Xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa xanthomonas oryzae pv oryzae ở miền bắc việt nam bằng chỉ thị phân tử

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử DNA, Protein hay Isozyme xác định đa dạng di truyền các chủng được ápdụng và gặt hái nhiều thành côn

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Mục lục 1

Danh mục các chữ viết tắt ii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Tóm tắt vi

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 3

1.2 Mục đích và yêu cầu 5

1.2.1 Mục đích 5

1.2.2 Yêu cầu 5

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Bệnh bạc lá lúa 6

2.1.1 Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lá lúa 6

2.1.2 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá 6

2.1.3 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 7

2.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển 7

2.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh 7

2.1.4 Chẩn đoán bệnh bạc lá 8

2.1.5 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá 8

2.2 Vi khuẩn Xoo 8

2.2.1 Đặc điểm đặc trưng 8

2.2.2 Đặc điểm bộ genom Xoo 9

2.2.2.1 Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018 9

2.2.2.2 Cấu trúc genom Xoo chủng KACC10331 10

2.2.2.3 Cấu trúc genom Xoo chủng PXO99A 11

2.2.3 Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related genes) 12

2.2.4 Trình tự lặp lại (Repeitive sequence) trong bộ gen vi khuẩn Xoo 16

2.3.1 Định nghĩa đa dạng di truyền 17

2.3.2 Thành phần chủng Xoo 17

2.3.2.1 Trên thế giới 17

2.3.2.2 Tại Việt Nam 18

2.3.3 Các nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo 19

2.3.3.1 Các loại chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 19

2.3.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo trên thế giới 19

2.3.3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo tại miền Bắc Việt Nam 20

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Vật liệu nghiên cứu 21

3.2 Phương pháp nghiên cứu 22

3.2.1 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn 22

3.2.2 Phương pháp xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR 23

3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 24

3.2.5 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử DNA xác định thành phần chủng vi khuẩn Xoo 26

3.2.6 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 27

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả phân lập, nuôi cấy và xác định chính xác vi khuẩn Xoo 29

4.1.1 Kết quả phân lập và nuôi cấy 29

4.1.2 Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR 29

4.2 Kết quả nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của các mẫu vi khuẩn 31

4.3 Kết quả xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp Rep - PCR 34

4.4 Kết quả lây nhiễm nhân tạo 38

4.5 Mối quan hệ giữa sinh trưởng và tính gây bệnh của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu: 40 4.6 Kết quả so sánh 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng các mẫu Xoo nghiên cứu 41 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 46

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Oryzae (Xoo) gây ra là

bệnh nhiệt đới điển hình của các vùng trồng lúa, đặc biệt ở những vùng thâm canh cao

Ở miền Bắc nước ta, bệnh gây hại cả vụ xuân lẫn vụ mùa và hại trên nhiều giống khácnhau, đặc biệt đối với vụ mùa và trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Bên

cạnh đó, các chủng vi khuẩn Xoo ngày càng phong phú và phức tạp, cả về thành phần

loài và tính độc Để phòng trừ bệnh bạc lá người ta đã sử dụng nhiều biện pháp khácnhau như: dùng thuốc hóa học; bón phân sớm, cân đối; vệ sinh đồng ruộng; mật độgieo trồng hợp lý; dùng giống kháng bệnh Trong đó sử dụng giống kháng bệnh làmột trong những giải pháp rất quan trọng, có hiệu quả kinh tế, không gây ảnh hưởngtới chất lượng nông sản và an toàn với người sử dụng, không gây ô nhiễm môi trường

Muốn tạo giống kháng bệnh bền vững thì trước hết phải có nguồn gen khánghữu hiệu, phải xác định chính xác số lượng và thành phần chủng loài gây bệnh hiện có

ở mỗi vùng Tuy nhiên, một gen kháng có thể kháng được chủng này nhưng lại khôngkháng được chủng khác, chủng này nhiễm được trên giống lúa này nhưng giống lúakhác không bị nhiễm Vì vậy để tạo giống kháng bạc lá bền vững cần lai quy tụ nhiềugen kháng vào trong một giống luá Hiện nay người ta đã phân lập được hơn 30 chủng

vi khuẩn Xoo, tương ứng đã xác định được hơn 30 gen kháng bệnh bạc lá khác nhau Ở

mỗi nước có một số chủng gây bệnh nhất định, ở Philippin có 6 chủng, Ấn Độ có 9chủng, Nhật Bản có 12 chủng Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 đã phân lập được 12

chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam trên cơ sở lây nhiễm trên các dòng đẳng gen, dựa

vào phổ kháng nhiễm đã tạm thời phân ra ở miền Bắc tồn tại 10 chủng; đồng thời đã

xác định được 4 gen kháng hữu hiệu là Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 kháng mạnh và kháng

được hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập Nếu đúng như vậy thì việc chọn tạo giống

lúa kháng bệnh bạc lá chỉ cần đưa 1 gen Xa4, xa5, Xa7, hoặc Xa21 vào một giống, khi

đó công việc dễ dàng hơn nhiều so với chuyển đa gen kháng Tuy nhiên có phải các

đó chưa chính xác? Vì vậy vấn đề xác định chính xác mức độ đa dạng thành phần

chủng vi khuẩn Xoo thực sự cần thiết để tạo giống lúa kháng bạc lá bền vững.

Theo phương pháp truyền thống, để xác định thành phần chủng, tiến hành phânlập vi khuẩn từ lá bị bệnh, sau đó lây nhiễm nhân tạo trên dòng đẳng gen, trên cơ sởphổ kháng nhiễm phân ra các chủng Tuy nhiên, do phương pháp lây nhiễm nhân tạo

có một số nhược điểm như phụ thuộc vào thời tiết, địa hình, tốn thời gian, nhiều khikết quả thu được chưa thật chính xác Để khắc phục nhược điểm trên thì cần thiết phảixác định một cách chính xác sự đa dạng di truyền giữa các chủng ở mức phân tử

Trên thế giới đã có khá nhiều công trình nghiên cứu xác định thành phần cácchủng vi sinh vật gây bệnh Lee và cộng sự 2005 lần đầu tiên công bố đã xác định

được trình tự của genome vi khuẩn Xoo, vòng genome dài 4,9 triệu bp Đã xác định được những vùng gen bảo thủ đặc trưng cho vi khuẩn Xoo và vùng biến động nhiều

giữa các chủng Đồng thời xác định được các phổ enzyme, phổ protein của vi khuẩn

Xoo Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, phương pháp sử dụng chỉ thị

phân tử (DNA, Protein hay Isozyme) xác định đa dạng di truyền các chủng được ápdụng và gặt hái nhiều thành công

Nghiên cứu của Phan Thanh Tùng 2008 sử dụng kỹ thuật rep-PCR và IS-PCR

đã xác định đa dạng một số chủng vi khuẩn thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Namnăm 2007, và so sánh với các chủng do Phan Hữu Tôn và cs thu thập 2002; kết quảcho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và

đa dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn Xoo

đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đó có kế hoạch chọntạo giống kháng bệnh bền vững Do đó việc thu thập mẫu bệnh mới và phân loại chúng

là công việc cần phải làm thường xuyên Vì vậy được sự hướng dẫn của bộ mônCNSHƯD, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae ở miền Bắc Việt Nam bằng chỉ thị phân tử”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức phân tử DNA các mẫu vi khuẩn Xoo, từ đó

phân chia thành các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

1.2.2 Yêu cầu

- Nuôi cấy, tách chiết DNA vi khuẩn và xác định chính xác các mẫu vi khuẩn

Xoo nghiên cứu.

- Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Xoo bằng phương

pháp đo OD

- Sử dụng kỹ thuật rep-PCR để xác định đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn

Xoo, trên cơ sở đó phân chia ra các chủng.

- Lây nhiễm các dòng đẳng đơn gen, đa gen, xác định tính độc của mẫu vikhuẩn và phổ kháng nhiễm

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh bạc lá lúa

2.1.1 Lịch sử, tầm quan trọng bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm 1884.Ban đầu người ta lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất(Bokura, 1911) Nhưng không lâu sau đó, người ta đã công nhận nguyên nhân của nó

là do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama, 1922 thuộc loại Bacillus oryzae Vi khuẩn này sau đó được Mizukami, Wakimoto, 1969 đặt tên là Pseudomonas oryzae, cuối cùng Oku, 1972 đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên.

Bệnh bạc lá lúa trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên khắp thế giớivào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt trên các nước trồng lúa

ở Châu Á như: Indonexia (1950), Philippin (1957), Trung Quốc (1957), Ấn Độ (1990)

2.1.2 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá

Vi khuẩn Xoo gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa là: bạc lá, vàng

nhợt, héo xanh (còn được gọi là Kresek) Cho đến nay mối quan hệ giữa 3 triệu chứngnày vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhiều thí nghiệm trong nhà lưới đã chứng minh hiệntượng Kresek và bạc lá khác nhau rõ rệt mặc dù chúng đều là triệu chứng ban đầu của

sự nhiễm bệnh

Khi bị bệnh, trên lá vết bệnh lan dần từ mép lá vào phiến lá, kéo dài theo gânchính, có khi vết bệnh từ ngay giữa phiến lá lan rộng ra Vết bệnh lan từ mép ngoàivào gân lá theo đường gợn sóng Vào lúc trời ẩm hoặc buổi sáng sớm, đầu hoặc mép lá

có dạng giọt vi khuẩn dịch màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn

Hình 2.1 Triệu chứng, dấu hiệu bệnh bạc lá lúa 2.1.3 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh

2.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển

Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc Bệnh pháttriển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90%, đặc biệt khi có mưa

to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan Vì thế vụ mùa bệnhthường gây tác hại nặng hơn vụ xuân

Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa

vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá

Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa vàđiều kiện tự nhiên của mỗi vùng

2.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh

Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh

Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc

lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lákhiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh,tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng

Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh pháttriển của bệnh Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bịtổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh

Đất màu mỡ, nhiều chất hữu cơ; đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị chebóng, bệnh cũng phát triển mạnh hơn

method); phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Xoo

XOR-R2 và XOR-F

Trong số các phương pháp kể trên thì phương pháp xác định vi khuẩn Xoo bằng

kỹ thuật PCR là tiên tiến và cho kết quả chính xác nhất Phương pháp này khắc phụcđược những nhược điểm của các phương pháp khác và là phương pháp thích hợp được

sử dụng trong điều kiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

2.1.5 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá

Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốctrừ bệnh, bón phân đúng cách, thích hợp, điều chỉnh mực nước hợp lý và trồng giốngkháng bệnh Ngoài ra còn có biện pháp xử lý hạt giống trước khi gieo Cho đến nay,biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi là biện pháp có hiệu quả và khả thinhất

2.2 Vi khuẩn Xoo

2.2.1 Đặc điểm đặc trưng

Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu hơi tròn,

có một lông roi ở một đầu, kích thước 0.7-2 x 0,4-0,7 µm Trên môi trường nhân tạokhuẩn lạc cầu vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp (do hình thành sắc tố

xanthomonadin), rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm Xoo tạo

nhiều polysacharide ngoại bào EPS, có vai trò quan trọng trong việc hình thành giọtdịch vi khuẩn trên lá bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô và tạo điều kiện cho vi khuẩnphát tán nhờ gió, mưa Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoágelatin, không tạo NH3, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axít trong môi trường

có đường Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng từ 26 - 300C, nhiệt độ tối thiểu

0 - 50C, tối đa 400C nếu cao hơn 530C sẽ làm vi khuẩn chết Vi khuẩn có thể sống trongphạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2.

Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Xoo và khuẩn lạc Xoo trên môi trường nhân tạo 2.2.2 Đặc điểm bộ genom Xoo

Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn Xoo, trong đó gần đây nhất là công trình nghiên cứu giải mã cấu trúc genom của ba chủng

phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản) và KACC10331 (Hàn Quốc),PXO99A (Philippin)

2.2.2.1 Cấu trúc genom Xoo chủng MAFF311018

Cấu trúc genom nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018 thể hiện bằng

tám vòng tròn Vòng ngoài cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị

100 kb, vòng thứ 2 và 3 biểu hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khácnhau tương ứng Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, genchưa xác định rõ chức năng được ký hiệu màu xanh Vòng tròn thứ tư biểu hiện vị trí

tụ tập của các gen hrp và những gen gây độc avr ký hiệu màu xanh Vòng tròn thứ

năm biểu hiện vị trí của các trình tự gắn chèn Vòng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + Gcủa mỗi trung bình 20kb của mỗi đoạn Vòng số bẩy biểu hiện vị trí của các gen mãhóa tạo ra tRNA và rRNA của vi khuẩn Cuối cùng là vòng số tám biểu hiện vị trí củacác prophage cùng các gen của phage

Hình 2.3 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018.

