tích mía cả nước năm 2015 đạt 284,367 nghìn ha, giảm gần 22 nghìn ha; năng suất bình quân đạt 64,4 tấn/ha giảm 0,9 tấn/ha so với năm trước Diện tích mía giảm tập trung chủ yếu ở vùng nguyên liệu tập trung của 25 tỉnh có nhà máy đường do giá mua mía của vụ ép trước 2014 – 2015 thấp nên một số diện tích mía năng suất thấp, không hiệu quả đã được chuyển sang trồng cây màu khác như sắn, ngô… còn ở Đồng bằng sông Cửu Long chuyển sang trồng cây ăn quả, lúa và nuôi trồng thủy sản có giá trị kinh tế cao hơn M c dù chịu ảnh hưởng của thiên tai nhưng do vào thời k thu hoạch nên nắng hạn và xâm m n những tháng đầu năm ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long và miền Trung, Tây nguyên ảnh hưởng không quá nhiều đến năng suất và sản lượng mía vụ ép 2015 – 2016[2]

Theo số liệu thống kê ước tính, diện tích mía năm 2015 của 25 tỉnh thành ở các vùng nguyên liệu tập trung cung cấp cho sản xuất đường như sau:

- Miền Bắc: diện tích đạt 88.608 ha giảm 3.292 ha; năng suất đạt 59,8 tấn/ha giảm 0,8 tấn/ha so với năm trước Do các tỉnh Thanh Hóa và Nghệ An tái cơ cấu ngành trồng trọt nên chủ trương giảm diện tích mía và tăng sản lượng bằng giải pháp tăng cường đầu tư thâm canh tăng năng suất nên diện tích mỗi tỉnh giảm gần 2 nghìn ha

- Miền Trung và Tây Nguyên: diện tích 111.135 ha giảm 5.465 ha; năng suất đạt 58 tấn/ha tương đương năm trước Diện tích mía giảm ở hầu hết các tỉnh thuộc khu vực Duyên hải Nam Trung bộ Đây là khu vực có điều kiện tự nhiên không thuận lợi, đất xấu, thường g p hạn nên năng suất mía thấp nhất trong cả nước

- Miền Nam: diện tích đạt 73.061 ha giảm 11.593 ha; năng suất bình quân đạt 82,2 tấn/ha tương đương năm trước Trong đó: Diện tích mía giảm mạnh ở Tây Ninh gần 4.000 ha do được thay thế bằng cây sắn và các cây màu khác Vùng Đồng bằng sông Cửu Long: giảm 6.730 ha; năng suất tương đương năm trước

Theo số liệu tổng hợp từ báo cáo của các đơn vị chế biến đường, thì sản lượng mía vụ ép vừa qua đạt 12.900.173 tấn mía, giảm 1.503.627 tấn so với vụ ép trước, trong khi năng suất giảm không đáng kể, như vậy sản lượng mía ép giảm chủ yếu do sụt giảm diện tích mía so với vụ ép trước

- Biến đổi khí hậu hạn, xâm m n đã ảnh hưởng lớn đến sản xuất nông nghiệp

nói chung cũng như kết quả sản xuất vụ mía 2015 - 2016 nói riêng Theo báo cáo tổng hợp từ các địa phương, diện tích mía bị ảnh hưởng l do hạn m n gây ra làm giảm năng suất trên cả nước là: 36.970 ha, trong đó: Bắc Trung bộ: 1.393 ha, Duyên hải Nam Trung bộ: 10.589 ha, Tây Nguyên: 8.016 ha, Đông Nam bộ: 1.432 ha, Đồng bằng sông Cửu Long: 2.538 ha Ảnh hưởng từ hạn, xâm m n tác động lớn đến diện tích mía trồng mới cho vụ 2016 – 2017 do bị chết phải trồng lại khoảng gần 1.000 ha; làm chậm thời

vụ xuống giống khoảng 3.000 ha ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long

- Biến đổi khí hậu dẫn đến thời tiết khí hậu diễn biến phức tạp, bất thường, rét kéo dài ở phía Bắc; hạn và xâm m n ở các tỉnh phía Nam đã giảm năng suất mía vụ

2015 – 2016 và ảnh hưởng rất lớn đến trồng mới và khả năng sinh trưởng phát triển của vụ mía 2016 – 2017

- Hầu hết diện tích mía trồng trên đất đồi, bãi không được tưới bổ sung khi

g p nắng hạn trong mùa khô thường vào giai đoạn nảy mầm, đẻ nhánh, vươn lóng là những giai đoạn rất cần nước Thiếu nước tưới là nguyên nhân chủ yếu hạn chế năng suất mía M c dù vậy, nhưng thực tế sản xuất cho thấy tổ chức tưới cho mía trồng trên đồi bãi trong điều kiện canh tác của Việt Nam hiện nay rất khó vì:

+ Thiếu cơ sở thủy lợi hạ tầng, nguồn nước; kinh phí đầu tư để xây dựng hệ thống thủy lợi quá lớn, vượt ngoài khả năng của ngành đường cũng như người trồng mía

- Năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế từ trồng mía thấp M c dù năng

suất mía của nước ta hàng năm vẫn tăng nhưng tốc độ rất chậm Đến nay năng suất bình quân đạt 64,4 tấn/ha chỉ bằng 90% năng suất mía bình quân của thế giới và năng suất đường của chúng ta còn thấp, chỉ đạt hơn 5 tấn/ha trong khi đó thế giới đạt khoảng 6,8 tấn/ha Hiện tại người trồng mía có thu nhập không cao với lãi suất

khoảng 20 triệu đồng/ha thì khó đảm bảo tính cạnh tranh trước các cây trồng khác

1.3.3 Những nguyên nhân, tồn tại của ngành mía đường hiện nay

Trong bối cảnh chung của nền kinh tế cả nước g p nhiều khó khăn: tốc độ tăng trưởng GDP thấp, lãi suất vốn vay còn ở mức cao, sức tiêu thụ nội địa giảm…, ngành mía đường còn g p thêm khó khăn

+ Việc nghiên cứu, chuyển giao giống mía mới, chất lượng tốt vào sản xuất còn chậm; năng suất, chất lượng mía vẫn còn thấp, tổn thất sau thu hoạch lớn

+ Nhiều nhà máy tổ chức thu hoạch và vận chuyển chưa tốt, mía thu hoạch sau nhiều ngày mới được đưa về nhà máy nên tổn thất sau thu hoạch lớn Một số vùng sản xuất mía một vụ lại thu hoạch sớm nên hiệu quả sản xuất thấp

1.3.4 Tình hình hình sâu bệnh hại chính

Hiện cây mía đang phải đối m t với nhiều loại dịch hại trong đó có bệnh gây ra

do phytoplasma Hai bệnh có tác nhân phytoplasma gây ra là bệnh chồi cỏ Sugarcane Grassy Shoot, SCGS và bệnh trắng lá Sugarcane White Leaf, SCWL đã và đang gây thiệt hại lớn cho bà con nông dân trồng mía ở các vùng Nghệ An bệnh chồi cỏ và Tây Ninh bệnh trắng lá Hai bệnh này có thể làm giảm tới 100% năng suất mía chế biến gây thiệt hại lớn về kinh tế và tăng nguy cơ thiếu hụt nguyên liệu cho các nhà máy đường do giảm năng suất và do bà con nông dân chuyển đổi diện tích mía sang trồng cây khác Ở Nghệ An bệnh chồi cỏ được công bố chính thức vào năm 2006 Từ năm 2007 đến nay, diện tích mía ở Nghệ An có chiều hướng giảm dần; nếu năm 2007 toàn tỉnh có 29.753 ha mía thì đến năm 2012 chỉ còn trên 25.000 ha Nguyên nhân hết sức quan trọng làm giảm diện tích là do dịch bệnh chồi cỏ đã làm giảm năng suất trầm trọng; nếu năm 2006, năng suất mía bình quân đạt 58,816 tấn/ha thì năm 2010, con số

Theo thông báo số 10/TBSB-BVTV-TV ngày 07/03/2014 của Cục bảo vệ thực vật thì diện tích mía nhiễm bệnh chồi cỏ đã lên tới 6.404,7 ha so với cùng k năm trước diện tích nhiễm tăng 1.424,5 ha , diện tích nhiễm n ng là 2.060,2 ha, phòng trừ 637,5 ha Như vậy, m c dù từ năm 2008 tỉnh Nghệ An đã huy động tổng lực các ngành tham gia, các nhà khoa học, chuyên gia nước ngoài chữa trị bệnh này nhưng vẫn chưa mang lại hiệu quả và diện tích mía nhiễm bệnh ngày càng tăng theo từng năm Hiện theo các nhà khoa học thì chưa phát hiện được vector truyền bệnh chồi cỏ và do đó việc lây lan bệnh chủ yếu do tập quán canh tác của bà con nông dân đã vô tình dùng hom mía bị bệnh để trồng mới

Để phòng chống sự lây lan bệnh chồi cỏ mía cần phải áp dụng kết hợp các biện pháp như: 1 Kiểm soát sự luân chuyển mẫu giống từ các vùng có dịch; 2 Tiêu hủy triệt để bằng cách đào tận gốc rễ cây mía nhiễm bệnh và đốt bỏ; 3 cày xới kỹ và rắc vôi bột xử lý diện tích đất có cây nhiễm bệnh; 4 Trồng luân canh các giống cây khác 2-3 vụ trước khi trồng lại mía; 5 Sử dụng hom giống hoàn toàn sạch bệnh và/ho c các giống mía có khả năng kháng/chống chịu bệnh chồi cỏ để trồng mới Tuy nhiên việc cung cấp hom giống hoàn toàn sạch bệnh theo các biện pháp nhân giống truyền thống đã và đang g p rất nhiều trở ngại về số lượng và về khả năng đánh giá và kiểm soát bệnh trên toàn bộ hom giống được sử dụng Chính vì thế nhu cầu về giống và hom giống mía chất lượng cao và hoàn toàn sạch bệnh dành cho việc tái canh cây mía ở các vùng bị dịch bệnh phytoplasma ngày càng trở nên bức thiết Trước tình hình đó Viện

Di truyền Nông nghiệp đã chủ trì thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình sản xuất giống mía sạch bệnh theo phương thức công nghiệp bằng công nghệ

tế bào” nhằm cung cấp cây giống mía chất lượng cao và hoàn toàn sạch bệnh ở quy mô công nghiệp cho các vùng trồng mía trọng điểm như Thanh Hóa, Nghệ An, Tây Ninh… góp phần quan trọng trong công tác phòng bệnh và hạn chế lây lan dịch bệnh gây ra do phytoplasma trên các diện tích mía tái canh Để sàng lọc nguồn vật liệu

khởi đầu sạch bệnh phytoplasma cho nhân giống mía in vitro chúng tôi đã sử dụng

phương pháp nested PCR PCR lồng để đánh giá các mẫu giống đồng thời đánh giá các mẫu bệnh thu thập được từ trung tâm vùng dịch chồi cỏ mía là Tam Hợp, Qu Hợp, Nghệ An

