C) Thời gian Chu kỳ
4 Kéo dài chuỗi 7 21 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút
1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Phƣơng pháp tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó được làm sạch theo bộ Kit Bioneer và gắn vào vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật thiết kế [2].
Các bƣớc tiến hành:
- Tinh sạch sản phẩm PCR (theo bộ Kit Bioneer, Hàn Quốc)
- Thêm Buffer PB theo tỷ lệ về thể tích giữa Buffer : sản phẩm PCR là 5:1 vào cột lọc DNA.
- Đặt cột lọc lên ống eppendorf 2 ml, ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 30 giây – 1 phút.
39
- Bỏ dịch phía dưới, thêm 500 µl WB (washing buffer) vào cột lọc DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 30 giây – 1 phút. Bước này nhằm loại bỏ muối và các chất hòa tan khác.
- Bỏ dịch phía dưới, đặt cột lọc DNA trở lại ống eppendorf, bổ sung tiếp 500 µl WB, ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 30 giây – 1 phút. - Bỏ dịch phía dưới, ly tâm làm khô ở 13.000 vòng/phút trong khoảng 2
phút.
- Đặt cột lọc DNA sang ống eppendorf 1,5 ml mới.
- Thêm 30 µl Buffer EL (thay bằng nước ion khử trùng) vào giữa cột lọc DNA, để khoảng 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút để thu dịch DNA tinh sạch.
- Gắn gen vào vector tách dòng (phản ứng ligation).
- Sản phẩm tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học thiết kế.
- Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer T4 10X 2,0 2 DNA mẫu 5,0 3 Vector tách dòng 1,0 4 T4 ligase 1,0 5 Nước ion khử trùng 11,0 Tổng thể tích 20,0
40
Tế bào E. coli DH5α được cấy vạch trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C. Chọn 1 khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm. Hút 100 µl dịch khuẩn ở trên cho vào 50 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 370
C trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4-0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc 40
C). Ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút. Thu cặn và hòa tan trong 30 ml CaCl2 0,1 M, để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút (lặp lại ba lần). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1 ml CaCl2/100 ml LB ban đầu. Bổ sung 15-20% glycerol. Chia 50 µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến ở tủ -840C.
Biến nạp
- Bổ sung 20 µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 30 phút, rồi ủ 420
C trong 1 phút, sau đó đặt vào đá 5 phút.
- Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ.
- Sử dụng que cấy trải, trải 150-250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa carbecine 100 mg/l, X-gal 30 mg/l, IPTG 100 µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ.
Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony-PCR)
Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thu được những khuẩn lạc xanh trắng, tiến hành chọn 5 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng Colony-PCR với cặp mồi pUC18-F1 và pUC18-R1 nằm trên vector tách dòng (hoặc sử dụng mồi đặc hiệu nhân gen) để xác định khuẩn lạc có plasmid mang gen quan tâm. Thành phần phản ứng colony-PCR tương tự PCR nhưng thay mẫu DNA bằng khuẩn lạc. Điện di kiểm tra sản
41
phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra khuẩn lạc mang gen có kích thước mong muốn [49]. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbecine 100mg/l để tách plasmid.
Phƣơng pháp tách plasmid
Sử dụng bộ Kit Bioneer (plasmid mini extraction kit, Hàn Quốc). Đây là phương pháp tách plasmid lượng nhỏ từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E.coli.
Quy trình
- Hút 1-1,5 ml dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút để thu tế bào.
- Hòa tan tế bào trong 250 µl đệm chiết 1, vortex cho tan hết cặn tế bào. - Bổ sung 250 µl đệm chiết 2, đảo nhẹ, ủ vào đá 5 phút.
- Bổ sung 350 µl đệm chiết 3, đảo nhẹ, ủ vào đá 5 phút. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút dịch phía trên chuyển sang cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Đổ dịch phía dưới, bổ sung 700 µl đệm chiết 4 vào cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
- Đổ dịch phía dưới, ly tâm bổ sung 13.000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô plasmid trên màng lọc của cột.
- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml mới.
- Bổ sung 30-40 µl nước ion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch plasmid. - Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1%.
42
Trình tự gen được xác định trên máy đọc tự động ABI PRIM®
3100 Avant Genetic Analyzer bằng cách sử dụng bộ hóa chất sinh chuẩn bigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequensing. Thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đọc trình tự trên máy GeneAmp®PCR System 9700 như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Dung dịch đệm 5X 3,0 2 Mồi 1,3 3 DNA mẫu (~ 200ng) 7,7 4 Bigdye 3,0 Tổng thể tích 15,0
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 96 1 phút 1
2 Biến tính 96 10 giây
25
3 Gắn mồi 52 5 giây
4 Kéo dài chuỗi 60 4 phút