Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi citrus ở việt nam

Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank Hình 3.10.. Cây phát sinh chủng loại xây dựn

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lâm Đại Nhân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Lê Trần Bình, PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tồi hoàn thành bản luận văn

Tồi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cồ trong Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chúc cán bộ, Phòng

Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời gian tôi học tập chương trình thạc sĩ

Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của Th.s Đặng Thị Hương, Tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học Nhân dịp này tồi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua

NỘI DUNG

MỤC LỤC

3

3.4.5 Xác định trình tự các đoạn A, F, p của CTV ở các mẫu CT, HG, 38 HN

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi

Bảng 1.2 Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)

Bảng 2.1 Thành phần môi trường LB đặc, lỏng

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tông hợp cDNA

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide

Bảng 2.7 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide

Bảng 3.1 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV

Bảng 3.2 Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn Agiữa CT,HG, HN và VL Bảng 3.3 Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn Fgiừa CT, HG, HN và VL Bảng 3.4 Hệ số tương đồng về trìnhtự nucleotide đoạn pgiữa CT, HG, HN và VL Hình 1.1 Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra Hình 1.2 Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza

Hình 1.3 (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển vi điện

tử âm bản nucleocapsid

Hình 3.1 Ket quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1%

DANH MỤC HÌNH

6

Hình 3.2 Ket quả điện di sản phấm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker lkb Hình 3.3 Ket quả điện di kiếm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb Hình 3.4 Sơ đồ cấu tạo vector pBT

Hình 3.5 Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37°c trên môi trường

Hình 3.8 Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG HN và

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen

A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank

Hình 3.10 Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN

và VL

Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank

Hình 3.12 Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn p giữa các mẫu CT, HG, HN

và VL

Hình 3.13 Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen

p của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid

ELISA Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked

immunosorbent assay)

of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ)

DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT

9

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh cùng họ

Rutaceae [45] CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại

cây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm ngon, được nhiều người ưa dùng Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến thức ăn, làm mứt, chế biến nước giải khát, làm hương liệu

Trên thế giới, sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7%, CCM được trồng nhiều ở các tỉnh: cần Thơ, Ben Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang [481

Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng cao chất lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza làm cho sản lượng cũng như

chất lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn lụi có tác nhân là virus Citrus Tristeza gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn quả có múi [10], [40], [25]

Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây ảnh hưởng tới năng suất và phấm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh Greening Tuy vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa dạng về hệ gen của virus này

Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc di

Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới đế có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi

- Góp thêm tư liệu khoa học cho việc xác định trình tự nucleotide toàn bộ hệ genome

của virus Citrus Tristeza ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di truyền của các

chủng virus được chính xác Bcn cạnh đó còn có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long

- Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long

- Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi dòng virus, xây dựng cây phân loại về sự đa dạng di truyền của 4 dòng virus nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi

CCM thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng ở vùng

nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45] CCM phát sinh từ vùng Đông Nam Châu Á, trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ biên giới Đông Bắc của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của Đảo Hải Nam Những loài này bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi, cam ngọt, cam chua [6]

Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu nhiệt đới

và Á nhiệt đới Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 35° Nam đến Bắc, những vùng thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 20° Nam hay Bắc của xích đạo Ớ Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam Riêng Đồng bằng sông Cửu Long, CCM hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp và cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi năm roi, bưởi da xanh, quýt tiều, quýt đường, cam mật,

cam dây, cam sành [6]

Cây ăn quả có múi là một loại cây ăn quả lâu năm, nhanh cho thu hoạch, một

số loài có thể cho thu hoạch quả vào năm thứ 2 sau khi trồng Ở nước ta, 1 ha cam quýt ở thời kỳ 8 tuối năng suất trung bình có thế đạt 16 tấn So về giá trị kinh tế 1 ha trồng cam cho thu nhập gấp 4 - 10 lần 1 ha trồng lúa

Trên thế giới sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7% [48]

Theo tác giả Trần Thượng Tuấn và cộng sự (1994) [6], quả cam quýt được

(Bảng 1.1; 1.2) Vị chua nhẹ và hơi đắng giúp dễ tiêu hoá, tuần hoàn của máu, vở giàu pectin được sử dụng làm mứt, kẹo, thuốc nam hay trích lấy tinh dầu, trái được chế biến thành nhiều sản phấm như: nước giải khát, sirô, rượu bổ

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi

Protein (%)

Hydrat cacbon (%)

Chất

xơ

(%)

Năng lượng (%)

