C) Thời gian Chu kỳ
3.2.Tách RNA tổng số
5 Hoàn tất kéo dài 7 28 phút
3.2.Tách RNA tổng số
Do đặc tính của RNA là một loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). Trong khi đó RNase có mặt ở khắp mọi nơi và có hoạt tính rất mạnh kể cả ở nhiệt độ cao (1000C trong khoảng 1 giờ). Do đó việc tách RNA phải cẩn thận để tránh các tạp nhiễm chứa RNase từ môi trường và tất cả các dụng cụ thí nghiệm để tách RNA đều phải xử lí bằng DEPC 0,01% để loại trừ RNase.
Các mẫu lá nhiễm CTV được nghiền nhanh trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày sứ đã được khử trùng để phá vỡ tế bào. Sau đó bổ sung ngay dung dịch Trizol vào vì nếu không RNase nội bào được giải phóng sẽ cắt RNA. Các thành phần trong dung dịch Trizol như: phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chóng làm kết tủa protein và bất hoạt RNase nội bào. Bổ sung chloroform: isoamyl (24:1) để làm sạch các protein còn sót lại. Tiếp theo, sử dụng isopropanol để kết tủa RNA. Cuối cùng sản phẩm RNA tổng số được hòa tan trong 30 µl nước khử ion, DEPC 0,01%. RNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.1 cho thấy RNA các mẫu có hàm lượng lớn và có 2 băng RNA riboxom rõ nét nên có thể khẳng định rằng RNA tổng số chưa bị phân hủy. Như vậy, chúng tôi đã tách thành công RNA tổng số. RNA tổng số được loại DNA bằng DNase và sử dụng cho phản ứng RT-PCR.
46
Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá nhiễm CTV thu tại Cần Thơ, Hà Giang, Hà Nội và Vĩnh Long trên gel agarose 1%