1.4 Những vấn đề đại cương về công nghệ cấy mô mía

1.4.1 Các phương pháp tạo giống sạch bệnh cơ bản dựa trên kỹ thuật cấy mô

Như đã phân tích ở trên, Limmasets và Cornuet năm 1949 cho biết các hạt virus phân bố không đều trên cây ký chủ và mật độ của chúng giảm dần từ dưới lên đến chồi đỉnh và có thể biến mất ở chóp sinh trưởng ho c chồi đỉnh Từ đó đã hình thành 3 hướng tạo giống sạch bệnh cơ bản dựa trên kỹ thuật cấy mô:

1 Nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng

2 Vi ghép

3 Xử lý nhiệt loại trừ bệnh virus kết hợp với cấy mô

1.4.2 Công nghệ tế bào hiệu quả cao trong phục tráng giống, tạo giống sạch bệnh và nhân giống nhanh

Công nghệ tế bào vi nhân giống được xem là phương pháp hiệu quả nhất để làm sạch bệnh, làm trẻ hóa, phục tráng và tăng năng suất giống, để nhân nhanh trên quy mô lớn đối với các giống mới tạo được, rút ngắn quá trình chọn giống và đưa giống mới vào sản xuất Tính ưu việt của công nghệ này đã được báo cáo tại nhiều công bố khoa học trong và ngoài[30], [36], [40-41], [49] Dưới đây là mô tả một số

các công nghệ cơ bản:

1.4.2.1 Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh

Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh đã giúp loại trừ các bệnh virus khác nhau khỏi vật liệu nhân giống và tạo ra các giống sạch bệnh ở một loạt cây trồng, chủ yếu là cây sinh sản qua đường nhân vô tính như khoai tây, khoai lang, sắn, tỏi, mía, cây ăn quả có múi, chuối, nho, mơ, mận, các cây hoa như cúc, c m chướng, v.v Phương pháp này cho phép loại trừ hầu hết các bệnh virus, viroid và các tác nhân gây bệnh tương tự

virus (virus - like pathogen)

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương pháp cấy mô được ứng dụng rộng rãi nhất trong sản xuất nông nghiệp Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm:

- Nhân nhanh hàng loạt, đồng nhất, số lượng lớn cây giống từ cây mẹ ban đầu

- Loại trừ bệnh virus

- Bảo quản quỹ gen in vitro

- Sử dụng trong chuyển gen

Limmasets và Cornuet 1949 đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng[48] Phát hiện đó đã là

cơ sở cho việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô chồi đỉnh ho c đỉnh sinh trưởng nhằm tạo vật liệu nhân giống sạch bệnh Trong thực tiễn, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được dùng phổ biến để tạo cây sạch bệnh Kích thước mẫu nuôi cấy chồi đỉnh phục thuộc vào loài thực vật và mục đích nghiên cứu [32], [48] Chóp của đỉnh sinh trưởng được coi là sạch bệnh virus Mẫu mô nuôi cấy càng nhỏ bao nhiêu và gần đỉnh sinh trưởng bao nhiêu thì khả năng sạch bệnh càng lớn bấy nhiêu Trong một số trường hợp đã thấy có tương quan thuận giữa kích thước mẫu nuôi với tỷ lệ cây tái sinh sạch bệnh [27] Nhưng có một số ngoại lệ, khả năng loại trừ virus khó khăn và không phụ thuộc vào kích thước mẫu Do vậy, phối hợp kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng với các yếu tố kìm hãm virus khác như hoá chất, nhiệt độ đã giúp cho việc loại trừ bệnh virus, phytoplasma và tạo giống sạch bệnh ở một số cây trồng [26]

- Các loại nấm gây bệnh ở mía như bệnh Than do nấm Ustilago scitaminea,

bệnh thối đỏ, do nấm Colletotrichum falcatum và các loại vi khu n gây bệnh như

Clavibacter xyli subsp.xyli, Xanthomonas albilineans có thể loại trừ dễ dàng bằng xử

lý đốt mía có chồi ngủ bằng nước nóng[29], [65] Nhưng để loại trừ các bệnh do virus

ở mía như bệnh virus khảm lá mía SCMV - Sugarcane Mosaic Potyvirus , bệnh Fiji, bệnh sọc lá Maize streak geminivirus người ta phải dùng biện pháp nuôi cấy mô phân sinh ho c mô sẹo, ho c kết hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy mô phân sinh [11], [34], [37], [89]

1.4.2.2 Phương pháp nuôi cấy mô lá non ở chồi đỉnh

Phương pháp tái sinh cây mía trực tiếp từ các tế bào của m u phiến lá non ở chồi đỉnh nuôi cấy sau 1-2 tuần in vitro, không qua giai đoạn hình thành mô sẹo, đã được sử dụng rộng rãi để nhân nhanh số lượng lớn cây mía giống sạch bệnh cho công nghiệp mía đường ở các bang Florida và Louisiana Mỹ Vật liệu sạch bệnh cho nhân

nhanh giống mía do Trạm kiểm dịch thực vật Beltsville thuộc Bộ Nông nghiệp Mỹ cung cấp [82]

1.4.2.3 Phương pháp nhân giống mía thông qua nuôi cấy mô sẹo

Tế bào mô sẹo phôi hoá Embryogenic callus đã được tạo ra bằng nuôi cấy

m u lá non sát đỉnh sinh trưởng Mô sẹo có khả năng phát sinh hình thái được chia làm

2 loại: Organogenic mô sẹo mô sẹo phát sinh cơ quan và Embryogenic mô sẹo phôi hoá Cây tái sinh từ mô sẹo phôi hóa có độ đồng nhất về di truyền cao hơn so với cây

từ mô sẹo organogenic Số cây thu được ban đầu nhiều hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh

[38], [93-94] Quy trình tạo chồi và rễ mía từ mô sẹo In vitro đã đƣợc rất nhiều

tác giả nghiên cứu [12], [53] Đ c biệt, các quy trình nhân nhanh chồi từ mô sẹo, quy

trình kéo dài chồi và quy trình ra rễ trong dịch lỏng ở rất nhiều các giống mía mới đã được các nhà khoa học Viện Di truyền Nông nghiệp nghiên cứu phát triển và đã được

công nhận là TBKT [3-6]

Sauvaire và Galzy [71] đã xây dựng quy trình nhân nhanh chồi mía in vitro và

quy trình sau đó đã được áp dụng vào nhân giống quy mô công nghiệp ở nhiều nước

Đến nay, công nghệ nhân giống mía bằng nuôi cấy mô đã được triển khai trên phạm vi toàn cầu với những ưu việt căn bản sau đây:

1 Nhân giống nhanh theo cấp số nhân hệ số nhân chồi đạt 4-5 lần mỗi tháng,

có thể nhân vài trăm nghìn cây con sau 7 tháng [56]

2 Nhân giống sạch mọi loại bệnh dịch nguy hiểm virus và phytoplasmas

3 Làm trẻ hóa các giống cũ phục tráng [79]

4 Nhanh chóng đưa các giống mới chọn tạo vào sản xuất lớn, đại trà [75]

5 Bảo đảm đúng giống với độ thuần đồng ruộng cao

4 Vận chuyển dễ dàng đến vùng trồng

7 Bảo quản nguồn gen Germplasm storage và các giống ưu việt an toàn

8 Năng suất mía và hàm lượng đường cao hơn, chất lượng giống tốt có thể lưu gốc 3-5 năm [76-77], [92]

1.4.3 Các hướng nghiên cứu cải thiện công nghệ vi nhân giống thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô truyền thống dựa trên tái sinh cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm, bình tam giác ho c đĩa petri có nút kín, môi trường thạch cứng đã tỏ ra có nhiều hạn chế và không đủ đáp ứng các nhu cầu của sản xuất:

- Tốc độ sinh trưởng và hệ số nhân thấp do những hạn chế về dinh dưỡng, dưỡng khí, độ m và các yếu tố lý hoá học khác

- Quy mô nhân giống nhỏ và tốn kém nhân lực, kết quả giá thành cây con cao

Do vậy đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm tăng cải thiện điều kiện nuôi cấy, tăng nhanh đáng kể hệ số nhân và chất lượng cây giống, giảm giá thành cây con:

+ Tăng cường trao đổi không khí giữa bình nuôi và môi trường ngoài:

+ Tăng hàm lượng cac-bô-nic trong bình nuôi kết hợp với tối ưu hoá cường độ ánh sáng nhằm tăng cường độ quang hợp của cây in vitro

+ Giảm hàm lượng etylen và các chất độc khác Các chất này thường được tích luỹ trong bình nuôi kín dẫn đến ức chế sinh trưởng của tế bào và cây in vitro

+ Giảm hàm lượng oxy trong bình nuôi xuống khoảng 10%

+ Giảm độ m tương đối trong bình nuôi từ 95%-100% xuống khoảng 85-90% [80]

+ Tối ưu hoá cường độ và thời gian chiếu sáng, cũng như tần số ánh sáng

+ Sử dụng ánh sáng tự nhiên thay thế chiếu sáng nhân tạo nhằm giảm chi phí năng lượng

Chi phí chiếu sáng trong điều kiện nuôi cấy bằng khoảng 65% tổng tiêu thụ năng lượng của cơ sở cấy mô Dùng chiếu sáng tự nhiên có thể giảm chi phí điện năng đồng thời tăng hệ số nhân giống và chất lượng cây giống

1.4.4 Thành tựu nhân nhanh giống bằng cấy mô qui mô công nghiệp

1.4.4.1 Nhân giống nhanh bằng cấy mô rút ngắn thời gian chọn giống và nhanh chóng đưa các giống mới chọn tạo vào sản xuất lớn, đại trà

Mía là cây nhân giống vô tính, đòi hỏi ít nhất là 10-13 năm nghiên cứu tạo giống mới Vì hệ số nhân giống truyền thống chỉ đạt 1:6 đến 1:8 mỗi năm, nên việc

nhân giống mới ra sản xuất rất chậm, ứng dụng công nghệ cấy mô giúp nhân nhanh giống mới vào sản xuất ở hầu hết các nước trồng mía trên thế giới [36], [50], [68]

Theo Lal và Cs [40], nhân giống in vitro có thể tạo ra 75.600 chồi sau 5,5 tháng Hệ số

nhân trung bình = 4n Mỗi tháng tư 1 chồi cây ban đầu nhân được trung bình 4 cây; n

là số tháng nhân giống Bằng kỹ thuật cấy mô từ một mầm ban đầu sau 12 tháng có thể đạt 180.000 cây Phương pháp nhân giống bằng cấy mô phổ biến ở tất cả các bang trồng mía ở Ấn Độ Theo viện Vasantdada Sugar Institute VSI , Ấn Độ, 1 ha mía trồng 15.000 cây mía cấy mô có thể cung cấp đủ giống để trồng 25 ha mía cấp I, hệ số nhân giống là 1:25 Trong khi phương pháp nhân giống truyền thống hệ số nhân chỉ đạt 1:5 đến 1: 7 ho c cao là 1:10 Giá 1 cây mía cấy mô do viện bán ra trong nội bang

là 7,0 rubi, bán ra các bang khác là 8,0 rubi 7,0 Rubi tương đương với 2160 VND và

