C) Thời gian Chu kỳ
5 Hoàn tất kéo dài 7 28 phút
3.4. Tách dòng gen và xác định trình tự gen 1 Tạo plasmid tái tổ hợp
3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp
Để khẳng định chắc chắn rằng đoạn DNA thu được từ phản ứng RT- PCR chính xác là đoạn gen mong muốn, chúng tôi tiến hành việc tiếp theo là tách dòng gen và xác định trình tự gen.
Để việc tách dòng đạt hiệu quả nhất, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR theo bộ kit Bioneer, Hàn Quốc. Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện trong Hình 3.3. Các giếng điện di đều xuất hiện một băng đặc hiệu rõ nét, điều đó khẳng định là chất lượng sản phẩm tinh sạch đảm bảo cho phản ứng gắn gen vào vector.
48
Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb; Giếng 1, 2, 3, 4: Đoạn gen A tinh sạch tương ứng của các mẫu CT, HG, HN và VL; Giếng 5, 6, 7, 8: Đoạn gen F tinh sạch tương ứng của các mẫu CT, HG, HN và VL;
Giếng 9, 10, 11, 12: Đoạn gen P tinh sạch tương ứng các mẫu CT, HG, HN và VL. Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pBT của Phòng Công nghệ tế bào thực vật (phản ứng ligation). Vector pBT có kích thước 2705bp, trên vector này có hai đầu T để gắn với gen, có gen kháng kháng sinh carbecilin phục vụ cho việc chọn lọc khuẩn lạc có vector tái tổ hợp mong muốn (Hình 3.4) [2].
Thành phần và chu kỳ phản ứng được trình bày ở mục 2.2.2 và bảng 2.5. Kết quả của phản ứng là thu được vector tái tổ hợp.
Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT