Đánh giá di truyền một số dòng, giống thuốc lá (nicotiana spp ) nhập nội và mới chọn tạo của việt nam bằng chỉ thị phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU ĐÁNH GIÁ DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG, GIỐNG THUỐC LÁ (Nicotiana spp.) NHẬP NỘI VÀ MỚI CHỌN TẠO CỦA VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.80 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI – 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan, giúp đỡ việc thực luận văn cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả Nguyễn Thị Thu Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Phương Thảo tận tình giúp đỡ, hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài, suốt trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Viện sau đại học, Khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt thầy cô môn Công nghệ sinh học thực vật (trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) có nhiều ý kiến đóng góp quý báu giúp hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Tào Ngọc Tuấn - Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá, KS Ngô Hải Anh KS Nguyễn Thị Thùy Linh giúp đỡ nhiều trình làm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, gia đình người thân nhiệt tình giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực đề tài hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày 16 tháng 04 năm 2012 Nguyễn Thị Thu Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích yêu cầu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung thuốc 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại thực vật 2.1.2 Đặc điểm thực vật học loài Nicotiana tabacum L 2.1.3 Đa dạng nguồn gen thuốc 2.1.4 Giá trị thuốc 2.2 Tình hình nghiên cứu, chọn tạo giống thuốc Thế giới Việt 10 Nam 11 2.2.1 Tình hình nghiên cứu, chọn tạo giống thuốc Thế giới 11 2.2.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống thuốc Việt Nam 12 2.3 Virus TMV gây hại thuốc nghiên cứu tính kháng bệnh TMV thuốc 15 2.3.1 Giới thiệu Virus khảm thuốc (Tobacco mosaic virus- TMV) 15 2.3.2 Giới thiệu chung gen R thuyết gen đối gen 21 2.3.3 Giới thiệu gen N sở phân tử tính kháng TMV dựa gen N thuốc Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 27 iii 2.4 Các nghiên cứu sử dụng thị phân tử đánh giá đa dạng nguồn gen thuốc 32 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 34 3.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 4.1 PHÁT HIỆN NGUỒN GEN KHÁNG BỆNH TMV Ở CÂY THUỐC LÁ 42 4.2 Nhân dòng xác định trình tự 48 4.2.1 Trình tự nhân dòng sản phẩm cặp mồi NBS 182 50 4.2.2 Trình tự nhân dòng sản phẩm cặp mồi NBS 226 55 4.3 Kết phân tích đa dạng di truyền 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TMV Tobacco mosaic virus : Virus khám thuốc CMV Cucumber mosaic virus : Virus khám dưa chuột DNA Deoxyribonucleic Acid cs Cộng AvrPto Avirulence Pto TSWV Tomato Spotted Wilt Virus: Virus héo đốm cà chua RNA Ribonucleic Acid ISSR Inter-Simple Sequence Repeats kDal kiloDalton bp Bazơ pairs kb kilo base MP Movement protein CP coat protein: protein vỏ CC coiled-coil NB Nucleotide binding TIR Toll - Interleukin-1 Receptor LRR leucine-rich repeat NBS Nucleotide-binding site CNL coiled-coil / nucoleotide-binding site/leucine-rich repeat TNL Toll-interleukin-1 receptor/ nucoleotide-binding site/leucine-rich repeat ATP Adenosine triphosphate Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… v HR hypersensitive response PVX Potato virus X RT-PCR Real time polymeraa SHR Systemic hypersensitive response SAR Systemic acquired resistance: hệ thống kháng tập nhiễm RAPD Random amplified polymorphic: đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên SSR Simple Sequence Repeats: trình tự lặp lại đơn giản CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide PCR Polymerase Chain Reaction PIC polymorphism information content SMC Simple matching coefficient UPGMA Unwaited Pair Group Method using Arithmetic Averages RGHs Resistance gene homologs RGAs Resistance gene analog BLAST Basic local alignment search tool NCBI National Center for Biotechnology Information ORF Open reading frame R Resistance BLAST Basic local alignment seach tool Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Danh sách mẫu dòng, giống thuốc thu thập 34 3.2 Thành phần phản ứng PCR 36 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 37 3.4 Danh sách mồi NBS để xác định gen N thuốc 37 3.5 Thành phần phản ứng PCR 38 3.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 38 3.7 Danh sách mồi ISSR 39 3.8 Thành phần phản ứng nhân dòng 40 4.1 Kết nhân PCR sử dụng cặp mồi 20 giống thuốc nghiên cứu 48 4.2 Sản phẩm thu từ mồi ISSR 59 4.3 Số lượng vạch băng, hàm lượng thông tin đa hình, khả phân tích mồi ISSR 20 mẫu thuốc thí nghiệm 4.4 4.5 62 Các thị ISSR cho vị trí băng đặc trưng dòng, giống thuốc thu thập 63 Hệ số tương đồng di truyền 20 mẫu giống thuốc nghiên cứu 65 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1a Hình thái phân tử virus TMV 17 2.1b Cấu trúc phân tử virus TMV 17 2.2 Sơ đồ cấu trúc genome TMV 18 2.3 Tổ chức gen phân tử phụ genome TMV 19 2.4 Triệu chứng bệnh khảm thuốc virus TMV gây 20 2.5 Đặc điểm cấu trúc, vị trí hoạt động ví dụ lớp gen kháng R 24 2.6 Tóm tắt đột biến đoạn gen N kiểu hình chúng 30 2.7 Dự đoán cấu trúc sản phẩm gen N TMV 126 kDa replicase protein; 4.1 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS173 20 mẫu giống nghiên cứu 4.2 45 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS374 20 mẫu giống nghiên cứu 4.8 44 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS359 20 mẫu giống nghiên cứu 4.7 44 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS329 20 mẫu giống nghiên cứu 4.6 43 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS182 20 mẫu giống nghiên cứu 4.5 43 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS267 20 mẫu giống nghiên cứu 4.4 42 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS226 20 mẫu giống nghiên cứu 4.3 31 45 Sản phẩm nhân PCR sử dụng cặp mồi NBS271 20 mẫu giống nghiên cứu Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 46 viii 4.9 Biến nạp sản phẩm nhân dòng cặp mồi NBS 182 49 4.10 Biến nạp sản phẩm nhân dòng cặp mồi NBS 226 49 4.11 Kiểm tra khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp 50 4.12 Xác định trình tự nhân lên từ cặp mồi NBS182 giống BS2 4.13 Kết BLAST trình tự nhân lên từ cặp mồi NBS182 giống BS2 4.14 54 Xác định trình tự nhân lên từ cặp mồi NBS226 giống BS2 4.15 53 57 Kết BLAST trình tự nhân lên từ cặp mồi NBS226 giống BS2 57 4.16 Sản phẩm PCR nhân mồi ISSR 60 4.17 Quan hệ di truyền mẫu dòng, giống thuốc dựa thị ISSR Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 64 ix Sản phẩm PCR mồi ISSR Sản phẩm PCR mồi ISSR thể hình 4.16 (a) (c) (e) (b) (d) (f) Hình 4.16: Sản phẩm PCR nhân mồi ISSR: UBC-807 (a); UBC-809 (b); UBC-813 (c); UBC-823 (d); UBC-836C (e) UBC-836T (f) Trên 20 giống thuốc (M= 1.0kb DNA marker Thứ tự lane là: Lane 1: K149; lane 2: K326;lane 3: BS2; lane 4: CB3; lane 5: D7; lane 6: k399; lane 7: NC102; lane 8: PVH2254; lane 9: KY14; lane 10: Orential; 11: C7-1; 12: CB1; lane 13: RG8; lane 14: VTL5H; lane 15:BS3; lane 16: C9-1; lane 17: RG81; lane 18: LS; lane 19: RMB34 lane 20: C176) Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 60 So với nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống thuốc kết sử dụng mồi ISSR mẫu giống thuốc thí nghiệm cho thông tin tính đa hình cao (tỷ lệ locus đa hình 95.2%) Sự khác biệt tỉ lệ locus đa hình giải thích khác kiểu gen mẫu giống thuốc lá, loại thị khác khác trình tự mồi Như vậy, mồi ISSR sử dụng nghiên cứu cho tiềm lớn ứng dụng thị ISSR đánh giá đa dạng nguồn gen thuốc Việt Nam Tổng số vạch băng thu 20 giống thuốc 768 Trong mồi UBC- 836C thu nhiều vạch băng với 207 vạch băng mồi UBC 813 cho số vạch băng 71 vạch băng Trung bình, mồi