Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus Tristeza Virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam

1 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành bản luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong Ban Giám Hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời gian tôi học tập chương trình thạc sĩ. Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của Th.S. Đặng Thị Hƣơng, Tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 10 năm 2010 La Việt Hồng 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2 NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi 3 1.2. Những bệnh thƣờng gặp ở cây có múi 5 1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ 1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens 1.2.3. Bệnh vàng lá Greening 1.2.4. Bệnh Tristeza 5 5 6 7 3 1.2.4.1. Triệu chứng và phân bố của bệnh 1.2.4.2. Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh 1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza 1.2.4.4. Chuẩn đoán và phòng chống bệnh 7 10 11 13 1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử 1.3.1. Kỹ thuật RT-PCR 1.3.2. Kỹ thuật PCR 1.3.3. Kỹ thuật biến nạp plasmide vào E.coli 1.3.4. Kỹ thuật tách dòng 1.3.5. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 1.3.6. Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide 1.3.7. Xử lí số liệu 15 15 15 16 17 19 19 20 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 22 22 22 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 23 23 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Thiết kế mồi 31 3.2. Tách RNA tổng số 32 3.3. Nhân dòng các đoạn gen 33 4 3.4. Tách dòng gen và xác định trình tự gen 3.4.1. Tạo plasmide tái tổ hợp 3.4.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp bằng phương pháp colony-PCR 3.4.4. Tách plasmide và cắt kiểm tra gen bằng enzyme giới hạn 3.4.5. Xác định trình tự các đoạn A, F, P của CTV ở các mẫu CT, HG, HN và VL 34 34 35 36 37 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 2. Đề nghị 45 45 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 52 5 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g) Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB đặc, lỏng Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV Bảng 3.2. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide đoạn A giữa CT, HG, HN và VL Bảng 3.3. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide đoạn F giữa CT, HG, HN và VL Bảng 3.4. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide đoạn P giữa CT, HG, HN và VL 7 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển vi điện tử âm bản nucleocapsid Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1% Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker 1kb Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37 0 C trên môi trường LB đặc Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18 trên gel agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmide pBT tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn đối với mẫu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank Hình 3.10. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank 8 Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn P giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.13. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen P của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank 9 DANH MỤC T Ừ VIẾ T T Ắ T µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair BYV Beet yellows virus cDNA Complementary DNA CS Cộng sự CP/ NCP Protein vỏ ( Coat protein/ Nucleocapsid Protein) CCM Cây có múi CTV Citrus tristeza virus CT Cần Thơ (mẫu thu tại tỉnh Cần Thơ) DDBJ Ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh học có địa chỉ truy cập: www.ddbj.nig.ac.jp DEPC Diethyl pyro Carbonate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) EMBL Phòng Sinh học phân tử Châu Âu thuộc Viện Thông tin Sinh học Châu Âu có địa chỉ truy cập: www.ebi.ac.uk HSP70 Heat shock protein 70- protein sốc nhiệt HG Hà Giang (mẫu thu tại tỉnh Hà Giang) HN Hà Nội (Mẫu thu tại Hà Nội) IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Marker (thang đo kích thước DNA) 10 NCBI Trung tâm Thông tin công nghệ sinh học quốc gia của Hoa Kỳ có địa chỉ truy cập: www.NCBI.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer ORF Open reading frames - khung đọc mở PNAS Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCS Polycloning site - vùng nhân dòng đa điểm cắt PMF Polymethoxylated flavones RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngược) TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút VL Vĩnh Long (mẫu thu tại tỉnh Vĩnh Long) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh… cùng họ Rutaceae [45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại [...]... virus này Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam 2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới để có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi 11 - Góp thêm... lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn lụi có tác nhân là virus Citrus Tristeza gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn quả có múi [10], [40], [25] Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây ảnh hưởng tới năng suất và phẩm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh Greening Tuy vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa dạng về hệ gen của virus. .. của virus Citrus Tristeza ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng virus được chính xác Bên cạnh đó còn có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus 3 Nhiệm vụ nghiên cứu - Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, Cần Thơ và Vĩnh Long - Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng. .. với greening 1.2.4 Bệnh Tristeza 1.2.4.1 Triệu chứng và phân bố của bệnh 17 Tristeza là một bệnh nguy hại trên CCM với tác nhân gây bệnh là virus thuộc họ closterovirus Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống, dòng virus nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]:  Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân trong hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy (Citrus aurantifolia)... Nha) trên cây phát sinh chủng loại CTV được chia thành 5 chủng chính [46]:  Virus seedling yellows  Virus grapefruit pitting  Virus grapefruit stunt bush  Virus lime die-back  Virus Ellendale mandarin decline 1.2.4.4 Chuẩn đoán và phòng chống bệnh Bệnh Tristeza gây ra từ nhiều dòng virus khác nhau, việc hiểu rõ dòng virus gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, các dòng CTV khác nhau thì gây. .. riêng ở Tây Ban Nha có hơn 18 40 triệu cây, chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis) và quýt (Citrus reticulata) được ghép với cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15] Ngoài ra, CTV có thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả Đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả. .. ở Châu Âu [15], [21], [22] Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7] Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với triệu chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân trong và dòng virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44] 19 Hình 1.1 Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra 20 (A) Bệnh. .. lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange, Citrus aurantium), chanh giấy (Citrus limon), và bưởi chùm (Citrus paradisi)  Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật (Citrus sinensis) trên gốc ghép cam chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh  Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi bóc vỏ khỏi thân Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên...  Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân chính và cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất nhiều  Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh tốt, tuy nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng phần nửa dưới lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây. .. quân trên đầu người là 15 kg quả/ năm Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với di n tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, di n tích mỗi năm tăng bình quân gần 7%, CCM được trồng nhiều ở các tỉnh: Cần Thơ, Bến Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang [48] Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng di n tích, nâng cao chất lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza . Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus tristeza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây. năng suất và chất lượng quả. Đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu Âu [15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả. truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới để có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi. 12 - Góp thêm