Muối khoáng (mg/100g)

Tinh dầu được cất từ vở quả, lá và hoa được dùng trong công nghiệp thực phấm và công nghiệp mỹ phấm Trên thị trường quốc tế tinh dầu có giá trị rất cao (1 kg tinh dầu có giá trị trên dưới 300 USD) [1]

Ngoài ra, những loại quả thuộc nhóm Citrus còn được dùng làm thuốc chữa bệnh Các thầy thuốc Ấn Độ, Trung Quốc đã dùng vở quả cam để phòng bệnh dịch hạch, chữa bệnh phối và bệnh chảy máu dưới da Ớ Mỹ vào những năm 30 của thế kỷ

20 các thầy thuốc đã dùng vỏ cam quýt kết hợp với insulin đế trị bệnh tiểu đường Ở Nga bắt đầu thế kỷ 11, các loại quả CCM được sử dụng để phòng ngừa và chữa trị bệnh y học trong nhân gian, ơ nước ta, nhân dân đã dùng cây lá và hoa quả các loại cây ăn quả có múi đế phòng và chữa bệnh từ xa xưa, như vỏ quýt có tên dược liệu là

“trần bì”, được sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cố truyền [1] Nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học Hoa Kỳ cho thấy hợp chất được chiết xuất từ vỏ cam

quít có tên khoa học là polymethoxylated flavones (PMF) - là những yếu tố chống oxy

hóa tích cực thuộc nhóm flavonoid, có khả năng hạn chế gan xuất tiết loại cholesterol độc hại LDL - gây ra các bệnh tim mạch [50] Một thử nghiệm của các nhà khoa học Israel (Học viện Công nghệ Technion) trên chuột cũng cho thấy tác dụng rất tốt của dịch chiết từ vở quả cam, chanh, quýt có tác dụng chữa hen suyễn do dịch chiết này

có chứa limonene [50]

Bảng 1.2 Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)

bị sọc nâu lan dần lên phần rễ chính Bệnh cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên mức độ bệnh ở bưởi ít hơn so với cam sành và quýt tiều Bệnh chủ yếu do nấm

Fusarium solani tấn công làm hư bộ rễ, tuy nhiên bên cạnh đó còn nhiều tác nhân khác như Phytophthora, Pythỉum, Slerotỉum, Thỉelavỉopsỉs Trong một số trường hợp

do tuyến trùng gây hại và tạo vết thương cho nấm bệnh tấn công Các loài tuyến trùng

như: Pratyỉenchus, Radophơlus, Tylenchulus

lá đọt héo như thiếu nước, khi bệnh nặng thường héo toàn cây, lá khô Bệnh nặng trong mùa nắng, bưởi năm roi là bị hại nặng nhất

1.2.3 Bệnh vàng lá Greening

Là một bệnh gây thiệt hại nặng đến nền sản xuất CCM thế giới nhất là Châu Phi và Châu Á Ờ Trung Quốc người ta gọi là “Huanglongbing”, Nam Phi gọi là Greening Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM [8] Thái lan có khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông [12], nhiều nước khác cũng cho thấy thiệt hại của Greening Ở Việt Nam, bệnh này cũng gây thiệt hại nặng

từ Bắc chí Nam Có hai dòng chủ yếu gây bệnh này: dòng Châu Phi phát triển mạnh

trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25°c, dòng Châu Á phát triển cả trong điều kiện lạnh và nóng (lên đến 35°C) [38] Vi khuẩn Liberibacters gây bệnh Greening có thế nhiễm trên tất cả CCM, cam mật, quýt và các dòng lai của quýt là nhiễm nặng nhất Bưởi chùm, chanh Rangpus, chanh núm và bưởi nhiễm ít hơn Chanh giấy, cam ba lá và các dòng lai có xu hướng chống chịu tốt hơn Tuy nhiên, không có giống nào kháng lại bệnh này cả

Triệu chứng trên lá: sơ khởi với phiến lá biến màu vàng, nhưng kích thước lá bình thường, đôi khi hình thành những đốm vàng Những lá mới sau đó nhỏ hơn kích thước bình thường và mọc thắng đứng, lá bị vàng như triệu chứng thiếu kẽm và sắt Ket quả phân tích lá cho thấy hàm lượmg kali cao, nhưng hàm lượng canxi, magie và kẽm thấp [17], [24]