ISSR nhân lên 128 vạch băng tổng số 20 giống thuốc thu thập Sử dụng mồi ISSR khác trung bình thu 6.4 vạch băng giống, dao động khoảng 3.55 (mồi UBC- 813) đến 10.35 (mồi UBC- 836C) Trên locus, trung bình mồi cho số lượng vạch băng trung bình 11.97 vạch băng Mồi UBC- 836C cho số lượng vạch trung bình locus lớn với 14.79 vạch băng; mồi UBC- 823 cho số lượng vạch băng trung bình locus nhỏ với 10.38 vạch băng Tính đa hình mồi ISSR đánh giá thông qua giá trị PIC Giá trị PIC không liên quan đến tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà liên quan trực tiếp tới số lượng thể xuất phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ Giá trị PIC lớn đa hình cao ngược lại Đối với thị trội, giá trị PIC nằm khoảng – 0.5 Giá trị PIC mồi ISSR sử dụng nghiên cứu nằm khoảng 0.21 (mồi UBC-807) đến 0.33 (mồi UBC 836T), trung bình đạt 0.27 Chỉ số PIC thị ISSR sử dụng cho thấy mức độ đa dạng phân đoạn DNA mẫu giống thuốc tiến hành nghiên cứu mức đa dạng mồi ISSR Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 61 đa dạng di truyền 20 mẫu dòng, giống thuốc nhập nội có nguồn gốc khác Chỉ số Rp cho phép đánh giá khả mồi sử dụng để phân biệt kiểu gen khác (Prevost Wilkinson, 1999) Đối với mồi ISSR sử dụng phân tích 20 mẫu giống thuốc lá, số Rp dao động khoảng 7.10 – 20.70, đạt giá trị trung bình 12.8 Giá trị Rp lớn (20.70) thu sử dụng mồi UBC- 836C, đó, mồi UBC- 813 cho giá trị Rp thấp (7.10) (bảng 4.3) Bảng 4.3: Số lượng vạch băng, hàm lượng thông tin đa hình, khả phân tích mồi ISSR 20 mẫu thuốc thí nghiệm STT Mồi nbp npl nb rb/a rb/l PIC Rp UBC-807 11 10 115 5.75 10.45 0.21 11.50 UBC-809 13 13 156 7.80 12.00 0.27 15.60 UBC-813 71 3.55 11.83 0.28 7.10 UBC-823 8 83 4.15 10.38 0.27 8.30 UBC-836C 14 14 207 10.35 14.79 0.29 20.70 UBC-836T 11 10 136 6.80 12.36 0.33 13.60 Tổng 63 60 768 Trung bình 10.50 10.00 128.00 6.40 11.97 0.27 12.80 nbp: số lượng vị trí xuất vạch băng (locus); npl: số lượng locus đa hình; nb: số lượng vạch băng; rb/a: số lượng vạch băng trung bình/giống; rb/l: số lượng vạch băng trung bình locus; PIC (polymorphism information content): hàm lượng thông tin di truyền; Rp (resolving powder): khả biệt Khả phân biệt mẫu giống dựa vào kiểu gen mồi đánh giá dựa khả hình thành phân đoạn DNA đặc trưng cho giống Trong số thị ISSR sử dụng phân tích, thị (trừ mồi UBC- 836T) cho phân đoạn DNA đặc trưng (vạch băng xuất giống) với 10 phân đoạn DNA đặc trưng mẫu giống thuốc (D7 C9-1) Trong đó, giống D7 có phân đoạn mồi UBC 807, UBC 809, UBC 813 UBC- 836C, kích thước băng giao động từ 4001500bp Còn lại phân đoạn giống C9-1 nhân mồi UBC 823, kích thước băng giao động từ 600-1500bp (bảng 4.4) Mồi UBC- 836C hình thành Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 62 số phân đoạn số lượng vạch băng nhiều nhất, số PIC Rp đạt giá trị cao so với mồi ISSR sử dụng phân tích cho 1vạch băng đặc trưng giống D7 Bảng 4.4: Các thị ISSR cho vị trí băng đặc trưng dòng, giống thuốc thu thập Mồi ISSR UBC – 807 Số băng đặc Giống có băng Số băng đặc Kích thước băng trưng/mồi đặc trưng trưng/giống đặc trưng (bp) D7 1100 850 700 UBC – 809 D7 1200 500 400 UBC – 813 D7 400 UBC – 823 C9-1 1500 600 UBC – 836C D7 1500 Để tiếp tục tìm hiểu đa dạng di truyền nguồn gen 20 mẫu dòng, giống thuốc Việt Nam, tiến hành phân tích biểu đồ hình (hình 4.17) Sơ đồ biểu đồ phân cụm mẫu giống nghiên cứu cho thấy 20 mẫu giống thuốc phân thành nhóm rõ rệt độ tương đồng khoảng 70% Nhóm gồm 16 mẫu giống thuốc (K149, C7-1, NC102, PVH2254, KY14, Oriental, K399, CB1, RĐ8, BS3, C9-1, RG81, LS, RMB34, C176 VTL5H) , nhóm gồm mẫu giống K326, CB3 BS2 Nhóm gồm mẫu giống D7 (thuốc dại) Nhóm thứ chia thành phân nhóm mức tương đồng khoảng 80% (phân nhóm A, phân nhóm B phân nhóm C) Trong phân nhóm A gồm mẫu giống K149, C7-1, NC102, PVH2254, KY14, Oriental, K399, CB1, RĐ8, phân nhóm B gồm giống thuốc (BS3, C9-1, RG81, LS, RMB34, C176) Giống VTL5H phân thành phân nhóm C riêng biệt