1 Rubi = 308,68 VND Họ khuyến cáo nên hạn chế tuổi cây ở vườn cấp I khoảng 9-10 tháng Cắt cây mía thành đốt, mỗi đốt 2 mắt bằng dao sắc tránh dập nát đốt mía Cây mía cấy mô cho năng suất cao hơn, sản lượng đường tăng khoảng 15% (Anita et al., 200) Nand và Ram cho biết giống mía từ vườn giống cấp I vườn từ cây cấy mô có khả năng n y mầm mạnh, năng suất cao và sản lượng đường cao (Nand and Ram, 1997) Gosal và Cs (1998) thông báo mía cấy mô giống Co83 cho sản lượng mía cây tăng 44.96% và đường tăng 22.9% so với đối chứng nhân bằng mầm (Gosal et al., 1998) Giống mía mới Quế đường 11 với hàm lượng đường cao đã được nhân nhanh bằng cấy mô, chỉ trong 4 năm giống này đã phủ kín 32.000 ha mía ở Quảng Tây, Trung Quốc Trong khi bằng phương pháp nhân giống truyền thống phải cần 10 năm

so với giống nhân bằng ngọn thông thường [62]

1.4.4.3 Nghiên cứu chuyển gen ở mía

Nuôi cấy mô sẹo ở các giống mía thương mại là điều kiện thiết yếu để nâng cao hiệu quả chuyển gen nhằm cải tạo giống mía [69] Nuôi cấy tế bào phôi hoá đã được

sử dụng rộng rãi trong chuyển gen Các nhà khoa học Trung Quốc đã tạo được giống mía kháng bệnh virus khảm lá mía bằng chuyển gen RNAi Các nhà khoa học Thái Lan đã tạo được giống mía kháng thuốc trừ sâu [54]

1.4.5 Bảo quản quỹ gen giống mía in vitro

1.4.5.1 Các trung tâm bảo quản quỹ gen

Mía sinh trưởng và phát triển ở nhiều vùng sinh thái nhiệt đới và cận nhiệt đới khác nhau đã tạo ra tập đoàn giống mía rất đa dạng và phong phú Chỉ tính riêng ở Tân

Ghi-nê đã tìm thấy hơn 1000 giống mía thuộc S.oficinarum [15] Theo Berding và

Roach [16], những tập đoàn giống mía quốc tế lớn đã được lưu giữ tại 3 Trung tâm:

- Tại Canal Point Mỹ : 3.237 mẫu giống

- Tại Miami: 1.787 mẫu giống

- Tại Viện chọn tạo giống mía Ấn độ, Cananore: 3.438 mẫu giống

Ngoài ra tập đoàn còn được lữu giữ ở nhiều nước khác như tại CIRAD Pháp lưu giữ 650 giống Cuba có tập đoàn mía 1400 giống [10] Sugar Experimental Station, Brisbane, Australia: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và lưu giữ 200 giống mía [83]

Tập đoàn quỹ gen in vitro bao gồm các giống thương mại Saccharum spp hybrids và các loài cơ bản thuộc nhóm mía, S officinarum spp, S robustum, S sinense, S barberi,

Ở nước ta tập đoàn mía có 477 giống, dòng được trồng tại Viện Nghiên Cứu Mía Đường Bến Cát, Bình Dương Với chủng loại giống, dòng mía tương đối phong phú, đa dạng

1.4.5.2 Bảo quản tập đoàn mía in vitro

Các phương pháp bảo vệ nguồn gen truyền thống có những nhược điểm:

- Các sinh vật phá hại và các tác nhân truyền bệnh, nhất là bệnh virus và các bệnh tương tự virus

- Biến động khí hậu bất thường

- Tác động môi trường của xã hội loài người và thảm hoạ tự nhiên

Việc bảo tồn nguồn gen cây mía đã được Viện Quỹ Gen Cây Trồng Quốc tế quan tâm từ những năm 1978 Bảo quản mía in vitro đã được nhiều Viện Nghiên cứu trên thế giới thực hiện Năm 1993, các viện phục hồi và bảo quản tập đoàn mía sạch bệnh bằng phương pháp in vitro đã được thiết lập ở Colombia và Pháp [23] Các ngân hàng gen này sử dụng 12 ống nghiệm cho một giống Mô nuôi cấy là những nguyên liệu sạch bệnh, các giống có thể gửi đi khắp thế giới dưới dạng cây trong ống nghiệm

an toàn sạch bệnh dịch và sẽ tiết kiệm so với phương pháp gửi bằng hom

Vấn đề an toàn trong bảo quản invitro: bảo quản in vitro trong điều kiện sinh trưởng chậm không tránh khỏi những nguy hại cho cây, trong quá trình bảo quản các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra sự xâm nhập của nấm và vi khu n vào mẫu cấy ở nhiệt