Triệu chứng trên quả: quả trên cây nhiễm bệnh trở nên nhỏ lại, biến dạng và có

vị đắng hơn, có thế do hàm lượng axit cao và hàm lượng đường giảm thấp Quả thường rụng sớm, những quả còn lại thường vẫn giữ được màu xanh [28], có thế vì lý

do này nên người ta gọi theo triệu chứng bệnh là Greening Quả phát triển lệch tâm, hạt trên quả bị hỏng và phát triển không bình thường

Theo báo cáo của Garnier và cộng sự (1984) [18], bệnh Greening do vi khuẩn Gram âm hiện diện trong mô libe gây ra, vi khuẩn này chưa nuôi cấy được trong phòng thí nghiệm Đặc tính của dòng vi khuẩn được xác định thông qua việc định chuỗi gen 16S ribosome DNA và protein trong ribosome Ket quả cho thấy vi khuẩn này thuộc chi Alphaproteobacteria (vi khuẩn Gram âm) và có tên khoa học

“Candidatus Liberibacter” Loài gây hại ở Châu Phi là Candidatus Liberibacter africanus Loài gây hại ở Châu Á (gồm cả Việt Nam) là Candidatus Liberibacter

asiaticus

Theo các tác giả van Lelyveld LJ và van Vuuren SP (1988) [39], khi cây bị bệnh greening thì hoạt độ của enzyme peroxidase bị giảm, hoạt động của enzyme này

tương quan nghịch với độ nhạy cảm với bệnh greening của loài, do đó có thể sử dụng chỉ tiêu hoạt độ enzyme peroxidase trong lá như một “chỉ thị” đánh giá khả năng chống chịu bệnh và độ nhạy cảm với greening

1.2.4 Bệnh Tristeza

1.2.4.1 Triệu chứng và phân bổ của bệnh

Tristeza là một bệnh nguy hại trên CCM với tác nhân gây bệnh là virus thuộc

họ cỉosterovirus Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống, dòng virus

nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]:

• Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân trong

hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy (Citrus aurantifolia)

• Vàng lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange, Citrus aurantium), chanh giấy (Citrus limon), và bưởi chùm (Citrus paradisỉ)

• Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật (Citrus sinensis) trên gốc ghép cam

chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh

• Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi bóc vỏ khỏi thân Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn và dễ gãy

• Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân chính và cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất nhiều

• Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh tốt, tuy nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng phần nửa dưới lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn

Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo ở Nam Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil trong thập niên 30 thế kỷ trước sau khi các nước này nhập khấu các CCM nhiễm bệnh và rệp truyền bệnh

Toxoptera citricida Hơn 80 triệu cây ghép trên gốc cam chua (Citrus aurantium) đã

bị chết hoặc không sinh sản được bởi CTV Các thiệt hại gây ra tại Argentina (hơn 10

triệu cây), Brazil (hơn 6 triệu cây) và Hoa Kỳ (hơn 3 triệu cây) [14] Chỉ riêng ở Tây

Ban Nha có hơn 40 triệu cây, chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis) và quýt (Citrus reticulata) được ghép với cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15] Ngoài ra, CTV

có thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả Đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu

Âu [15], [21], [22] Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7]

Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với triệu chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân trong và dòng virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44]

B

(A) Bệnh úa vàng trên cây cam ngọt ghép với gốc cam chua bị nhiễm bệnh do CTV,

so với cây bình thường ở giừa

(B) Tristeza gây ra sự suy giảm nhanh chóng của cây cam ngọt trên gốc ghép cam

Hình 1.1 Triệu chứng do vừus Citrus Tristeza gây ra

chua (cây ở giữa) bao quanh là các cây với các trạng thái bệnh khác nhau suy giảm chậm

(C và D) thân của cây cam ngọt nhiễm CTV khi ghép với gốc cam chua, và có dạng

tổ ong ở mặt trong của vỏ cây của các gốc cam chua dưới đoạn chồi của cây bị nhiễm Tristeza

(E, F và G) Tristeza là cho quả nhỏ (so với một loại trái cây bình thường trên bàn tay) các cành và thân của một cây bưởi bị rỗ

1.2.4.2 Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh

Tác nhân truyền bệnh CTV từ cây bị nhiễm bệnh sang cây khoẻ mạnh là rầy

mềm Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Aphis spiraecoỉa, Toxơptera aurantii và Myzus persicae (Hình 1.2) [46] Nhiều tác giả cho rằng rây mềm Myzus persỉcae chỉ

truyền virus thuộc dòng nhẹ, nên ta có thể dựa vào đó đế lây truyền dòng nhẹ phục

vụ cho phương pháp bảo vệ chéo (Cross- protection) Ngoài ra virus còn được truyền qua việc chiết ghép