Như vậy, mẫu giống thuốc Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 63 Việt Nam, Brasil, Mỹ có mức độ tương đồng cao Kết phù hợp với giống nghiên cứu, giống thuốc Việt Nam chủ yếu chọn lọc lai tạo từ giống thuốc nhập nội Giữa chủng loại thuốc vàng sấy, thuốc nâu, Oriental, Burley thuốc lào có mức độ tương đồng cao, riêng có mẫu giống CB3 (giống địa phương) mức độ tương đồng so với giống khác giao động từ 0.40-0.69 Việc phân tích hệ số tương đồng cấp thông tin nhằm phục vụ cho chương trình tạo giống thuốc ưu lai, có tương quan khoảng cách di truyền (genetic distance - GD) biểu ưu lai sở xác định chiến lược tạo giống Hệ số tương đồng mẫu giống thuốc nằm khoảng 0.31 – 0.95 mẫu giống D7 khác biệt so với giống thuốc lại (hệ số tương đồng mẫu D7 với mẫu giống nghiên cứu nằm khoảng 0.31– 0.47) Như vậy, cần tiến hành đánh giá kiểu hình kiểu gen giống thuốc dại (D7) Nếu giống có chứa nguồn gen kháng bệnh quý sử dụng làm dòng bố/mẹ tổ hợp lai với mẫu giống nghiên cứu (0.31-0.48) Phân nhóm A Nhóm Phân nhóm B Phân nhóm c Nhóm Nhóm Hình 4.17: Quan hệ di truyền mẫu dòng, giống thuốc dựa thị ISSR Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 64 Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền 20 mẫu giống thuốc nghiên cứu Giống TL K149 K326 BS2 CB3 D7 K399 NC102 PVH2254 KY 14 Oriental C7-1 CB1 RĐ8 VTL5H BS3 C9-1 RG81 LS K149 1.00 K326 0.66 BS2 0.78 0.88 CB3 0.68 0.95 0.89 D7 0.37 0.40 0.37 0.38 K399 0.78 0.57 0.69 0.62 0.43 NC102 0.82 0.51 0.63 0.55 0.46 0.88 PVH2254 0.85 0.54 0.66 0.58 0.43 0.88 0.94 KY 14 0.83 0.52 0.65 0.57 0.45 0.86 0.95 0.95 Oriental 0.88 0.57 0.69 0.58 0.40 0.85 0.91 0.91 0.95 C7-1 0.91 0.63 0.75 0.68 0.40 0.85 0.88 0.91 0.89 0.91 CB1 0.82 0.63 0.69 0.65 0.43 0.78 0.82 0.88 0.86 0.88 0.85 RĐ8 0.83 0.65 0.77 0.66 0.42 0.77 0.77 0.83 0.82 0.86 0.86 0.80 VTL5H 0.72 0.66 0.69 0.65 0.46 0.66 0.66 0.69 0.71 0.72 0.72 0.78 0.71 BS3 0.77 0.52 0.62 0.57 0.48 0.80 0.86 0.83 0.82 0.80 0.80 0.74 0.72 0.65 C9-1 0.72 0.45 0.54 0.49 0.31 0.78 0.78 0.78 0.80 0.78 0.75 0.69 0.68 0.63 0.77 RG81 0.80 0.52 0.62 0.57 0.35 0.83 0.83 0.83 0.85 0.83 0.83 0.77 0.75 0.71 0.82 0.92 LS 0.82 0.57 0.66 0.58 0.34 0.82 0.78 0.82 0.80 0.85 0.81 0.78 0.77 0.72 0.83 0.88 0.95 RMB34 0.71 0.52 0.62 0.57 0.42 0.83 0.77 0.74 0.75 0.74 0.77 0.68 0.69 0.67 0.85 0.86 0.88 0.86 C176 0.80 0.65 0.71 0.69 0.35 0.77 0.77 0.77 0.78 0.77 0.86 0.74 0.78 0.68 0.78 0.77 0.85 0.80 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… RMB34 C176 0.81 1.00 65 Kết nghiên cứu cho thấy mức độ tương đồng giống thuốc sử dụng Việt Nam cao, chủng loại thuốc vàng mà với chủng loại Oriental, Burley, nâu, thuốc lào hệ số tương đồng di truyền với chủng thuốc vàng sấy cao Điều bất lợi cho công tác lai tạo giống thuốc để tạo dòng, giống có đặc điểm di truyền suất, chất lượng kháng sâu bệnh tốt Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Sử dụng cặp mồi NBS để phát nguồn vật liệu mang gen kháng TMV nhân đoạn DNA có kích thước mong muốn từ 20 mẫu giống thuốc nghiên cứu 5.1.2 Đã nhân dòng xác định trình tự nhân lên cặp mồi NBS182 cặp mồi NBS226 giống BS2 Sản phẩm nhân lên từ cặp mồi NBS 182 có trình tự tính đồng 94-96% với độ phủ 78-89% so với trình tự mã hóa vùng NBS protein kháng thuốc (N tabacum) ngân hàng gen NCBI Sản phẩm nhân lên từ cặp mồi NBS226 có kích thước 809bp, kích thước dự đoán trình tự mang tính đồng 9499% với độ phủ 96-100% so với trình tự mã hóa vùng NBS protein kháng thuốc ngân hàng gen Từ kết bước đầu khẳng định giống BS2 mang gen kháng TMV 5.1.3 Sử dụng mồi ISSR lập đồ hình xác định mối quan hệ di tuyền 20 giống thuốc thu thập, giống D7 có hệ số tương quan di truyền so với giống khác thấp (0.31- 0.48) Cả mồi sử dụng mồi đa hình sử dụng để phân biệt mẫu giống thuốc 5.2 Kiến nghị 5.2.1 Tiếp tục nghiên cứu mức độ phân tử gen N thuốc 5.2.2 Tiếp túc nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn giống lưu trữ sử dụng Việt Nam Đặc