Nghiên cứu nhân nhanh loài lan kim tuyến ( anoectochilus roxburghii (wall ) lindl ) của việt nam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM    NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.) LINDL.) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM    NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.) LINDL.) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Chuyên ngành: Khoa học cây trồng Mã số: 60620110 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Hương Sơn HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nào khác, các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Lài Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể có ñược kết quả này, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến TS. Phạm Hương Sơn người ñã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo Ban ñào tạo sau ðại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của gia ñình và các bạn bè ñồng nghiệp Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ ñã cho tôi ñộng lực và tạo ñiều kiện trong quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ng ày tháng năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Lài Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC MỞ ðẦU 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 4 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài 5 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 6 1.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 1.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 6 1.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào 6 1.1.3. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 8 1.1.3.1. Môi trường nuôi cấy 8 1.1.3.2. Các chất ñiều hoà sinh trưởng 11 1.1.3.3. Môi trường vật lý 13 1.1.3.4. Vật liệu nuôi cấy 14 1.1.3.5. ðiều kiện vô trùng 14 1.1.4. Các giai ñoạn chính trong quá trình nhân giống nuôi cấy in vitro. 15 1.2. Một vài nét về Lan kim tuyến 17 1.2.1. Phân loại 17 1.2.2. ðặc ñiểm hình thái 17 1.2.3. Sinh học và sinh thái 18 1.2.4. Phân bố 19 1.2.5. Giá trị dược liệu của A. roxburghii (Wall.) Lindl. 19 1.2.5.1. Hoạt tính sinh học của A. roxburghii (Wall.) Lindl 19 1.2.5.2. Tác dụng và công dụng của A. roxburghii (Wall.) Lindl. 22 1.2.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.) 23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 1.3. Nuôi trồng Lan kim tuyến 23 1.3.1. Ánh sáng 23 1.3.2. Nhiệt ñộ 24 1.3.3. ðộ ẩm 24 1.3.4. Nguồn nước tưới 24 1.3.5. Phân bón 24 1.4. Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Lan kim tuyến 24 1.4.1. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến trên thế giới 25 1.4.2. Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến ở Việt Nam 29 CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1. Giống nghiên cứu 31 2.1.2. Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô 31 2.1.3. Các giá thể sử dụng trong nghiên cứu 32 2.1.4. Các loại phân bón sử dụng 33 2.2. Nội dung nghiên cứu 34 2.3. Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu, khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi ñầu Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 34 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 36 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu tạo cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. hoàn chỉnh 39 2.3.4. Phương pháp ñưa cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. ra vườn ươm 40 2.4. Các chỉ tiêu theo dõi 42 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 2.5. Phương pháp xử lý số liệu 43 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi ñầu cho nuôi cấy in vitro loài Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 44 3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy trên môi trường MS 44 3.1.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 46 3.1.3. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 49 3.2. Giai ñoạn nhân nhanh chồi 51 3.2.1. Ảnh hưởng của Kinetin (Kin) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 51 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của Thidiazuron (TDZ) ñến quá trình nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 54 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 56 3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 59 3.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 61 3.3. Giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh in vitro 65 3.3.1. Ảnh hưởng của than hoạt tính 65 3.3.2. Ảnh hưởng của αNAA tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 67 3.4. Giai ñoạn ñưa cây in vitro ra vườn ươm 70 3.4.1. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 71 3.4.2. Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 80 1. Kết luận 80 2. ðề nghị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 Tiếng việt 82 Tiếng Anh 82 PHỤ LỤC 87 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BA: Benzyladenine acid CITES: Công ước về buôn bán quốc tế những loài ñộng, thực vật hoang dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) CT: Công thức CTTN: Công thức thí nghiệm CV% : Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants) ð/C: ðối chứng IAA: Indol-3-acetic acid IBA: Indolbutyride acid αNAA : α - Naphthalene acetic acid Kin: Kinetin (6-furfuryl-aminopurine) LSD: So sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức α ≤ 0,05 (Least Significant Difference) MS: Murashige and Skoog RE: Robert Ernst TB: Trung bình TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) VW: Vacin and Went WHO: Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) WWF: Quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên (World Wide Fund For Nature) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 và NaOCl 35 