Sự xâm nhiễm của virus trong thực vật được cho là liên quan đến hai quá trình: di chuyển từ tế bào này sang tế bào xung quanh (khoảng cách ngắn) và di chuyến giữa các bộ phận của cây (khoảng cách dài) Svetlana Y F và cộng sự (2008) [35] đã kiếm tra hệ thống xâm nhiễm của CTV ở các loài CCM khác nhau Bằng cách sử dụng một dòng CCM “sạch bệnh” CTV và virus gắn protein huỳnh quang màu xanh (green fluorescent protein-labeled virus), kết quả cho thấy có sự di chuyển từ tế bào tới tế bào và di chuyển khoảng cách dài, hai con đường này thường không bị giới hạn, và khả năng di chuyển thay đối tuỳ theo cây chủ Tập trung phân

tích sự xâm nhiễm ở hai loài cây có múi khác nhau, Citrus macrophylla (loài ít nhạy

cảm với CTV) và cam chua (loài nhạy cảm hơn với CTV), đã cho thấy rằng trong các cây chủ nhạy cảm hơn có các điếm xâm nhiễm bao gồm một nhóm các tế bào, trong khi ở những loài CCM ít nhạy cảm với CTV thường là duy nhất một tế bào

1.2.4.3 Virus Citrus Tristeza

Virus Citrus Tristeza (CTV) có nguồn gốc ở Châu Á và đã lan truyền đến tất

cả các nước đang phát triến CCM CTV thuộc chi Closterovỉrus có kích thước

không phân đoạn Vo protein bao gồm hai phân tử protein CP và CPm có kích thước phân tử tương ứng khoảng 25 kDa (chiếm 95%) và 27 kDa (chiếm 5%) [41] Protein

CP cấu tạo nên phần thân của virus còn protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của virus Hình thành hạt virion có cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion, cấu trúc virion bất thườn này lần đầu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus) [19] Những phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức năng khác nhau trong hạt virion virus

Bộ gen của CTV có kích thước khoảng 19,3 kb (Hình 1.3 A) bao gồm 12 khung đọc mở (ORF - open reading frames) và hai vùng không mã hoá (UTR) đầu 5’

và đầu 3’, mã hoá cho ít nhất 19 protein bao gồm 2 enzyme protease tương tự papain, các protein liên quan tới sự tái bản (RNA polymerase, helicase, methyltransferase), protein giống với heat shock protein Hsp70 homolog (Hsp70h), 2 protein vỏ CP và CPm, protein p23 tương tác với RNA, protein p20 được tích luỹ trong thể vùi Một

so protein chưa rõ chức năng như p61, pl3, p 18 [32], [33], [34], [47] Hsp70h đóng vai trò kép liên quan đến việc hình thành đuôi của virion, và sự chuyển động của virus từ tế bào này sang tế bào khác [10]

Trình tự bộ genome hoàn chỉnh của một vài dòng CTV đã được công bố [23], Hình 1.2 Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza

Đe xác định trình tự genome có vai trò trong việc biếu hiện bệnh, Albiach và cộng sự (2010) [9] sử dụng phương pháp lai phân tử từ hai chủng T36 gây vàng cây ghép (seedling yellows syndrome) và T30 không gây triệu chứng này để xác định trình tự liên quan Các tổ hợp lai T36/T30 được tạo ra bằng cách thay thế một số vùng trình tự T30 vào các vùng khác nhau genome đầu 3’ của chủng T36, sau đó tái

bản trong tế bào trần thuốc lá Các hạt virion được hình thành được nhiễm vào Citrus macrophylla, làm tương tự với chủng

T36 đế làm đối chứng Các mẫu này sau đó được ghép lên cam chua Kết quả cho thấy, với tố hợp lai T36/T30 được thay thế bởi trình tự T30 ở vùng không được dịch

mã p23-3’ (vị trí nucleotide từ 18.394-19.296) không có triệu chứng vàng cây ghép hoặc chỉ có rất ít triệu chứng này

p23 CTV9R (a)

B

Hình 1.3 (A) Tố chức genome của CTV kiêu dại

(CTV9R): PRO: protein giống papain, MT: methyl

transferase, HEL: helicase, RdRp: RNA - dependent

RNA polymerase

Tác giả Ngô Ngọc Lan và cộng sự [3] đã tách dòng và xác định trình tự gen

mã hoá protein vỏ CP và CPm của hai dòng virus gây bệnh ở cây quýt trồng tại cần Thơ và cây cam sành trồng tại Vĩnh Long, đã thu được gen CP có kích thước 672 nucleotide và gen CPm có kích thước 723 nucleotide Hai gen này có mức độ tương đồng cao so với 10 dòng CTV ở các nước khác nhau, hai dòng CTV của Việt Nam được xếp chung vào một nhóm cùng với dòng NuagA (Nhật Bản), BI65 (Hoa Kỳ), SY

568 (Hoa Kỳ), VT (Israel), T3 1 8A (Tây Ban Nha) trên cây phát sinh chủng loại CTV được chia thành 5 chủng chính [46]:

• Virus seedling yellows

• Virus grapefruit pitting

• Virus grapefruit stunt bush

• Virus lime die-back

1.2.4.4 Chuan đoán và phòng chổng bệnh

Bệnh Tristeza gây ra từ nhiều dòng virus khác nhau, việc hiếu rõ dòng virus gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, các dòng CTV khác nhau thì gây bệnh khác nhau và chúng có thế chứa các genome “biến thế” tùy thuộc loài rệp truyền bệnh và loại gốc ghép Các dòng này có thể được phân biệt bằng các xét nghiệm các mẫu RNA mạch kép [29] hoặc bằng cách sử dụng kháng thể huyết thanh đơn dòng đặc hiệu [16] hoặc các kháng thể đơn dòng MCA13 [31] Có thể sử dụng một số phương pháp sau đế giám định:

- Phương pháp giám định bệnh đơn giản nhất là ghép mắt bệnh lên cây chanh giấy, nếu triệu chứng gân trong xuất hiện trên lá non chứng tỏ cây đã nhiễm bệnh

- Phương pháp hữu hiệu nhất có thể sử dụng là dùng kháng thể để giám định

bệnh thông qua ELISA, Immuno Sorbent Eletron Microcopy (ISEM), Dot Immuno Blot Assay (DIBA) hoặc que thử nhanh

- Phương pháp RT-PCR cũng được sử dụng rộng rãi trong việc giám định bệnh

- Sự phát triển của Tissue print-ELISA [15], [20], để phát hiện CTV trong các mặt cắt của nguyên liệu thực vật trên màng nitrocellulose, cho phép kiếm tra với độ nhạy cảm cao của hàng ngàn mẫu một cách đơn giản mà không cần phải chiết xuất

Đẻ phòng chống bệnh Tristeza, nhiều phương pháp có thể được áp dụng như loại trừ cây bệnh, thay đổi phương pháp canh tác như trồng xen canh với ối Biện pháp phòng trừ sinh học như sử dụng dòng nhẹ đế bảo vệ chéo, sử dụng gốc ghép kháng bệnh, sử dụng công nghệ sinh học thông qua chuyển gen, cụ thể như:

- Dùng dòng gây bệnh nhẹ để chủng lên cây và cây sẽ chống chịu tốt khi có dòng khác độc hơn tấn công (cơ chế bảo vệ chéo - Mild strain crossprotection)

- Sử dụng giống kháng hoặc gốc ghép kháng: nhiều giống CCM tỏ ra chống chịu bệnh này nghĩa là virus vẫn tồn tại trên cây nhưng không lộ triệu chứng

Một số giống khác kháng lại bệnh cũng có nghĩa là virus không nhân mật số trên cây bị nhiễm Những cây này thuộc nhóm Poncirus trifoliate, Swingled glutỉnosa và Severinia buxifolia [30]

- Tạo cây chuyến gen kháng đang được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới, trong đó Hoa Kỳ là nước đi đầu và đã bắt đầu từ 1996 Người ta sử dụng chính gen từ vỏ protein của virus hay gen cần thiết cho sự sao chép của virus

đế chuyển vào cây với hy vọng đem lại tính khảng cho cây Tuy nhiên kết quả mới ở trong phạm vi phòng thí nghiệm và mức độ nhà lưới

Sử dụng thuốc Coníĩdor cho bệnh vàng lá Greening và rầy chống cánh cũng có tác dụng tốt đối với rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza

1.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử

1.3.1 Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase, Polymerase chain reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng sao mã ngược (reverse transcription) và PCR đế nhân lên một đoạn gen quan tâm từ RNA Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:

• Tống họp sọ’i cDNA thứ nhất

Nguyên lí của phương pháp này là sử dụng enzyme sao mã ngược (Reverse Transcriptase) đế tống hợp nên sợi cDNA thứ nhất từ RNA Tuỳ theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA được sử dụng khác nhau

Neu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật bậc cao mà không có intron thì người ta thường tống hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s Neu là sinh vật bậc thấp như vi khuẩn, virus Người ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tống số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho đoạn gen cần nhân lên Khi mồi gắn bố sung với sợi RNA khuôn, enzyme sao mã ngược sẽ xúc tác cho quá trình tống hợp cDNA từ các nucleotide tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng, thu được lượng cDNA tương ứng với lượng RNA khuôn ban đầu Đe tăng hiệu quả cho quá trình tống hợp, lượng mồi đưa vào lớn hơn rất nhiều lượng RNA khuôn

và chất kìm hãm (ức chế) enzyme RNAse cũng được đưa vào bảo vệ cho RNA khỏi

bị cắt bởi enzyme RNAse

• Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR

Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (Primer-F, Primer-R)

1.3.2 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction - chuồi phản ứng trùng hợp) được Kary Mullis (bằng sáng chế của Hoa Kỳ số 4.683.202) phát minh năm 1985 [4] Đây

là kỹ thuật tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh in vitro một số lượng không hạn

chế nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những cặp mồi đặc

hiệu Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài đế hình thành mạch mới Quá trình này gồm ba bước:

Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ lên 94-95°C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút

khoảng 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+C của đoạn mồi

Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi Hai phân tử DNA mới được tống hợp theo nguyên tắc bố sung từ hai phân tử khuôn ban đầu Thời gian kéo dài từ 1 phút đến vài phút Đe tránh hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu,

PCR là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) được tách chiết từ vi khuấn Thermus aquaticus, một loại vi khuấn được phân lập từ suối nước nóng Hiện nay enzyme này

được sản xuất chủ yếu theo con đường tái tổ hợp [5]

Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi,

khoảng 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản được nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu

Biến nạp theo nghĩa rộng là đưa bất kì đoạn DNA vào bất kì tế bào nào Trong

trường hợp các tế bào E.coli thì có nghĩa là đưa DNA plasmid vào trong tế bào

Plasmid là những phân tử DNA vòng, sợi kép, tự tái bản, được duy trì trong vi khuẩn như các thực thể độc lập ngoài nhiễm sắc thể, một so plasmid mang thông tin

về việc di chuyến chính nó từ tế bào này sang tế bào khác (F plasmid), một số khác

mã hoá khả năng kháng lại kháng sinh (R-plasmid) và một số khác mang bộ gen đặc biệt để sử dụng các chất chuyển hoá bất thường (plasmid phân huỷ) Mỗi plasmid có một trình tự thực hiện chức năng làm “điểm khởi đầu” sao chép DNA [4]

Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Frederick Griffith mô tả vào năm 1928

trong thí nghiệm nối tiếng “Nguyên lí biến nạp” Tuy nhiên, không phải tất cả vi

khuẩn đều có thế được biến nạp một cách dễ dàng Đế cho biến nạp E.coli có hiệu

quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent) Đế đạt được điều này, người ta

thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào, ủ trong đá 20-30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (khoảng 1 phút ở nhiệt độ 42°C), làm như vậy DNA sẽ được thu nạp vào tế bào Phương pháp này có tần số biến nạp tối đa khoảng 1 tế bào biến

từ mỗi microgam DNA plasmid nguyên vẹn [4] Sau khi biến nạp, vi khuấn được

được đưa lên môi trường chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid

1.3.4 Kỹ thuật tách dòng

Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu được sử dụng trong kỹ thuật di truyền

và là bước khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này Mục đích của việc tách dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm Đầu tiên, DNA ngoại lai được nối vào một vector nhằm tạo ra một cấu trúc vector tái tố hợp Vector

sử dụng là một plasmid thích ứng của vi khuẩn E.coli Sau đó vector tái tổ hợp được

biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ được nuôi cấy trong môi trường thích hợp đế nhân vi khuấn lên nhiều lần Cuối cùng qua các bước tách chiết DNA, người ta sẽ thu được một lượng lớn plasmid tái tố hợp Các nhân tố như vector, tế bào chủ có thể thay đổi nhưng tiến trình tách dòng nói chung được thực hiện qua bốn bước: xử lí DNA cần tạo dòng, tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vector tái tố hợp vào tế bào chủ và chọn dòng