biệt nghiên cứu có mặt nguồn gen kháng bệnh từ nguồn gen thuốc dại D7 để khai thác chương trình chọn tạo giống thuốc Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Thị Bản (2007) Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh TMV ( bệnh khảm lá) Báo cáo khoa học đề tài cấp năm 2007, Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc Bản tin Tổng công ty thuốc Việt Nam số (2010) http://ww.vinataba.com.vn Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008 Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc làm sở dự báo nghiên cứu biện pháp phòng trừ phục vụ sản xuất thuốc nguyên liệu, Báo cáo khoa học Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc Hà Viết Cường (2008) Giáo trình bệnh nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Dự án giáo dục Đại học Việt Nam- Hà Lan Hà Viết Cường (2010) Bài giảng virus thực vật, phytoplasma viriod, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Phạm Thị Hạnh, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ (2007) Tạo thuốc kháng thuốc trừ cỏ côn trùng, Hội nghị khoa học công nghệ, Phòng Công nghệ gen thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, tr: 351-355 Trần Thị Thanh Hảo (2009) Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen kháng sâu vip3A Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Viện Kinh tế kỹ thuật Thuốc Trần Đăng Kiên (2011) Giáo trình thuốc lá, Tổng công ty thuốc Việt Nam Vũ Triệu Mân (2007) Giáo trình Bệnh chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 10 Hoàng Thị Sản (1999) Phân loại học thực vật, Nhà xuất giáo dục Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 68 11 Lê Đình Thụy Phạm Kiến Nghiệp (1996) Thuốc trồng chế biến, Nxb Tp Hồ Chí Minh 12 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi, Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A): 679-687 13 Phạm Thị Vân (2009) Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm virus kỹ thuật RNAi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật Tiếng Anh 14 Allard H.A.(1914) The mosaic disease of tobacco U.S Dept Agr Bull.40 15 Bendahmane A., Konstantin Kanyuka, and David C Baulcombe (1999) The Rx Gene from Potato Controls Separate Virus Resistance and Cell Death Responses Plant Cell, Vol 11: 781-792 16 Bent A (1996) Plant Disease Resistance Genes: Function Meets Structure Plant Cell 8:1757–1771 17 Cao H., Glazebrook J., Clarke J.D., Volko S., Dong X.(1997) The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats Cell 88: 57- 63 18 Century K.S., Shapiro A.D., Repetti P.P., Dahlbeck D.,Holub E., Staskawicz B.J (1997) NDR1, a pathogen-induced component required for Arabidopsis disease resistance.Science 278: 1963-1965 19 Csillery, G., Obias T., I & Rusko, J 1983 A new pepper strain of tomato mosaic virus Acta Phytopathol Acad Sci Hung 18:195-200 20 Culver J.N., Lindebeck A.G.C & Dawson W.O (1991).Virus- host interactions: induction of chlorotic and necrotic responses in plants by tobamoviruses A Rev Phytopathol 29:193-21 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 69 21 Dangl J.L., Dietrich R.A & Richberg M.H (1996) Cell Death Programs in Plant-Microbe Interactions Plant Cell 8:1793–1807 22 Dawson W.O & Hilf M.E (1992) Host-range determinants of plant viruses.A.Rev Plant Physiol PlantMol.Biol 43: 527-555 23 Denduangboripant J., S Setephan, W Suwanprasart, and S Panha (2010) Determination of local tobacco cultivars using ISSR molecular marker Chiang Mai Journal Science 37: 293-303 24 Dietrich R.A., Richberg M.H., Schmidt R., Dean C., Dangl J.L (1997) A novel zinc-¢nger protein is encoded by the Arabidopsis LSD1 gene and functions as a negative regulator of plant cell death Cell 88: 685694 25 Dinesh- Kumar, S.P., Wai- HongTham and Barbara J.Baker, (2000) Structure- funcion analysis of the tobacco mosaic virus resistance gene N PNAS Vol.97, no.26:14789- 14794 26 Dinesh-Kumar S.P., Whitham S., Choi D., Hehl R., Corr C & Baker B (1995) Transposon tagging of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Its possible role in the TMV-N mediated signal transduction pathway Proc Natl Acad Sci USA 92: 4175–4180 27 Ellis J & Jones D (1998) Structure and function of proteins controlling strain-specific pathogen resistance in plants Curr Opin Plant Biol 1:288–293 28 Ellis, J G., Lawrence, G J., Luck, J E & Dodds, P N (1999) Identification of Regions in Alleles of the Flax Rust Resistance Gene L That Determine Differences in Gene-for-Gene Specificity Plant Cell 11:495–506 29 Erickson F.L., Dinesh-Kumar S.P., Holzberg S., Ustach C.V., Dutton M., Handley V., Corr C and Baker B.J (1999) Interactions between Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 70 tobacco mosaic virus and the tobacco N gen The royal Society Phil.T rans R Soc Lond B 354: 653- 658 30 Flor H (1971) Current status of the gene-for-gene concept Phytopathol 9:275- 296 31 Gao J.S., Meng Y., Sasaki N., Kanegae H., Hayashi N., and Nyunoya H (2010) Characterization and cloning of TMV resistance gene N homologues from Nicotiana tabacum African Journal of biotechnology Vol 9(47), pp:7998-8006 32 Ghislain M., Zhang D., Fajardo D., Huamann Z., Hijmans R.H (1999) Marker-assisted sampling of the cultivated Andean potato Solanum phureja collection using RAPD markers Genet Resour Crop Ev., 46: 547-555 33 Goodspeed T.H (1954) The genus nicotiana Chronica Botanica, Waltham,MA 34 Greenberg J.T (1997) Programmed cell death in plant-pathogen nteractions A Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 525-545 35 Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A., (1983) A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid Nature 303 (5913):179180 36 Holmes F.O (1938) Inheritance of resistance to tobacco-mosaic disease in tobacco Phytopathology 28: 553- 561 37 Keen N.T & Dawson W.O (1992) Pathogen avirulence genes and elicitors of plant defense In Plant gene research: genes involved in plant defense New York: Springer pp: 85- 106 38 Keen N.T (1990) Gene-for-gene complementarity in plant- athogen interactions A Rev Genet 24: 447- 463 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 71 39 Lamb C.J (1994) Plant disease resistance genes in signal percep-tion and transduction Cell 76: 419-422 40 Lamb C.J., Lawton M.A., Dron M & Dixon R.A (1989) Signals and transduction mechanisms for activation of plant defenses against microbial attack Cell 56: 215-224 41 Leng X., Xiao B., Wang S., Gui Y., Wang Y., Lu X., Xie J., Li Y , Fan L (2009) Identification of NBS-Type Resistance Gene Homologs in Tobacco Genome Plant Mol Biol Rep DOI 10.1007/s11105-009-0134-z 42 Liu X.Z., and H.Y Zhang (2008) Advance of molecular marker application in the tobacco research Afican journal of Biotechnology 7:4827-4831 43 Michal Levy, Orit Edelbaum, and Ilan Sela.(2004) Tobacco Mosaic Virus Regulates the Expression of Its Own Resistance Gene N1 Plant Physiol Vol 135 44 Moon H.S., Nifong J.M., Nicholson J.S., Heineman A., Lion K., van der Hoeven R., Hayes A.J., Lewis R.S.(2009) Microsatellite-based analysis of tobacco (Nicotiana tabacum L.) genetic resources Crop Sci, 49(6):2149–2159 45 Parker J., Holub E., Frost L., F alk A., Gunn N., Daniels M (1996) Characterization of eds1, a mutation in Arabidopsis suppressing resistance to Peronospora parasitica specifed by several diferent RPP genes Plant Cell 8:2033-2046 46 Piteekan T., Denduanboripant J and Suwanprasat W (2009) Development of AFLP Molecular Marker for Variety Identification of Tobacco Leaves The 4th Conference on Science and Technology for Youth, 26:37 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 72 47 Prevost A., Wilkinson M.J (1999) A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars Theor Appl Genet., 98 (1):107-112 48 Rohlf, F.J (1998) NTSYS-PC Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.1 Exeter Software, Setauket, NY 49 Rommens C.M.T., Salmeron J.M., Oldroyd G.E.D., Staskawicz B.J (1995) Intergeneric transfer and functional expression of the tomato sease resistance gene Pto Plant Cell 7:249-257 50 Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.Y., Hunt M.D (1996) Systemic acquired resistance Plant Cell 8: 1809-1819 51 Sarala K., and Rao R.V.S (2008) Genetic diversity in Indian FCV and burley tobacco cultivars Journal of Genetics 87:159-163 52 Saraste M., Sibbald P.R and Wittinghoper A (1990) The P- loop- a commom motif in ATP and GTP- binding proteins Trends Biochem Sci 15: 430-434 53 Scholthof K-B.G (2000) Tobacco mosaic virus The Plant Health Instructor DOI: 10.1094/PHI-I-1010-01 54 Simons G., Groenendijk J., Wijbrandi J., Reijans M., Groenen J., Diergaarde P., Theo Van der Lee T., Bleeker M., Onstenk J., Both M., Haring M., Mes J., Cornelissen B., Zabeau M., and Vos P (1998) Dissection of the Fusarium I2 Gene Cluster in Tomato Reveals Six Homologs and One Active Gene Copy Plant Cell, Vol 10:1055-1068 55 Smith J.S.C., Chin E.C.L., Shu H., Smith O.S., Wall S.J., Senior M.L., Mitchell S.E., Kresovich S and Zeigle J (1997) An evaluation of the utility of SSR loci as molecular markers in maize (Zea mays L.): comparisions with data from RFLPs and pedigree Theor Appl Genet., 95 (1-2):163-173 Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 73 56 Smith, H.H (1979) The genus as a genetic resource in Nicotinana: Procedures for Experimental Use United States Department of Agriculture Technical bulletin number 1586 57 Thilmony R.L., Chen Z., Bressan R.A., Martin G.B.(1995) Expression of the tomato Pto gene in tobacco enhances resistance to Pseudomonas syringae pv tabaci expressing avrPto.Plant Cell 7:529-1536 58 Tobias I., Rast B & Maat D.Z (1982) Tobamoviruses of pepper, eggplant, and tobacco: comparative host reactions and serological relationships Netherlands J Plant Pathol 88: 257-268 59 Warren R.F., Henk A., Mowery P., Holub E., Innes R.W (1998) A mutationwithin the leucine-rich repeat domain of the Arabidopsis disease re-sistance gene RPS5 partially suppresses multiple bacterial and downy mildew resistance genes Plant Cell 10: 1439–1452 60 Whitham S., McCormick S., Baker B (1996) The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in trans-genic tomato Proc atl Acad Sci USA 93: 8776-8781 61 Yu I., Parker J., Bent A.F (1998) Gene-for-gene disease without the hypersensitive response in Arabidopsis dnd1 mutant Proc Natl Acad Sci USA 95:7819–24 62 Zhang H.Y., Liu X., He Z., Zheng C.M (2005) Random amplified DNA polymorphism of Nicotiana tabacum L cultivars Biologia Plantarum 49: 605-607 63 Zhang H.Y., Liu X.Z., He C.S., and Yang Y.M.(2008) Genetic diversity among flue-cured tobacco cultivars based on RAPD and AFLP markers Brazilian archives of biology and technology 51: 1097-1101 64 www.fermentas.com 65 www.pdb.org/pdb/education_discussion/molecule_of_the /tmv.pdf Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 74 [...]... cứu và chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam - Giai đoạn từ năm 1990 trở về trước + Trước năm 1990 tại phía Bắc Việt Nam, các giống thuốc lá vàng sấy được trồng là những giống thuốc lá giống cũ có nguồn gốc Trung Quốc được du nhập vào Việt Nam như Đại kim tinh, Trung hoa bài 1, Trung hoa bài 2, Bắc Lưu, một số giống của địa phương như Cao Bằng 2, Cao Bằng 3, Ninh Bình 1 Ở phía Nam chủ yếu trồng giống thuốc. .. hai giống K326 và C176 đang chiếm khoảng 50% di n tích trồng thuốc lá + Từ năm 1997, Viện bắt đầu tiến hành công tác tạo chọn giống thuốc lá trong nước với hai hướng chọn lọc các giống nhập nội, chọn tạo giống thuần và giống lai Một loạt các giống nhập nội, giống địa phương được sử dụng làm nguồn vật liệu lai, song chỉ có các cặp lai giữa các giống mới được nhập nội là mang lại hiệu quả Trong một thời... các dòng, giống thuốc lá nhập nội và chọn tạo trong nước làm cơ sở cho phát triển giống mới bằng phương pháp truyền thống kết hợp chỉ thị phân tử 1.2.2 Yêu cầu - Thu thập nguồn gen cây thuốc lá hiện đang lưu giữ và sử dụng ở Việt Nam, tập trung vào các dòng, giống triển vọng về năng suất, chất lượng và kiểu hình kháng bệnh hại - Phát hiện được nguồn gen kháng virus TMV từ các nguồn gen thu thập bằng chỉ. .. thái và trồng trọt trong nước hoặc được tách dòng từ con lai F1 Việc sử dụng các dòng thuần nhập nội để lai chéo cũng đã được khai thác và tạo ra một số tổ hợp lai triển vọng sau quá trình chọn lọc Một điều đáng chú ý là công tác chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam được thực hiện bởi Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá, thuộc Tổng công ty Thuốc lá Việt Nam và chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc truyền. .. Vân Nam Trung Quốc (nơi chiếm 1/3 di n tích trồng thuốc lá của TQ) giống được trồng chủ yếu là giống K326, Đại Kim Nguyên hoa đỏ và V2 (giống K326, V2 được nhập từ M ) Sau đó Trung Quốc tiến hành công tác lai tạo giống một cách mạnh mẽ, các giống mới được ra đời trong đó có hai giống đang trồng rộng rãi là giống Vân Nam 85, Vân Nam 317 Hiện nay, tỉnh Vân Nam trồng 2 giống thuốc lá K326 và Vân Nam 85... Công ty thuốc lá Việt Nam đã giao nhiệm vụ cho Viện KT – KT Thuốc lá (Viện) lưu giữ nguồn giống trên và tiến hành đánh giá chọn lọc tại các vùng sinh thái khác nhau trên toàn quốc Kết quả sau nhiều năm chọn lọc, đánh giá các giống nhập nội, Viện đã chọn ra hai giống thuốc C176, K326 phù hợp với điều kiện khí hậu cả hai miền Nam và Bắc, có năng suất đạt trên 1,8 tấn / ha và chất lượng thuốc lá nguyên... các nguồn gen thu thập bằng chỉ thị phân tử - Phân tích được mối quan hệ di truyền của các dòng /giống thu thập bằng chỉ thị ISSR 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Các thông tin về đa dạng di truyền và nguồn gen kháng virus TMV ở mức phân tử là những dẫn liệu quan trọng, lần đầu tiên được nghiên cứu trên các dòng, giống nhập nội và chọn tạo tại Việt Nam Các thông tin này sẽ là những... chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử nguồn gen thuốc lá tại Việt Nam, đồng thời bước đầu nghiên cứu phát hiện nguồn gen N kháng bệnh TMV Các kết quả của đề tài sẽ đặt nền móng cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống thuốc lá với các đặc tính mong muốn 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích Phân tích được đa dạng nguồn gen ở mức phân tử và xác định được nguồn gen... yếu trồng giống thuốc lá nâu Riogrand, giống thuốc lá vàng sấy được trồng là giống Vĩnh Hảo Các giống thuốc lá trên đều cho năng suất thấp, chất lượng kém, đặc biệt là khả năng chống chịu sâu bệnh kém Trước tình hình các giống thuốc lá trên không đáp ứng được yêu cầu của ngành thuốc lá, Hiệp hội Thuốc lá Việt Nam đã nhập một loạt các giống thuốc Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ... Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Gia Lai, Đắc Lắc Thuốc lá được nhập trồng lâu đời vào Việt Nam Nhiều giống đã không còn rõ nguồn gốc và được xem như là các giống địa phương Trong những năm gần đây, Việt Nam đã chú trọng hơn đến công tác phát triển giống mới Các giống thuốc lá thuần hoặc lai được nhập nội, sau đó các vật liệu này được tiếp tục chọn lọc qua nhiều năm (đối với giống thuần chủng) để chọn ... cứu chọn tạo giống thuốc Việt Nam - Giai đoạn từ năm 1990 trở trước + Trước năm 1990 phía Bắc Việt Nam, giống thuốc vàng sấy trồng giống thuốc giống cũ có nguồn gốc Trung Quốc du nhập vào Việt Nam. .. chọn giống thuốc nước với hai hướng chọn lọc giống nhập nội, chọn tạo giống giống lai Một loạt giống nhập nội, giống địa phương sử dụng làm nguồn vật liệu lai, song có cặp lai giống nhập nội mang... cứu sử dụng thị phân tử đánh giá đa dạng nguồn gen thuốc Sự phát triển không ngừng kỹ thuật sinh học phân tử tạo tiến vượt bậc nhân loại nghiên cứu di truyền chọn tạo giống Các thị di truyền liên