độ 18o

C

Bảo quản lạnh sâu bằng nitơ lỏng: là một trong các phương pháp đang được nghiên cứu để bảo quản vật liệu dài hạn Bảo quản lạnh sâu cũng đã được tiến hành với các cây con in vitro Kỹ thuật này được thử nghiệm với các giống mía khác nhau Chồi và cây con sau bảo quản đã được làm tan băng và tái sinh thành cây Sự ổn định

về di truyền của cây tái sinh sau khi bảo quản lạnh đã được đánh giá bằng các kỹ thuật khác nhau trong đó có kỹ thuật sinh học phân tử Tính an toàn của các phương pháp bảo quản giống mía đã được khẳng định với một số lưu ý, ví dụ bảo quản trong điều kiện sinh trưởng chậm thích hợp cho bảo quản ngắn hạn Khi cần bảo quản thời gian dài nên sử dụng các chồi đỉnh để bảo quản lạnh sâu nhằm tránh những biến dị không cần thiết [23]

1.5 Công nghệ nhân giống mía bằng cấy mô và vấn đề nguyên liệu của công nghiệp mía đường

Theo bộ NN&PTNT, hiện cả nước có khoảng 41 nhà máy đường, với công suất trung bình 1 nhà máy là 3.250 TMN, thấp hơn nhiều so với công suất trung bình của 1 nhà máy ở Thái Lan, Ấn Độ, Brazil là 7.000- 8.000 TMN Năng suất mía hiện tại của Việt Nam chỉ đạt 65 tấn mía/ha, so với năng suất mía trung bình Thế giới là 70 tấn

mía/ha Giá thành sản xuất cao do chưa khai thác được phụ ph m sau đường Tại Việt Nam hiện mới chỉ có 8 nhà máy đường có thể hòa lưới điện quốc gia, và chỉ có 3 nhà máy sản xuất ethanol từ mật rỉ Kinh nghiệm từ Brazil cho thấy, chỉ 35% sản lượng mía dùng để chế biến đường, phần còn lại dùng để sản xuất ethanol và điện sinh khối

Do chi phí sản xuất đường trong nước quá cao, bình quân giá thành sản xuất 1 kg đường của các nhà máy trong nước khoảng 10.000 đồng/kg, cao hơn khoảng 25% so với các nước khác

Các nhà máy đường đang sản xuất phân bố rộng ở cả 3 miền đất nước, khoảng cách giữa các nhà máy khá lớn trừ khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long Theo các chuyên gia trong ngành, quy mô nhà máy càng lớn thì hoạt động càng hiệu quả Tuy nhiên, các nhà máy đường không thể tự ý nâng quy mô và công suất nếu vùng trồng tại đó không có tiềm năng mở rộng tương ứng Do đó, việc cung cấp đủ nguyên liệu mía cho nhà máy và phát triển vùng trồng mía phù hợp với công suất thiết kế rất quan trọng.[7]

Vụ 2014-2015 diện tích trồng mía cả nước 305.000 ha, năng suất bình quân đạt 65,3 tấn/ha, sản lượng gần 20 triệu tấn Theo Cục Trồng trọt Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn , những năm gần đây giá đường và giá mía đều giảm Điển hình như

vụ ép 2014-2015, giá thu mua mía 10 chữ đường CCS tại ruộng chỉ từ 750.000 đồng đến 900.000 đồng/tấn, giảm so với vụ trước từ 100.000 đồng đến 150.000 đồng/tấn Các địa phương và doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh mía đường đã xây dựng nhiều chính sách hỗ trợ người trồng mía, nhưng do giá mía thấp dẫn đến diện tích mía năm

2014 đã giảm 4.100 ha[88] Diện tích mía nguyên liệu được ký hợp đồng đầu tư tiêu thụ sản ph m với các đơn vị sản xuất chế biến và kinh doanh đường vụ ép vừa qua đạt 255.891 ha, giảm 10.943 ha so với vụ ép trước.[8]

Diện tích mía của vùng nguyên liệu giảm như vậy thì việc nhân giống mới cho vùng nguyên liệu mía sẽ trở nên vô cùng quan trọng Vai trò của công nghệ cấy mô nhân giống mía được khái quát như sau:

- Tạo cơ cấu giống phù hợp cho từng vùng nguyên liệu nhanh nhất:

Do tốc độ xây dựng nhà máy đường nhanh nên chủng loại giống và cơ cấu giống thích ứng cho từng nhà máy ở từng vùng nguyên liệu chưa được nghiên cứu kỹ

Sau khi xác định được giống ưu việt và cơ cấu giống tối ưu cho từng vùng nguyên liệu, cần có công nghệ cấy mô nhân nhanh giống mới thay giống cũ

- Bảo đảm an toàn sinh học: Bắt đầu xây dựng mọi vùng nguyên liệu mía mới bằng giống cấy mô sạch bệnh dịch

Nhiều giống mía nhập nội ho c chọn lọc đã và sẽ nhiễm các bệnh nấm, vi khu n, virus, trứng các loài sâu theo ngọn giống thậm chí chưa hề có ở nước ta , dẫn đến thoái hoá giống, giảm năng suất và tăng chi phí thuốc phòng trừ sâu bệnh Nuôi cấy mô là biện pháp duy nhất an toàn trong cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hoá học Giúp cho việc nhập nội giống an toàn sinh học, có thể chỉ cần nhập một hom giống ban đầu như đã nhập nội giống K84-200

- Nuôi cấy mô làm trẻ hoá, sạch bệnh, tăng năng suất mía một cách đáng kể:

Kinh nghiệm của hầu hết các nước trồng mía đều cho thấy vai trò quan trọng của công nghệ cấy mô đối với nhân giống miá, giống qua cấy mô năng suất tăng lên 20-30% so với giống trồng bằng ngọn chưa qua cấy mô Kinh nghiệm của Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Israel, Pháp, Australia đều sử dụng công nghệ cấy mô như một mắt xích ổn định, hiệu quả kinh tế cao trong hệ thống giống của nhà máy

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các giống mía mới có năng suất và trữ lượng đường cao, gồm 4 giống chính là LS1, LS2 nhập từ Đài Loan, Quế đường QĐ93159 nhập từ Trung Quốc, giống My55-14 nhập nội từ Cu Ba, đã được thuần hóa lâu năm ở nước ta

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu nuôi cấy được lấy từ vườn ươm mía Viện Di Truyền Nông Nghiệp – Từ Liêm – Hà Nội và từ các vùng trồng mía Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An Vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh, chồi nách và đỉnh sinh trưởng của các giống mía

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp

Thời gian tiến hành: Từ tháng 08 /2014 đến tháng 6 /2016

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu chẩn đoán một số bệnh dịch hại mía bằng các kỹ thuật PCR phục vụ cho phát hiện bệnh và nguồn gen nhiễm bệnh (Bệnh chồi cỏ và bệnh trắng lá mía

Nội Dung 2: Ảnh hưởng của các phyto hooc nôm đến khả năng hình thành chồi của các giống mía LS1, LS2, QĐ93159 và MY55-14 từ nuôi cấy chồi đỉnh

Nội dung 3: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l

Kinetin lên quá trình hình thành chồi từ callus của các giống LS1, LS2, QĐ93159 và MY55-14

Nội dung4:Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của các giống

Nội dung 5: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình kéo dài chồi của các giống LS1, LS2, QĐ93159 và MY55-14

Nội dung 6: Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của các giống LS1, LS2, QĐ93159 và MY55-14

Nội dung 7: Ảnh hưởng của giá thể trồng cây sau cấy mô đến tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các công thức thí nghiệm được l p lại ít nhất ba lần Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, các đĩa peptri và bình nuôi được đ t trong phòng nuôi cây với điều kiện nhiệt độ duy trì ở 25±20C và cường độ ánh sáng là 2.400lux – 2600lux, thời gian chiếu sáng 8 h/ngày

2.3.1.1 Phương pháp sàng lọc cây mía nhiễm bệnh

+ Các giống đã được thu mẫu để ch n đoán gồm: My5514; ROC10; ROC23; VĐ00-236; VĐ55; LS1; LS2; QĐ02-467; SC2; SC3; Quảng Tây 60; KK3; KK6; QĐ93-159; QĐ94; Brazil 7515 (Br7515); Brazil 2 (Br2); Brazil 3280 (Br3280), LK92-11… Các mẫu giống mía thu thập từ các vùng trồng mía Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ

An và từ Trại Văn Giang Hưng Yên

+ Các mẫu mía nghi bị bệnh được thu thập ở vùng Tam Hợp, Qu Hợp, Nghệ

An có triệu chứng điển hình của bệnh chồi cỏ mía như cây chính còi cọc, gốc mọc nhiều chồi nhỏ có lá xanh nhạt và trên m t lá có vết tàn lốm đốm với mục đích làm đối chứng dương

+ Các giống mía chất lượng cao, sạch bệnh, được lưu giữ trong nhà lưới và trong ống nghiệm của Viện Di truyền Nông nghiệp đã được sử dụng làm đối chứng âm

+ Các mẫu giống cây khỏe, vượt trội từ các giống nghiên cứu cũng được thu thập để ch n đoán bệnh Từ đó, xác định các cá thể ưu tú hoàn toàn sạch bệnh ở các giống khác nhau để cho nhân giống

+ Các mẫu giống sau nuôi cấy mô ở vườn ươm cũng được ch n đoán để tránh khả năng lây nhiễm bệnh trong quá trình nuôi cấy và chăm sóc ở vườn ươm

Thu thập và bảo quản mẫu

Lá thứ tư tính từ ngọn được lấy làm mẫu kiểm tra bệnh ; dựa trên cơ sở một số nghiên cứu cho thấy lá thứ ba và lá thứ tư ở cây bị bệnh có chứa lượng virus cao nhất [85]

Lá thu thập về chưa sử dụng ngay được bảo quản trong túi giấy ho c túi nilon

có đục lỗ và để ở điều kiện -20o

C

Phương pháp tách chiết DNA tổng số:

Phương pháp tách chiết mẫu DNA tổng số gDNA được tiến hành tương tự như trong công bố của Vu và đồng tác giả 2013 có cải tiến cho thích hợp với mẫu mía Mẫu lá mía 1g được nghiền thành bột mịn trong N2 lỏng sau đó thêm trực tiếp

2 ml dung dịch Sol I NaCl 1 M + N-Lauroylsarcosine sodium Sarkosyl 2 % vào cối nghiền và dùng chày sứ đảo đều mẫu Hỗn hợp mẫu với dung dịch Sol I được chuyển vào ống ly tâm cỡ 1,5 ml ho c 2 ml sau đó ly tâm mẫu ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và chuyển 250 l dịch trong ở trên sang ống mới Thêm vào ống

mới 2 phần thể tích Extraction Buffer (Tris-Cl 100 mM, pH 8,0; EDTA 20 mM; NaCl

1,4 M; và CTAB 2 % Ủ ống ở 60oC trong bể ổn nhiệt trong 35 phút, đảo ống sau mỗi

5 phút sau đó thêm Chloroform:Isoamylalcohol 24:1 với tỷ lệ 1:1 750 l vào ống

và trộn đều bằng cách đảo ống Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15’ ở 4oC ho c nhiệt