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H 2 O 2 lên mẫu cấy Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 44 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl lên mẫu cấy Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 46 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 47 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 50 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Kin ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 52 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của TDZ ñến khả năng nhân nhanh chồi của Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 55 Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 57 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 60 Bảng 3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl 62 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh. 66 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của αNAA tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 68 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần) 72 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần) 74 [...]... ex Lindl .) (m t trong nh ng loài lan ñ p nh t th gi i), M c lan (Cymbidium ensifolium (L .) Sw .) Trong ñó có nh ng loài Lan ñư c s d ng làm thu c ch a b nh: Lan kim tuy n (A roxburghii (Wall. ) Lindl .), Lan kim tuy n (Ludisia discolor (KerGawl .) A Rich .), A lylei Rolfe ex Downie Seidenf, A lylei Rolfe ex Downie Seidenf, A formossanus, A calcareu ñ c bi t là loài Lan kim tuy n (A roxburghii (Wall. ) Lindl .). .. roxburghii (Wall. ) Lindl .) c a Vi t Nam b ng phương pháp nuôi c y mô t bào nh m góp ph n b o t n và phát tri n loài Lan dư c li u quý hi m c a Vi t Nam 2 M c ñích và yêu c u c a ñ tài M c ñích c a ñ tài Xây d ng ñư c quy trình nhân nhanh loài Lan kim tuy n (A roxburghii (Wall. ) Lindl .) b ng phương pháp nuôi c y mô t bào, nh m góp ph n b o t n và phát tri n loài Lan dư c li u quý hi m c a Vi t Nam Trư... ño n nhân nhanh ch i Lan A roxburghii (Wall. ) Lindl 64 Hình 3.3 T o cây hoàn ch nh in vitro 70 Hình 3.4 nh hư ng c a giá th tr ng khác nhau ñ n t l s ng c a cây Lan A roxburghii (Wall. ) Lindl (sau 12 tu n) 72 Hình 3.5 nh hư ng c a m t s lo i phân bón ñ n s r m i xu t hi n c a cây Lan A roxburghii (Wall. ) Lindl (sau 12 tu n) 75 Hình 3.6 Cây Lan A roxburghii (Wall. ) Lindl nuôi c y mô sinh... c n (Xiao – Xue Wang và c ng s , 201 1) Hi n nay, loài A roxburghii (Wall. ) Lindl nư c ta ñang ñ ng trư c nguy cơ b tuy t ch ng do n n khai thác b a bãi và buôn bán trái phép ra nư c ngoài Do ñó vi c nghiên c u nhân nhanh loài Lan kim tuy n (A roxburghii (Wall. ) Lindl .) c a Vi t Nam là h t s c c n thi t Vì l ñó, chúng tôi ti n hành ñ tài: Nghiên c u nhân nhanh loài Lan kim tuy n (Anoectochilus roxburghii. .. ð , Nepal và Vi t Nam (Zhong HJ và công s , 200 0) 1.2.1 Phân lo i Lan kim tuy n có tên khoa h c là: Anoectochilus roxburghii (Wall. ) Lindl (1 83 2) Synonym: Chrysobaphus roxburghii Wall (1 82 6); Anoectochilus setaceus Blume (1 82 5) Tên khác: Kim tuy n tơ; Gi i thùy tơ; Gi i thùy roxburgh; S a h ng Chi: Kim tuy n (Anoectochilus) H : H phong lan (Orchidaceae) 1.2.2 ð c ñi m hình thái Cây thân th o, m c ñ... Hình 1.1 Cây Lan kim tuy n (A roxburghii (Wall. ) Lindl .) 18 Hình 2.1 Cây Lan kim tuy n (A roxburghii (Wall. ) Lindl .) ñư c ñưa vào nuôi c y mô 31 Hình 2.2 Rêu Sphagnum moss 32 Hình 2.3 D n t qu 32 Hình 2.4 HVP 1601 WP N: P: K = 30: 10: 10 33 Hình 2.5 Growmore (M ) N: P: K = 30: 10: 10 33 Hình 2.6 B1 Thái Lan 33 Hình 3.1 nh hư ng c a môi trư ng khoáng... tính sinh h c c a A roxburghii (Wall. ) Lindl Trên th gi i vi c xác ñ nh các ch t có ho t tính sinh h c b ng các phương pháp khác nhau Lan kim tuy n ñã ñư c r t nhi u nhà khoa h c s d ng He CN và c ng s (2 00 5) ñã s d ng phương pháp s c ký phân l p ñư c 5 h p ch t là: p-Hydroxybenzaldehyde (I), ferulic acid (II), quercetin (III), daucosterol (IV), cirsilineol (V) Trong Lan kim tuy n còn ch a các h p ch... trimethoflavone (7 ), 5, 6, 3‟, 4‟ - tetrahydroxy–7, 5‟-trimethoflavonol–3‟–O–glucoside (8 ) , 5, 4‟–dihydroxy–6, 7, 3‟– trimethoflavone (9 ), Quercetin (1 0), Kaempferol (1 1), Isorhamnetin (1 2), Quercetin 3, 4‟–dimethyl ether (1 3), trong ñó các h p ch t 3, 4, 6, 8, 11 là các h p ch t ñư c phân l p l n ñ u tiên 1.2.5.2 Tác d ng và công d ng c a A roxburghii (Wall. ) Lindl A roxburghii (Wall. ) Lindl v i s phong... Liying Huang và c ng s (2 00 7) cũng dùng phương pháp s c ký LCAPCI-IT-MS ñã phân tích và phân l p ñư c hai h p ch t là Oleanolic acid (OA) và axit ursolic (UA) r t quan tr ng có trong A roxburghii( Wall .) Lindl và ñã ñư c s d ng như m t loài thu c truy n th ng c a Trung Qu c v i n ng ñ tương ng l n lư t là 0,5 – 80 (r = 0.999 2) và 0,5 – 50 g/ml (r = 0,998 9) Mei-Hua Han và c ng s (2 00 8) ñã tách chi t ñư c... t toàn b cây A roxburghii cùng v i triterpenoid, sorghumol Theo Cai Jin – yan và c ng s (2 00 8) s d ng phương pháp s c ký ñ xác ñ nh các h p ch t có trong tinh d u và petrol ether (PE) chi t xu t t cây Lan kim tuy n (A roxburghii) và ñã xác ñ nh ñư c t ng s 72 h p ch t trong ñó có 69 h p ch t ñư c xác ñ nh t PE Li Chun-yan và c ng s (2 00 9) dùng phương pháp s c ký l ng (HPLC) và phương pháp Soxhlet ñ . NGHIỆP VIỆT NAM    NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL. ) LINDL .) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO . NGHIỆP VIỆT NAM    NGUYỄN THỊ LÀI NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL. ) LINDL .) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO . Lan A. roxburghii (Wall. ) Lindl. 34 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Lan A. roxburghii (Wall. ) Lindl 36 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu tạo cây Lan A. roxburghii (Wall. ) Lindl.