Phƣơng pháp thiết kế mồi
Khai thác dữ liệu trong Ngân hàng gen để tìm trình tự gen của các chủng CTV đã được công bố. Sử dụng chương trình phần mềm DNA star, Bioedit để so sánh các trình tự của gen thu được với nhau. Việc thiết kế mồi được thực hiện tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất. Trên cơ sở đó, các mồi đặc hiệu đã được thiết kế để nhân các gen quan tâm.
Thu thập mẫu virus
Tách RNA tổng số
Khai thác trình tự trong NCBI
Thiết kế mồi
Nhân gen bằng PCR/RT-PCR
Tách dòng gen
36
Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số
Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen, Hoa Kỳ) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá nhiễm virus theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Quy trình
- Cân 200 mg mẫu lá nhiễm virus, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải được nghiền triệt để và tránh RNAse cắt RNA.
- Sau đó chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2 ml.
- Bổ sung 1 ml Trizol Regents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300
C) trong 5 phút.
- Bổ sung 200 µl chloroform:Isoamyl (24:1), đảo đều ở nhiệt độ trong 5 phút.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút.
- Hút 500 µl dịch nổi chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml.
- Bổ sung 500 µl isopropanol ở 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa.
- Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng ethanol 70% pha trong nước đã xử lí bằng DEPC 0,01%.
- Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút. - Pha loãng RNA trong 40 µl nước đã xử lí bằng DEPC 0,01%. - Lấy 1 µl RNA tổng số điện di kiểm tra.
Chú ý: do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ phải xử lí DEPC 0,01%.
37
RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR hai bước:
Tổng hợp cDNA
Phản ứng sử dụng mồi ngẫu nhiên theo kit RevertAidTMH
Minus First Strand cDNA Synthesis của Fermentas.
- Bổ sung các thành phần sau đây vào ống PCR 0,5 ml đã được xử lí DEPC hoặc ống Free RNA: 200 ng mồi ngẫu nhiên (1 µl), 10 ng-5 µg RNA tổng số (2 µl), bổ sung nước khử ion, khử trùng tới thể tích 12 µl. Ủ 700C trong 5 phút, sau đó để ngay vào đá. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bổ sung tiếp các thành phần: 4 µl Reaction buffer 5X, 1 µl RibolockTM Ribonuclease Inhibitor 20 u/µl và 2 µl dNTPs 10mM. - Trộn và ly tâm nhẹ ống, rồi ủ ở 250C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá. - Tiếp tục bổ sung 1 µl RevertAidTMH
Minus M-MuLV RT 200 u/µl. - Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kỳ nhiệt như sau:
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA
Bƣớc Nhiệt độ (0 C) Thời gian (phút) 1 25 10 2 42 60 3 70 10 4 4 ∞ Phản ứng PCR
Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
38