độ phòng RT rồi chuyển dịch trong ở pha trên vào ống mới 600 l Thêm 1/30 thể tích CH3COONa 3 M, pH 5.2 20 l và 0,6 phần thể tích Isopropanol (360 µl) vào

ống, trộn đều bằng cách đảo ống Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu tủa gDNA Loại bỏ dịch và rửa tủa gDNA pellet bằng cách thêm vào ống 1 ml

ethanol 70 % rồi ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC có thể l p lại bước này 1-2 lần Loại bỏ ethanol và làm khô gDNA ở nhiệt độ phòng trong 20 phút Hòa tan DNA bằng 50 l đệm TE Tris-Cl 10 mM, pH 8,0 + EDTA 1 mM ho c nước cất 2 lần khử trùng Kiểm tra nồng độ và độ tinh khiết của gDNA thu được bằng máy đo mật độ quang (Nanodrop và điện di trên gel agarose 1%

* Ch n đoán bệnh chồi cỏ

Phương pháp PCR lồng:

Phương pháp PCR lồng được thực hiện dựa trên phương pháp của Gundersen

và Lee 1996 , c p mồi do chúng tôi tự thiết kế xem bảng 1 Các phản ứng PCR vòng

1 sử dụng 200ng gDNA làm khuôn và các phản ứng PCR lồng nested PCR, vòng 2

sử dụng 2 l dịch phản ứng PCR vòng 1 làm khuôn Taq DNA Polymerase D6677 và

Deoxynucleotide Mix D7295 được cung cấp từ hãng Sigma USA Chương trình gia nhiệt của máy PCR được đ t như bảng 2

Các c p mồi dùng trong nghiên cứu:

Tm ( o C)

Sản

ph m (bp)

Chương trình gia nhiệt của máy PCR:

Sản ph m PCR là đoạn nằm giữa c p mồi SCGSVN-Fwd2 và SCGSVN-Rev2 được giải trình tự và so sánh theo từng c p với các trình tự tương tự của phytoplasma trong cơ sở dữ liệu Genbank Kết quả so sánh trình tự được xuất ra file nex và cây phả

hệ được xây dựng nhờ phần mềm TreeGraph 2.7.1 St ver và M ller, 2010 theo phương pháp Neighbor Joining

* Chẩn đoán bệnh trắng lá

Các chủng phytoplasma gây bệnh trắng lá mía được xếp vào nhóm rice yellow dwarf RYD phytoplasma nhóm 16SrXI Do đó để phát hiện các chủng phytoplasma gây bệnh trắng lá trên các mẫu giống mía trong nghiên cứu chúng tôi đã thiết kế c p mồi SCWLVN-Fwd1/Rev1 kết hợp với c p mồi P1/P7 [20], [72]dùng cho phản ứng PCR lồng Bảng 1 Các phân tích in silico sử dụng phần mềm Clone Manager 6 http://www.scied.com cho thấy các c p mồi chúng tôi thiết kế có khả năng bắt c p với đa số trình tự gen mã hóa 16S rRNA của các chủng gây bệnh trắng lá mía bao gồm các chủng đang gây dịch bệnh ở Việt Nam được lưu giữ trong GenBank

Các phản ứng PCR vòng 1 sử dụng 200 ng gDNA làm khuôn và các phản ứng PCR lồng nested PCR, vòng 2 sử dụng 2 l dịch phản ứng PCR vòng 1 làm khuôn Taq DNA Polymerase D6677 và Deoxynucleotide Mix D7295 được cung cấp từ hãng Sigma USA Chương trình gia nhiệt của máy PCR được đ t như sau

( o C)

Sản

ph m (bp)

Rev1

TTGTAACAGCCATTGTATCAC 58

Chương trình gia nhiệt của máy PCR

2.3.1.2 Chọn mẫu và xử lý mẫu đưa vào nuôi cấy mô

Cây mía sau khi được ch n đoán là sạch bệnh Chọn những khóm mía to khoẻ không bị sâu bệnh, lấy ngọn ho c ch t những cây non có từ 2-4 lóng Cây mía còn non sức n y mầm và khả năng tái sinh cao, ít hoạt chất thứ cấp làm đen môi trường hơn so với ngọn già Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc bỏ tất cả phần bẹ lá già và các lá đã tiếp xúc với không khí và có màu lục, lau sạch bằng cồn etanol 700 Sau đó đưa ngọn vào buồng vô trùng, bóc bỏ lần lượt các lớp bẹ và lá non bên ngoài cho đến khi chỉ còn lại phần ngọn với lá non trắng nõn nằm sát chồi đỉnh

Sau đó tách lấy phần chồi nách, chồi đỉnh ho c lá non trắng nõn nằm sát đỉnh sinh trưởng làm vật liệu nuôi cấy Đối với cây mía, mắt mía non chồi ngủ và chồi đỉnh thường được bao bọc trong nhiều lớp bẹ lá, do vậy rất sạch Dựa vào những đ c tính cơ bản đó mà chúng tôi đưa mẫu vào ống nghiệm mà không sử dụng hoá chất khử trùng

Kích thước mẫu nuôi cấy như sau:

- Chồi nách: Đường kính 1,0 cm x 1,0 cm

- Chồi đỉnh: Bóc bỏ lá non, lấy chồi non đường kính 1,5cm x 1,5 cm

- Phiến lá non ở sát đỉnh sinh trưởng kích thước 1,0 cm x1,0 cm dùng tạo mô sẹo