Theo đó genom của Xoo chủng MAFF311018 gồm một nhiễm sắc thể vòng dài

4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7% Bên trong không pháthiện thấy có chứa một thể plasmid nào Trong đó phát hiện thấy có hai bản copy của

operon rrn và thứ tự liền kề một số gen như sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S.Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành các tRNAs đại diện cho 43 loại tRNAkhác nhau

Trong tổng số 4.372 khung đọc mở được phát hiện (ORFs) trong genom chủngMAFF311018 thì có 2.799 (64%) gen đã xác định được chức năng, 1.383 (32%)

proteins được xác định tương đồng với nhiều protein điển hình của vi khuẩn Xoo

nhưng chưa biết rõ chức năng Có 190 gen (4%) được xác định là không tương đồng rõrệt với những gen đã được xác định và công bố trước đó của vi khuẩn

2.2.2.2 Cấu trúc genom Xoo chủng KACC10331

Theo Lee và cộng sự, 2005 thì genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có cấu

trúc như sau: tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439bp, với hàm lượng C + Gchiếm 63.7% Genom có 4637 khung đọc mở, trong đó có 3340 (72.0%) có thể xác

loài vi khuẩn X axonopodis pv citri (Xac) và X.campestris pv campestris (Xcc) Tuy nhiên, 245 gen được xác định là chỉ đặc thù đối với Xoo, trong đó có 8 gen gây độc.

Đồng thời nhóm tác giả còn xác định được vị trí của cả những gen tạo phản ứng siêu

nhạy (hrp), những gen sinh ra vỏ polysaccharide, gen mã hóa tạo enzyme phân rã

màng tế bào thực vật Điều này giúp chúng ta hiểu rõ được cơ chế tương tác giữa vi

khuẩn Xoo gây bệnh đối với ký chủ họ hòa thảo.

Hình 2.4 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331.

2.2.2.3 Cấu trúc genom Xoo chủng PXO99A

Đây là công bố mới nhất về trình tự genome của vi khuẩn Xoo được tiến hành

bởi Steven L Salzberg và cộng sự Bộ genom PXO99A là bộ nhiễm sắc thể vòng đơngồm 5,240,075bp, dài hơn genom hai chủng trước (4,941,439bp và 4,940,217bp), hàmlượng G + C chiếm 63.6%, chứa 5083 gen mã hóa protein, trong đó 87 gen không có ởKACC10331 hay MAFF311018, có 2 operon RNA ribosome, 55 tRNA PXO99A gồm

có một số lượng lớn tính độc liên quan đến hoạt động phiên mã - các gen giống nhưeffector và có ít nhất 10 vùng NST được sắp xếp lại so với genome của hai chủng

của các trình tự chèn PXO99A gồm nhiều bản copy của các trình tự chèn khác nhau.Một vùng CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats) mở ranhanh chóng ngăn cản sự nhiễm thực khuẩn thể đối với chủng PXO99A.

Hình 2.5 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng PXO99A

2.2.3 Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related

genes)

- Nhóm gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity):

Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen hrp mã hóa cho hệ thống tiết loại III (TTSS) đóng vai trò quan trọng nhất Nhóm gen hrp tìm thấy trong genom Xoo gồm 27 gen kí hiệu từ hpa2 đến hpaF và chúng có cấu trúc tương đồng với cấu trúc của những gen này ở những vi khuẩn thuộc loài Xanthomonas, trừ trường hợp

ở vùng hrpE2 của gen hpaB và vùng hrpF Trong genom vi khuẩn Xoo, thấy có 3 gen

đặc thù được phát hiện giữa gen hpaB và hrpF Một gen định vị tại phần sau của genhpaB (hrpE2) và có cùng hướng phiên mã với operon hrpE Hai gen còn lại cũng nằm

ở vùng sau của hpaB (hrpE2), nhưng hướng phiên mã theo chiều ngược lại Theo sơ

đồ này có 4 tương đồng chuyển vị liên tục nằm ở vùng giữa hpaB và hrpF là ISXo8, ISXo1, ISXo8 và ISXoo6.

Hình 2.6 So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp của 3 loài vi khuẩn

Xoo, Xcc và Xac.

A Tổ chức di truyền của những gen bình thường

B Những vùng biến động của nhóm gen hrp Mỗi một gen có tên nằm trên hoặcdưới các mũi tên Bản đồ được biểu diễn dựa trên số liệu trình tự các Nucleotit đượcxác định trong ngân hàng gen (GenBankdatabase) Trình tự được xác định trên cơ sở

sử dụng các gen của chủng X axonpodis pv citri - Xac 306 (kí hiệu AE008923) và gen của chủng X campestris pv campestris - Xcc ATCC 33913 (kí hiệu AE008922).

- Gen điều hòa HrpX

Trong vi khuẩn Xanthomonas, sự biểu hiện của một số gen cấu trúc TTSS và một số gen hiệu ứng được điều hòa bởi sản phẩm của các gen hrpG và hrpX, các gen sản phẩm này đều có mặt ở cả 2 loại vi khuẩn Xac và Xcc Một số gen hoạt động phụ thuộc vào gen HrpX đều cùng chứa một trình tự giống nhau là: TTCGC…N15…

TTCGC, gọi là hộp PIP (PIP box) Hộp PIP này là một chỉ tiêu để phán đoán liệu gen

nào đó có bị điều khiển bởi gen HrpX hay không Đặc biệt đối với những gen mã hóa tạo ra các protein hiệu ứng Trong vi khuẩn Xoo, người ta đã phát hiện có 37 bản copy

vùng điều khiển của gen Năm trong số đó nằm ở cụm tụ điểm của các gen hrp, số

còn lại nằm rải rác ở vùng khác trong genom

Bảng 2.1 Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX trong genom Xoo

- Nhóm gen avr (avirulence)

Protein không gây độc thuộc hệ thống tiết loại III, chúng kích thích khả năngkháng bệnh trong cây tương ứng có những gen kháng bởi vậy chức năng của nó đượcxác định mang tính đặc thù theo giống lúa và chủng gây bệnh Chủng MAFF311018biểu hiện mức độ đặc thù theo kí chủ giống lúa rất cao Nó chứa một số các gen không

gây độc Vi khuẩn Xoo chứa rất nhiều bản copy các thành viên trong họ gen không độc avrBs3/pth Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 – 23 các

chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhậpnhân (NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (AD) Cấu trúc này chứng tỏ các proteinnày hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ

Trong genom vi khuẩn Xoo, nhóm tác giả đã phát hiện có 17 bản copy phân bố và tụ

tập tại 7 vùng genom khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây:

Bảng 2.2 Bảng liệt kê 17 bản copy các thành viên trong họ gen avrBs3/pth

Mặc dù chúng có trình tự khá giống nhau nhưng chúng hoàn toàn phân biệtđược với nhau bởi sự khác nhau chủ yếu ở số lượng các đoạn lặp lại nằm ở vùng trung

tâm Số lần lặp lại biến động từ 12,5 đến 31,5 và từ 2 đến 4 gen avr hầu hết nằm ở

những vùng không gây độc, và những yếu tố di động như IS và những gen có liênquan đến phage được định vị ở những vùng bên cạnh Vị trí của những gen không gây

độc này được trình bày ở hình dưới Riêng vùng avrV, chúng bị ngắt quãng bởi một gen di động là ISXoo9 nằm ở đầu 3’ Hướng phiên mã của gen không độc avr ở vùng I,

II và III là sợi anti-sense, nhưng đối với vùng IV, VI và VII là sợi sense theo hướngngược lại

Vị trí tương đối của mỗi vùng và chiều dài của mỗi gen như sau: vùng I dài1,228,783-1,246,335bp; II, 2,201,149-2,216,771 bp; III, 2,352,186-2,360,329 bp; IV,2,383,115-2,392,653 bp; V, 2,999,333-3,001,924 bp; VI, 3,213,703-3,234,123 bp; vàvùng VII dài 4,525,416-4,529,345 bp

Hình 2.7 Bản đồ vị trí các gen không độc avr/pth của vi khuẩn Xoo.

2.2.4 Trình tự lặp lại (Repeitive sequence) trong bộ gen vi khuẩn Xoo

Là những cấu trúc được hình thành do sự lặp lại liên tiếp nhiều lần một đoạntrình tự trong gen Đây là hiện tượng rất phổ biến ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vậtnhân chuẩn, được ví như là các “gia đình” gen nhỏ nằm trong cấu trúc genome Trình

trúc khá đa dạng thay đổi theo loài Đặc biệt, ở hai đầu của trình tự lặp lại có các trình

tự Nu rất đặc thù, thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ và nhậndạng gen

Trong vi khuẩn trình tự lặp được phân thành 3 nhóm chính:

- Nhóm 1: bao gồm các trình tự có kích thước 35 – 40 bp, chúng là các yếu tố ditruyền thêm vào lặp lại, có chiều ngược xuôi giống nhau (REPs: repetitive extragensispalidromic) (Stem, 1988)

- Nhóm 2: là các yếu tố lặp lại hình thành do sự chập lại của hai trình tự lặp kích thước

124 – 127bp (ERIC: enterobachterial repetitive intergensis conversus) (Hulton CS, Higgins

CF, Sharp PM, 1991) hay là đơn vị gen lặp lại (Shaples và Llyod, 1990)

- Nhóm 3: là các trình tự hộp BOX, kích thước khoảng 154bp (Versalovic, 1994) Đây chính là cơ sở cho phương pháp dùng chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặplại để tiến hành phản ứng PCR, nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá,gọi chung là phương pháp Rep-PCR

2.3 Đa dạng các chủng Xoo

2.3.1 Định nghĩa đa dạng di truyền

Theo Công ước Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học" (biodiversity,

biological diversity) có nghĩa là: Sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao gồm: các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các hệ sinh thái thuỷ vực khác, cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần; thuật ngữ này bao hàm sự khác nhau trong một loài, giữa các loài và giữa các hệ sinh thái (Norse and

McManus, 1980) Ngoài ra còn nhiều định nghĩa về đa dạng di truyền khác

2.3.2 Thành phần chủng Xoo

Thành phần và sự phân bố của các chủng vi khuẩn bạc lá là rất khác nhau, thêmvào đó là sự biến đổi thường xuyên, phát sinh thêm nhiều chủng vi khuẩn mới, là tháchthức không nhỏ đối với công tác quản lý và phòng trừ bệnh bạc lá lúa trên toàn thếgiới Công tác điều tra, xác định thành phần chủng là khâu quan trọng

2.3.2.1 Trên thế giới

Nghiên cứu của Devadath, 1985 đã thống nhất phân chia vi khuẩn bạc lálúa thành 3 nhóm chính, ký hiệu là I, II, III Từ đó làm tiền đề cho nhiều nghiêncứu về sau.

Tại philippin đã xác định được 6 nhóm nòi (race) ký hiệu từ PXO1 đến PXO6(PXO-Philippin Xanthomonas Oryzae pv oryzae) Tại Thái Lan, các mẫu bệnh đượcthu thập từ 4 vùng sinh thái khác nhau trong khoảng thời gian từ 1972 – 1977 đã phân

ra làm 3 nhóm nòi

Tại Ấn Độ, năm 1985 Dugapal đã sử dụng bộ giống chỉ thị gồm Bj1, TKM6,T65, Taichung Nativel để nghiên cứu trên nhiều isolate tại Ấn Độ, đã phân ra được 5chủng, ký hiệu từ I đến V Tiếp đó năm 1986, Gupta và cộng sự đã tiến hành nghiêncứu với 13 isolate, sử dụng bộ giống chỉ thị của IRRI, phân ra được 11 chủng Đếnnăm 1988, tiến hành trên 150 isolate, Ready và cộng sự phân chia các chủng tại Ấn Độthành 3 nhóm chính là Ia, Ib, II Sau đó, Rehman, 1993 đã kiểm tra trên 122 isolatetrên 5 giống của IRRI đã xác định được 5 Race (Ia, Ib, II, III, IV)

Viện nghiên cứu nông nghiệp Bogor, Indonesia đã sử dụng 10 giống chỉ thị củaNhật Bản và IRRI để phân chia thành 4 nhóm nòi (A, B, C, D) Sau đó, 1977,Yamamoto và cộng sự kiểm tra 71 isolate tại Nhật Bản đã tìm được 3 chủng là III, IV,

V Năm 1983, Horino chỉ ra chủng A và B lần lượt giống với các chủng 3 và 1 củaphilipppin

Tại Hàn Quốc, năm 1979, Choi và cộng sự đã tiến hành trên 224 isolate, pháthiện được 4 chủng là I, II, III, IV Sau đó, Yun, 1984 đã tiến hành kiểm tra trên 625isolate phát hiện được 5 chủng, ký hiệu từ I đến V Tiếp đến 1985, Yun phân chia 210isolate thành 4 chủng ký hiệu là K1, K2, K3, K4

2.3.2.2 Tại Việt Nam

Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh lý phổbiến ở miền Bắc nước ta Nhưng nghiên cứu gần đây của Phan Hữu Tôn và cộng sự,

2002 thì trên các mẫu bệnh thu thập được ở các tỉnh miền Bắc phân lập được 154isolate trong đó 64 isolate thuộc 16 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tuy trong kết

quả nghiên cứu của tác giả có kết luận là tồn tại 2 chủng phổ biến kí hiệu là chủng 2 vàchủng 3 ở vùng Đồng bằng sông Hồng Song những chủng còn lại vẫn có tiềm nănggây nguy hiểm vì dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gâybệnh với các giống lúa Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước

ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính

xác các chủng vi khuẩn Xoo đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu,

và từ đó có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững

2.3.3 Các nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo

2.3.3.1 Các loại chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền

RFLP: Sự sai khác về kích thước các đoạn cắt thu được khi cắt bằng enzymegiới hạn gọi là sự đa hình về chiều dài của các đoạn cắt giới hạn (Retriction FragmentLenght Polymorphism – RFLP) Các đoạn cắt ra bởi cùng một loại enzyme giới hạnvới kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền

để phân biệt các chủng, loài khác nhau

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – Đa hình các đoạn DNA nhânbản ngẫu nhiên Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn DNAbằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên Các mồi này sẽ bắtcặp một cách ngẫu nhiên vào DNA khuôn ở vị trí bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự

bổ sung với nó

Ngoài ra còn một số chỉ thị khác để nghiên cứu đa dạng nhưng ít sử dụng hơn

2.3.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo trên thế giới

Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D Krishnaveni, A.P.K.Reddy và R.V.Sonti đãthu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995 trên 18 vùng của Ấn Độ Sử dụng phươngpháp RFLP với hai mẫu dò (probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt: Probe dựa vàotrình tự gen avrXa10 và Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS 1112

Kết quả, với Probe avrXa10 từ 67 Isolate tác giả đã phân ra 9 kiểu sai khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai khác

phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn EcoRI Cuối cùng, các tác giả tổng hợp cả hai

Probe avrXa10 và Probe IS 1112 thu được 15 kiểu sai khác phân tử

Năm 1999, Tika B.Adhikari, T.W.Mew, và Jan E Leach sử dụng 2 phươngpháp rep-PCR và IS-PCR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền đối với 171Isolate phân lập được ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal Trong đó tác giả sử dụng

3 mồi ERIC1R, ERIC2 (trong cùng một phản ứng) cho rep-PCR và mồi J3 cho PCR Mồi ERIC1R và ERIC2 được thiết kế trên cơ sở những các chuỗi lặp bảo thủvùng liên gen (enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127

IS-bp Còn mồi J3 được thiết kế trên cơ sở hai đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113 Kếtquả phân lập được 31 haplotype (kiểu sai khác phân tử) từ 171 Isolate nghiên cứu

ERIC1R: 5’ – ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC – 3’

ERIC2F : 5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’

J3: 5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’

Năm 2000, Edmilson R Gonc: alves và Yoko B Rosato sử dụng mồi BOXA1R

với trình tự: 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’ cho phản ứng rep-PCR Kết

quả từ 55 Isolate thu thập được đã phân lập thành 16 loài Xanthomonas and Pseudomonas syringae pv Passiorae

Tiếp nối thành công của Tika B.Adhikari (1999), tháng 6 năm 2007, Jiajian và cộng sự đã sử dụng phương pháp IS-PCR với mồi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xoo tồn tại

tại Trung Quốc Khi so sánh với DNA ladder và so sánh với trình tự genome của 2chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018 (Nhật Bản), các tác giả đã phát hiện

ra 3 locus mới trên trình tự chèn IS1112

A Onasanya và cộng sự 2008, sử dụng các mẫu isozyme khác nhau để kiểm tra mức đa hình enzyme và đa dạng di truyền của 30 isolate Xoo phân lập ở Tây Phi.

Nghiên cứu đã phát hiện 23 locut isozyme, trong đó SKDH cho đa hình từ 33,3 –

93,3%, EST and G6PH cùng cho đa hình 40 – 96,7% trong các mẫu Xoo phân lập 23 loci isozyme này được sử dụng để xây dựng cây phả hệ giữa 30 mẫu Xoo, kết quả chia thành 2 nhóm di truyền chính (Xoo-A and Xoo-B), mỗi nhóm chính chia thành 2 nhóm nhỏ (Xoo – A1 và Xoo - A2) và (Xoo – B1 và Xoo - B2).

2.3.3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền của Xoo tại miền Bắc Việt Nam

Những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho đến nay

vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng lúa đẳng đơngen (gen kháng bệnh bạc lá) Từ đó thiết lập được một phổ kháng nhiễm và dựa vào đây,các tác giả phân tích sự đa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những nhómchủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dòng đẳng đơn gen

Năm 2008, Phan Thanh Tùng đã ứng dụng những nghiên cứu của các tác giảAdhikari, 1999 và Vera Cruz, 1996 đề xuất Sử dụng phương pháp nghiên cứu đa dạng

di truyền bằng Rep-PCR và IS-PCR, xử lí bằng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích

đa hình DNA xác định được 13 chủng vi khuẩn tại hệ số tương đồng di truyền 0,95

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Sử dụng 3 mẫu vi khuẩn Xoo0 (R7, R10, R14) do Phan Hữu Tôn và cộng sự

phân lập năm 2002 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và các isolate mới phân lập

vụ mùa năm 2009 (Bảng 3.1) Các mẫu vi khuẩn này được bảo quản trong môi trườngSkim – Milk (Skim Milk 10g, L-glutamic 1.5g, nước cất 100ml) ở -800C tại phòng thínghiệm Bộ môn CNSHƯD – Khoa CNSH

Dùng 10 dòng đẳng đơn gen IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7,IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21 và 16 dòng đa gen IRBB1/4, IRBB1/5, IRBB1/7,IRBB4/5, IRBB4/7, IRBB4/10, IRBB4/11, IRBB3/7, IRBB3/10, IRBB4/5, IRBB4/7,IRBB4/10, IRBB4/11, IRBB5/7, IRBB5/10, IRBB5/11, IRBB7/10 chứa lần lượt cácgen kháng đơn và đa tương ứng Đối chứng là giống IR24 mẫn cảm với bệnh bạc lá(không chứa gen kháng bệnh bạc lá)

Bảng 3.1 Danh sách và nguồn gốc các mẫu vi khuẩn phân lập

St

t Isolate/Race Tên mẫu Tên giống Địa điểm thu thập

1 R7 HAU 020191 Nếp thơm Bình Giang, Hải Dương

2 R10 HAU 020321 Hybrid rice Yên Bình, Yên Bái

5 135 HAU 020361 Nếp tân Thuận Châu, Sơn La

6 134 HAU 020083 Nhị ưu 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An

8 49 HAU 020346 Nhị ưu 383 Yên Bình, Yên Bái

10 34 HAU 020081 Nhị ưu 838 Quỳnh Lưu, Nghệ An

11 554 HAU 09118-1 Bắc thơm 7 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội

12 507 HAU 08086-6 Q5 Quốc Tuấn, Nam Sách, Hải Dương

13 743 HAU09119-1 HT1 Nam Sách, Hải Dương

14 568 HAU 01100-2 Hương cốm Đông Quan, Đông Hưng, Thái Bình

15 596 HAU 09102-7 Khang dân Sóc Sơn, Hà Nội

16 791 HAU 00183-1 Bắc thơm Nam Sách, Hải Dương

17 679 HAU 09111-1 Thục Hưng Hưng Hà, Thái Bình

18 664 HAU00108 Nàng hương Hưng Hà, Thái Bình

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn

Mục đích của phương pháp này là cấy truyển lại nhằm đánh thức vi khuẩn và để

vi khuẩn làm quen môi trường, phục vụ cho nghiên cứu Chúng tôi tiến hành nuôi cấy

vi khuẩn Xoo trên môi trường Wakimoto (Wakimoto,1955) Dựa trên mục đích nghiên cứu, vi khuẩn Xoo được nuôi cấy trên hai loại môi trường: thạch nghiêng và môi

trường lỏng có lắc

- Thành phần môi trường Wakimoto (tính trên 1000 ml môi trường) như sau:

Khoai tây gọt vỏ : 300g Đường Saccarose : 15g

Nghiên cứu

đa dạng di truyền bằng phương pháp rep-PCR

+ Khoai tây gọt vỏ, thái miếng, cho vào nồi, thêm 1200ml nước cất và đun sôitrong 15 – 20 phút sau đó thu lấy dịch.

+ Hòa tan dịch khoai tây với thành phần hóa chất như trên và thêm nước cất cho

đủ 1000ml, dùng khuấy từ khuấy đều và chuẩn độ cho pH = 7,0

+ Đem hấp khử trùng ở 121oC; 1,5atm trong 20 phút

- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch nghiêng dùng để chiếttách DNA vi khuẩn, protein vi khuẩn và bảo quản mẫu 1 – 2 vòng que cấy khuẩn lạc

vi khuẩn được cấy chuyển từ môi trường bảo quản sang ống nghiệm mới chứa môitrường Wakimoto theo đường zigzac, sau đó đặt trong điều kiện nuôi cấy thích hợp

- Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng, có lắc dùng để đánh giá tốc độ

sinh trưởng của vi khuẩn thông qua xác định OD – Optical Density (giá trị mật độquang) môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường giống như môi trường thạchnghiêng, chỉ khác là môi trường lỏng không có agar Tiến hành: Lấy 1 – 2 vòng quecấy khuẩn lạc vi khuẩn từ ống nghiệm bảo quản cấy sang bình nuôi cấy chứa 100mlmôi trường lỏng, vi khuẩn sinh trưởng trong môi trường lỏng, lắc nhẹ nhàng 100 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ 28oC.

3.2.2 Phương pháp xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR

Để kiểm tra kết quả cấy chuyển từ ống vi khuẩn gốc sang ống mới, cũng nhưkiểm tra các isolate mới phân lập có thành công hay không, chúng tôi tiến hành thí

nghiệm xác định chính xác vi khuẩn Xoo nhằm đảm bảo vi khuẩn được cấy truyền

thành công, không bị nhiễm tạp Dựa trên phản ứng PCR được thiết kế để nhân đoạn

trình tự bảo thủ vùng giữa 2 đoạn trình tự 16S rDNA và 23S rDNA từ vi khuẩn này,

chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng XOR – R2 và XOR – F(theo Adachi, 1999)

* Chiết tách DNA vi khuẩn Xoo (N Furuya et al, 2003):

- Lấy 1 - 2 vòng que cấy khuẩn lạc vi khuẩn Xoo 2-3 ngày tuổi cho vào ống

eppendorf có chứa 200 µl dung dịch proteinase K (50 µl/ml proteinase K; 10 mM HCl, pH 7.5 và 1mM EDTA pH 8.0), vortex nhẹ làm phân tán đều vi khuẩn trong ốngeppendorf

Tris Đặt vào máy gia nhiệt ở 56oC trong 15 phút để proteinase K phân giải màng tếbào vi khuẩn.

- Nâng đột ngột lên nhiệt độ 80oC trong 15 phút để làm bất hoạt enzymeproteinase K

- Ly tâm tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút

- Hút phần dịch trong phía trên chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 4oC

* Kiểm tra sản phẩm chiết tách:

Điện di 5 µl DNA vi khuẩn (lấy 5 µl DNA trộn với 2 µl Loadingdye) trên gelagarose 1%, hiệu điện thế 70 V trong 60 phút, sau đó nhuộm bản gel điện di vớiethydium bromide trong 10 phút, quan sát dưới đèn UV, mẫu chiết tách thành công sẽhiện một vệt sáng rõ nét trên gel

* Thực hiện phản ứng PCR

Các mẫu DNA chiết tách thành công sẽ được sử dụng để thực hiện phản ứng

PCR Sử dụng cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae, đó là

XOR – R2 và XOR – F (Odachi,1990):

Tên mồi Trình tự mồi

XOR – R2 5’ – CTCGGAGCTATATGCCGTGC - 3’

XOR - F 5’ – GCATGACGTCATCGTCCTGT – 3’

Thành phần phản ứng: 1x Taq buffer; 2.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 mMPrimer XOR – R2; 0.2 mM Primer XOR – F; 1.25u Taq DNA polimerasae; 2 µl DNA

vi khuẩn; còn lại là Free Water; tổng thể tích cho 1 phản ứng là 20 µl

Chu trình nhiệt: 94oC trong 30 giây → tiến hành trong 30 chu kỳ (94oC trong 1phút → 60oC trong 30 giây → 72oC trong 1 phút) → 72oC trong 7 phút → bảo quảnsản phẩm PCR ở 4oC

* Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Lấy 10 µl sản phẩm PCR trộn với 2 µl Loading dye, nhỏ vào giếng gel agarose.Điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 80V trong 45 phút, nhuộmbản gel bằng ethydium bromide trong 10 phút, quan sát dưới đèn UV Những mẫu

chính xác là vi khuẩn Xoo sẽ có vệt băng DNA được nhân lên kích thước 470 bp (so

sánh với DNA ladder 100 bp)

3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Mục đích của phương pháp là xem xét tốc độ sinh trưởng của các chủng vi khuẩnkhác nhau

Có nhiều phương pháp xác định tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn, phụ thuộc vàoloại vi khuẩn như đo OD, đo pH môi trường nuôi cấy, đếm số lượng tế bào bằngbuồng đếm hồng cầu, Trong đó phương pháp đo OD được dùng khá phổ biến Trong

nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp đo OD – Optical Density (Giá trị mật

độ quang)

* Nguyên lý của phương pháp:

Dựa trên khả năng cản trở ánh sáng của tế bào vi khuẩn khi chiếu chùm sáng đơnsắc có bước sóng thích hợp Trong giới hạn xác định, mật độ tế bào và giá trị mật độquang hay độ cản trở ánh sáng (độ đục) là tỷ lệ thuận với nhau Nguyễn Lân Dũng vàBùi Thị Việt Hà, 2009, OD từ 0,1 đến 0,5 thì chỉ số OD và số tế bào là tuyến tính Độ đụccủa môi trường nuôi cấy có thể do vi khuẩn bị chết Tuy nhiên, hấp phụ tăng lên cùng

với sự phát triển của vi khuẩn Sự sinh trưởng của vi khuẩn Xoo được xác định thông

qua việc xác định độ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 620 nm (tế bào vi sinh vật hấp phụánh sáng mạnh nhất ở 620nm)

Giả sử: Tổng số tế bào của mẫu là x

Số tế bào sống là a

Số tế bào chết là b

Ta có phương trình sau: a + b = x

Nếu sau 2 giờ, số tế bào sống sinh sản tăng gấp đôi (vì vi khuẩn Xoo sinh sản theo hình thức

phân đôi) thì tổng số tế bào của mẫu là: 2a + b <=> 2a + (x – a)

Nếu coi thời gian nuôi là t (t = 2, 4, 6, 8, 10) thì số tế bào sống tương ứng với khoảng thờigian đó là: 2t/2.a

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường

Wakimoto lỏng Mỗi bình nuôi chứa 100ml môi trường và được hấp khử trùng ở

1210C trong 20 phút

- Cấy giống vi khuẩn ra bình nuôi: dùng que cấy lấy một vòng vi khuẩn 2 ngày

tuổi nuôi trên môi trường thạch nghiêng cấy truyền ra một ống nghiệm chứa 10ml môitrường Wakimoto lỏng, nuôi lắc 100 vòng/phút ở 28oC Sau 24 giờ hút 1ml dịch môitrường chuyển vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường Wakimoto lỏng, tiếp tụcnuôi lắc 100 vòng/phút ở 28oC và bắt đầu đo OD

- Đo độ hấp phụ ánh sáng (ABS) môi trường nuôi cấy: Tiến hành đo dịch môi

trường nuôi cấy vi khuẩn ở bước sóng 620nm, sau thời gian nuôi cấy 0, 6, 12, 18, 24,

… (giờ) Từ đó thiết lập đường cong sinh trưởng thông qua độ hấp phụ ánh sáng vàthời gian nuôi cấy

3.2.5 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử DNA xác định thành phần chủng vi

khuẩn Xoo

Genome vi khuẩn Xoo có các trình tự lặp lại, đây là vùng dễ biến động nhất trong

bộ gen của vi khuẩn Vì thế người ta đã thiết kế được các mồi để nhân đa hình các

đoạn DNA trong genome vi khuẩn Xoo dựa trên sự biến động trình tự các đoạn lặp

này Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật rep-PCR (repetitive based PCR) với 3 mồi đơn BOXA 1RF (Adhikari,1999), ERIC 1RF (Versalovic et al,1994) và mồi ERIC2F (Vera Cruz, 2003), trình tự như sau:

Chu trình nhiệt của phản ứng: 95oC trong 7phút, hoàn thành 35 chu kì với 94oCtrong 1 phút – 53oC trong 2 phút với primer BOXA 1RF (480C trong 2 phút vớiprimer ERIC 2F; ERIC 1RF) – 72oC trong 1 phút, sau đó giữ ở 72oC trong 7 phút vàcuối cùng là bảo quản ở 4oC

* Phân tích số liệu:

Số liệu được phân tích, đánh giá bằng phần mềm NTSYSpc2.1, xây dựng theocông thức tính hệ số đồng dạng di truyền của M Nei và Li, 1979:

Sij = 2Nij/(Ni + Nj)Trong đó: Ni: vạch của giống i

Nj: vạch của giống j

Nij: vạch chung của hai giống i và j

Số vạch băng nhân lên của từng mẫu được thống kê dưới dạng nhị thức 1 0 (cóvạch ghi 1, không có vạch ghi 0) và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.1 để phân tích,đánh giá, xây dựng cây phân loại và xác định được hệ số tương đồng có ý nghĩa (kíhiệu r) để phân loại các mẫu vi khuẩn vào các chủng khác nhau

3.2.6 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo

- Không lây nhiễm sót mẫu

* Cách tiến hành:

- Lấy 3 - 5 vòng que cấy khuẩn lạc vi khuẩn Xoo hòa trong 10 ml nước cất vô

trùng, trộn đều vi khuẩn bằng máy vontex 5000 vòng/phút, đảm bảo mật độ 108 – 1010CFU/ml

- Lây nhiễm theo phương pháp sát thương đầu lá (Furuya và cộng sự, 2001)

- Kéo đã khử trùng ở 121oC, trong 20 phút được nhúng vào dung dịch vi khuẩnrồi cắt ít nhất 5 lá lúa, cách ngọn 3 – 5 cm Chú ý, với mỗi chủng vi khuẩn lây nhiễmcần được buộc thẻ ký hiệu và sử dụng một kéo riêng biệt; đặt ống vi khuẩn nơi râmmát, tránh ánh sáng chiếu trực tiếp làm giảm độc tính của vi khuẩn

- Sau 18 – 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh trên lá Đo 5 lá/Isolate/dòngchỉ thị Đo từ đầu lá (từ chỗ cắt) đến vết bệnh cuối cùng, phần tiếp giáp giữa mô khỏe

Bảng 3.2 Các kiểu phản ứng với các dòng đẳng đơn gen của các chủng vi khuẩn

Xoo tại miền Bắc Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2003)

Các dòng đẳng gen Các kiểu phản ứng của các chủng vi khuẩn.

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập, nuôi cấy và xác định chính xác vi khuẩn Xoo

4.1.1 Kết quả phân lập và nuôi cấy

Chúng tôi đã nuôi cấy thành công 18/18 mẫu vi khuẩn trên môi trường nhân tạoWakimoto Kết quả sau 2 ngày nuôi cấy cho thấy, các mẫu vi khuẩn đều sinh trưởngphát triển tốt, không bị nhiễm tạp, tạo khuẩn lạc màu vàng, nhẵn, bóng, ăn lan trên 2/3diện tích bề mặt môi trường nuôi cấy thạch nghiêng Các mẫu vi khuẩn này sẽ được sửdụng trong các nghiên cứu tiếp theo

Hình 4.1 Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm

4.1.2 Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằng kỹ thuật PCR

* Kết quả chiết tách DNA:

Chúng tôi đã tiến hành chiết tách DNA tổng số của 18 mẫu vi khuẩn Xoo, điện

di kiểm tra sản phẩm chiết tách, kết quả các mẫu vi khuẩn đều cho hiện 1 vạch băngsáng, rõ nét trên bản gel agarose Điều này chứng tỏ 18 mẫu vi khuẩn đều đã đượcchiết tách DNA thành công (Hình 4.2)

Hình 4.2 Kết quả điện di DNA tổng số vi khuẩn Xoo

Giếng 1:135; 2:134; 3:59; 4:49; 5:47; 6:R7; 7:R10; 8:R14; 9: 507;10:554

* Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằngPCR:

DNA vừa chiết tách thành công sẽ được sử dụng làm DNA khuôn cho phản ứng

PCR với cặp mồi đặc hiệu XOR-R2 và XOR-F để xác định chính xác vi khuẩn Xoo.

Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2% và sử dụng DNA ladder 100 bp để sosánh kích thước Chúng tôi đã xác định được 16/18 mẫu vi khuẩn (với mẫu DNA

tương ứng) chính xác là vi khuẩn Xoo, các mẫu này đều cho hiện 1 vạch băng sáng, rõ nét có kích thước 470bp trên bản gel Ngược lại với những mẫu không phải là Xoo, sẽ

không cho hiện vạch băng trùng với kích thước 470 bp (mẫu isolate 136 và 34) (Hình4.3) Những mẫu này có thể là các vi khuẩn sống cộng sinh cùng trong vết bệnh với

Xoo mà ta không thể phân biệt được khi sử dụng phương pháp đơn tế bào để phân lập

Những mẫu này sẽ được tiếp tục sử dụng trong những nghiên cứu tiếp theo của

đề tài, mẫu không phải là vi khuẩn Xoo sẽ được loại bỏ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Hình 4.3 Kết quả PCR cặp mồi XOR – R2 và XOR – F

Giếng 1:ladder; 2: 135; 3:134; 4:59; 5:49; 6: 47; 7: R7; 8: R10

4.2 Kết quả nghiên cứu tốc độ sinh trưởng của các mẫu vi khuẩn

Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Wakimoto lỏng, lắc 100 vòng/phút ởnhiệt độ 280C Sau khi cấy chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng lắc để vikhuẩn làm quen môi trường, sau 24 giờ các mẫu vi khuẩn này được cấy chuyển sangbình nuôi mới có cùng điều kiện, tiếp tục nuôi và bắt đầu đo OD, kết quả thu đượcBảng 4.1

Hình 4.4 Vi khuẩn nuôi trong môi trường lỏng lắc

Bảng 4.1 Kết quả đo OD 10 mẫu vi khuẩn

47 0.265 0.684 1.659 2.005 2.422 1.874 1.722 1.56 1.352 0.985 0.413 0.358 0.095

568 0.452 0.658 1.125 1.765 1.94 2.216 2.223 1.546 1.358 1.064 0.983 0.687 0.586 R10 0.122 0.265 0.425 0.891 1.062 1.512 1.419 1.456 1.072 1.008 0.962 0.854 0.723

Từ bảng số liệu ta xây dựng đồ thị biểu hiện đường cong sinh trưởng của cácmẫu vi khuẩn (Hình 4.5)

Thông qua biểu đồ ta thấy các mẫu vi khuẩn nuôi cấy đều sinh trưởng bìnhthường theo 4 pha: pha lag, pha log, pha ổn định và pha diệt vong Tuy nhiên các mẫu

vi khuẩn này được nuôi qua giai đoạn làm quen môi trường, mặt khác thời gian saumỗi lần đo là 6 giờ (khá dài) nên pha lag rất ngắn, gần như không nhìn thấy trên biểu

đồ Các mẫu vi khuẩn đều phải trải qua ít nhất 18 giờ sau nuôi cấy (đã qua 24 giờ làmquen môi trường) mới đạt đỉnh sinh trưởng và hầu hết đều suy vong dần sau 42 đến 48giờ sau nuôi, suy vong nhanh chóng sau 66 giờ nuôi

Các mẫu vi khuẩn khác nhau ta thấy có sự sinh trưởng khác nhau rất rõ (Bảng 4.2)

Bảng 4.2 Thời gian các pha sinh trưởng của các mẫu vi khuẩn

Thời gian

Mẫu Xoo

Pha log(giờ sau nuôicấy)

Pha ổn định (giờsau nuôi cấy)

Pha suy vong(giờ sau nuôicấy)

24 giờ đến 66 giờ sau nuôi, pha diệt vong diễn ra nhanh chóng trong 6 giờ tiếp theo.Mẫu 134 lại kết thúc pha log sớm hơn (18 giờ sau nuôi), pha ổn định kéo dài từ 18 đến

42 giờ sau nuôi, sau đó chúng suy giảm dần và suy giảm nhanh chóng trong 6 giờ đocuối Mẫu 59, pha log kéo dài đến khoảng 30 giờ sau nuôi thì bước vào pha ổn định,

khoảng 12 giờ tiếp theo, 6 giờ đo cuối mẫu này cũng suy giảm mạnh Mẫu 47 sinhtrưởng rất nhanh, nhanh chóng đạt đỉnh điểm, tuy nhiên chúng cũng suy giảm nhanh.Mẫu 34, pha log kéo dài đến khoảng 45 giờ sau nuôi, sau 60 giờ nuôi chúng suy giảmnhanh chóng Mẫu 49 có đường cong sinh trưởng gần giống mẫu 135, chúng có pha ổnđịnh khá dài từ khoảng 24 giờ sau nuôi đến 48 giờ, chỉ 6 giờ đo cuối chúng mới thực

sự giảm mạnh Trong các mẫu vi khuẩn này, mẫu R7 có đường cong sinh trưởng thấpnhất (chúng sinh trưởng chậm nhất), pha 30 giờ sau nuôi cấy, pha ổn định kéo dàitrong 6 giờ tiếp theo, sau đó là pha suy vong Mẫu R10 cũng cho thấy khả năng sinhtrưởng không mạnh (giá trị đo độ đục môi trường thấp), pha ổn định trong khoảng từ

30 đến 42 giờ sau nuôi cấy

4.3 Kết quả xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng

phương pháp Rep - PCR

Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng Rep - PCR đối với 16 mẫu vi khuẩn

đã được kiểm tra chính xác là Xoo bằng kĩ thuật PCR Sau khi nhuộm bản gel điện di

và kiểm tra trong buồng chụp UV, kết quả thu được số vạch băng nhân lên khá cao đốivới 3 mồi đơn BOXA 1RF (Hình 4.6), ERIC 1RF (Hình 4.7) và ERIC 2F (Hình 4.8).Phản ứng Rep-PCR đối với mồi BOXA 1RF nhân lên được 9 vạch băng có kích thướckhác nhau; đối với mồi ERIC 1RF có số vạch nhân lên được là 13 vạch; đối với mồiERIC 2F, số vạch băng được nhân lên là 16

Như vậy khi sử dụng 3 mồi dựa trên phương pháp rep-PCR chúng tôi đã nhânlên được tổng cộng 38 vạch với kích thước khác nhau hiện lên trên bản gel điện di

tương ứng với 38 vùng gen khác nhau trên bộ genome của vi khuẩn Xoo Mặt khác những vùng gen này lại phân bố rải rác khắp bộ genome của vi khuẩn Xoo do đó việc

phân tích đa dạng các mẫu vi khuẩn đã phủ được một vùng DNA genom khá rộng, đây

là cơ sở phân tử để xác định và phân nhóm các mẫu vi khuẩn một các chính xác hơn

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16