Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp) được Kary Mullis (bằng sáng chế của Hoa Kỳ số 4.683.202) phát minh năm 1985 [4]. Đây là kỹ thuật tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh in vitro
một số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những cặp mồi đặc hiệu. Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Quá trình này gồm ba bước:
Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng nhiệt độ lên 94-950C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút.
Gắn mồi với đoạn DNA cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống 40- 600C, trong khoảng 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+C của đoạn mồi.
Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai phân tử khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 1 phút đến vài phút. Để tránh hiện tượng
28
bắt cặp không đặc hiệu, phản ứng tổng hợp nên được thực hiện ở nhiệt độ 720C. Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (Taq polymerase) được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một loại vi khuẩn được phân lập từ suối nước nóng. Hiện nay enzyme này được sản xuất chủ yếu theo con đường tái tổ hợp [5].
Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2n
sợi DNA được nhân lên. Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản được nhân lên từ một sợi khuôn ban đầu.