• Xử lí DNA cần tạo dòng

Trước hết đoạn DNA cần tạo dòng được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau đó được làm sạch để thu được phân đoạn DNA có kích thước như mong muốn, loại bỏ mồi và các thành phần phản ứng khác trong phản ứng

PCR Bước này nhằm tạo điều kiện cho bước chọn dòng được thực hiện nhanh và hiệu quả, tránh những plasmid tái tố hợp có kích thước không mong muốn

• Tạo vector tái tổ hợp

Vector tái tố hợp được tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo dòng) vào vector tách dòng Thông thường trong phản ứng PCR, enzyme Taq polymerase sẽ gắn thêm một nucleotide là A vào đầu 3’ của đoạn gen được nhân lên Lợi dụng tính chất này các nhà khoa học đã nghiên cứu các thế hệ vector tách dòng

có mang một nucleotide T ở đầu 5’ của vector đã được mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site - vùng nhân dòng đa điêm cắt) Hiện nay có rất nhiều vector tách dòng có đặc tính này, như pCR®2.1-TOPO, pGEM®-T

Vector tách dòng và DNA cần tạo dòng được trộn chung theo một tỷ lệ nhất định và dưới sự xúc tác của T4 ligase, DNA sẽ được gắn vào vector theo nguyên tắc

bố sung A-T tại vị trí mở vòng

• Biến nạp vector tái tổ họp vào tế bào chủ

Do trong quá trình gắn gen vào vector tạo ra các vector tái tổ hợp khác nhau Nên bước này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ đế sao chép vector tái

tố hợp thành một số lượng lớn bản sao Tuỳ theo mục đích sử dụng, người ta sẽ chọn

tế bào chủ là tế bào E.coli hay tế bào nấm men

• Chọn dòng

Chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tố hợp theo hai cách thông dụng: chọn lọc theo phương pháp kháng sinh (kanamycin hoặc ampicillin) nhằm loại trừ các tế bào vi khuẩn không được biến nạp và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác; chọn lọc theo phản ứng với cơ chất (X-gal) nhằm loại trừ những vi khuẩn có mang vector nhưng không mang đoạn gen được chèn vào

1.3.5 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để xác định tế bào vi khuẩn có plasmid mang gen mong muốn, như phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR),

cat plasmid bằng các enzyme cắt giới hạn, hoặc PCR từ plasmid Trong đó phương pháp colony-PCR cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mong muốn Phương pháp này có ưu điểm là nhanh, ít tốn kém và đơn giản Hiện nay kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học phân tử Nguyên tắc kỹ thuật colony-PCR dựa trên nguyên tắc kỹ thuật PCR chỉ khác ở chỗ mẫu DNA được thay bằng DNA plasmid giải phóng từ khuẩn lạc Ở nhiệt độ cao (94-95°C), màng tế bào vi khuân bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tô hợp Plasmid tái tô hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu

1.3.6 Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide

Trình tự nucleotide của một phân đoạn DNA có thể được xác định bằng cách

sử dụng một quy trình hóa học được Alan Maxam và Walter Gilbert phát triển đầu tiên hay một quy trình enzyme được phát triển bởi Fred Sanger, quy trình này thường được gọi là phương pháp enzyme hay dideoxyribonucleotide [4] Những phương pháp đọc trình nucleic acid đang được sử dụng hiện nay đều được cải tiến từ phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide của Sanger và cộng sự (1977) Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp trình tự bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase Đặc trưng của phương pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide

là những deoxynuclotide trong đó nhóm 3’-OH được thay bằng H Điều này khiến cho các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối phosphodiester và do đó ngừng quá trình tống hợp Trong kỹ thuật xác định trình tự nucleotide tự động, mỗi dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau

Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trong ống vi mao quản, tạo ra một dãy các phân đoạn DNA hơn kém nhau một nucleotide Thiết bị phát hiện huỳnh quang (detector) phát hiện các băng DNA được nhân lên theo thời gian Detector,

một thiết bị khuếch đại tín hiệu, phát tín hiệu lên máy tính Ket quả xác định trình tự

sẽ được xử lí bằng phần mềm máy tính chuyên dụng

1.3.7 Xử lí số liệu

Công nghệ thông tin đã phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau trong đó có sinh học, các ứng dụng này được gọi chung là tin sinh học (Bioinformatics) Hiện nay, có nhiều phần mềm máy tính chuyên dụng xử lí trình tự gen như: BLAST, DNAstar, Bioedit đế kiếm tra độ chính xác của trình tự sau khi đọc Trong đó, phần mềm Bioedit là hệ thống phần mềm tiện dụng nhất

Một bước tiến nhảy vọt trong lĩnh vực công nghệ thông tin là sự hình thành hệ thống internet, đó là một mạng kết nối nhiều triệu máy tính ở khắp nơi trên thế giới với nhau từ các máy tính đơn lẻ có thể truy cập, khai thác dữ liệu từ các máy tính khác nhờ đường truyền cáp quang hoặc điện thoại Do vậy, internet là kho dữ liệu khổng lồ

Các nhà sinh học cũng đã sử dụng internet đế tạo ra các trang web về sinh học

chứa đựng thông tin về các công trình khoa học đã được công bố Từ các máy tính nối mạng internet, ta có thế có được các tài liệu quan tâm đã được xuất bản khi truy cập và tìm kiếm bằng những từ khoa như tên tạp chí, tên tác giả hay chủ đề quan tâm Đặc biệt các nhà sinh học phân tử còn thành lập nên các ngân hàng dữ liệu lưu giữ toàn bộ các trình tự của các gen đã được xác định và trình tự các protein với cấu trúc không gian của nó Khi truy cập các trang wed này chúng ta sẽ có được trình tự của gen hoặc có thế so sánh các trình tự gen mình đang nghiên cứu với các trình tự khác

đã được công bố hoặc ta cũng có thể đăng ký và đưa các trình tự của mình vào các ngân hàng này Hiện nay, có ba ngân hàng dừ liệu chính lưu trữ khoảng hơn hai triệu trình tự được kết nối với nhau theo sơ đồ:

• EMBL là Phòng Sinh học phân tử Châu Âu thuộc Viện Thông tin Sinh học

• NCBI là Trung tâm Thông tin công nghệ sinh học quốc gia của Hoa Kỳ có địa

• DDBJ là Ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh học

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Vật liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu lá nhiễm CTV

đã được thu tại Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ, và Vĩnh Long, kiểm tra nhiễm CTV

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

Hoá chất

Kit tổng hợp cDNA (RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis

Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ nuôi cấy vi sinh vật, máy chụp ảnh, pipet man, máy PCR và các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Te bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

• Phương pháp thiết kế mồi

Khai thác dữ liệu trong Ngân hàng gen để tìm trình tự gen của các chủng CTV

đã được công bố Sử dụng chương trình phần mềm DNA star, Bioedit đế so sánh các trình tự của gen thu được với nhau Việc thiết kế mồi được thực hiện tại các vùng có

độ bảo thủ cao nhất Trên cơ sở đó, các mồi đặc hiệu đã được thiết kế để nhân các gen quan tâm

• Phương pháp tách chiết RNA tống số

Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen, Hoa Kỳ) đế tách chiết RNA tống

số từ các mẫu lá nhiễm virus theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Quy trình

bảo mẫu phải được nghiền triệt đế và tránh RNAse cắt RNA

2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm

- Sau đó chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2 ml

5 phút

- Bổ sung 200 jnl chloroform:Isoamyl (24:1), đảo đều ở nhiệt độ trong 5 phút

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút

- Hút 500 |il dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml

- Bố sung 500 ịi\ isopropanol ở 4°c, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa

- Đế ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút

- Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bang ethanol 70% pha trong nước đã xử lí bằngDEPC 0,01%

- Pha loãng RNA trong 40 |Lil nước đã xử lí bằng DEPC 0,01%

- Lấy 1 jul RNA tổng số điện di kiểm tra

• Phương pháp RT-PCR

cDNA Synthesis của Fermentas

- Bổ sung các thành phần sau đây vào ống PCR 0,5 ml đã được xử lí DEPC hoặc

ống Free RNA: 200 ng mồi ngẫu nhiên (1 |Lil), 10 ng-5 |ug RNA tổng số (2

ỊLil), bổ sung nước khử ion, khử trùng tới thể tích 12 jư 1 ủ 70°c trong 5

phút, sau đó để ngay vào đá

- Bổ sung tiếp các thành phần: 4 pi Reaction buffer 5X, 1 ịul RibolockTM

Ribonuclease Inhibitor 20 u/|Lil và 2 ỊLil dNTPs lOmM

- Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kỳ nhiệt như sau:

Phản ứng PCR

Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đế

khuếch đại gen

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA