Nghiên cứu nhân nhanh loài lan kim tuyến ( anoectochilus roxburghii (wall ) lindl ) của việt nam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A... - Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển của chồi và tạo cây hoàn chỉnh.. Khi trong môi trường n

BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-
 

-NGUYỄN THỊ LÀI

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM

TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.)

LINDL.) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-
 

-NGUYỄN THỊ LÀI

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH LOÀI LAN KIM

TUYẾN (ANOECTOCHILUS ROXBURGHII (WALL.)

LINDL.) CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Chuyên ngành: Khoa học cây trồng

Mã số: 60620110

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

TS Phạm Hương Sơn

HÀ NỘI – 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nào khác, các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lài

LỜI CẢM ƠN

ðể có ñược kết quả này, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc

nhất ñến TS Phạm Hương Sơn người ñã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và tạo

mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo Ban ñào tạo sau ðại học,

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn

thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của gia ñình và các bạn bè ñồng

nghiệp Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ ñã cho

tôi ñộng lực và tạo ñiều kiện trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Lài

MỤC LỤC

MỞ ðẦU 1

1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 4

4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài 5

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 6

1.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

1.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 6

1.1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào 6

1.1.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào 8

1.1.3.1 Môi trường nuôi cấy 8

1.1.3.2 Các chất ñiều hoà sinh trưởng 11

1.1.3.3 Môi trường vật lý 13

1.1.3.4 Vật liệu nuôi cấy 14

1.1.3.5 ðiều kiện vô trùng 14

1.1.4 Các giai ñoạn chính trong quá trình nhân giống nuôi cấy in vitro 15 1.2 Một vài nét về Lan kim tuyến 17

1.2.1 Phân loại 17

1.2.2 ðặc ñiểm hình thái 17

1.2.3 Sinh học và sinh thái 18

1.2.4 Phân bố 19

1.2.5 Giá trị dược liệu của A roxburghii (Wall.) Lindl 19

1.2.5.1 Hoạt tính sinh học của A roxburghii (Wall.) Lindl 19

1.2.5.2 Tác dụng và công dụng của A roxburghii (Wall.) Lindl 22 1.2.6 Thực trạng khai thác và phát triển cây Lan A roxburghii (Wall.)

1.3 Nuôi trồng Lan kim tuyến 23

1.3.1 Ánh sáng 23

1.3.2 Nhiệt ñộ 24

1.3.3 ðộ ẩm 24

1.3.4 Nguồn nước tưới 24

1.3.5 Phân bón 24

1.4 Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Lan kim tuyến 24

1.4.1 Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến trên thế giới 25

1.4.2 Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến ở Việt Nam 29

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1 Giống nghiên cứu 31

2.1.2 Hoá chất và thiết bị nuôi cấy mô 31

2.1.3 Các giá thể sử dụng trong nghiên cứu 32

2.1.4 Các loại phân bón sử dụng 33

2.2 Nội dung nghiên cứu 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu, khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi ñầu Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 34

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 36

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu tạo cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl hoàn chỉnh 39

2.3.4 Phương pháp ñưa cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl ra vườn ươm 40

2.4 Các chỉ tiêu theo dõi 42

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 43

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi ñầu cho nuôi cấy in vitro loài Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 44

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy trên môi trường MS 44

3.1.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 46

3.1.3 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 49

3.2 Giai ñoạn nhân nhanh chồi 51

3.2.1 Ảnh hưởng của Kinetin (Kin) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 51

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Thidiazuron (TDZ) ñến quá trình nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 54

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 56

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 59

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 61

3.3 Giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh in vitro 65

3.3.1 Ảnh hưởng của than hoạt tính 65

3.3.2 Ảnh hưởng của αNAA tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 67

3.4 Giai ñoạn ñưa cây in vitro ra vườn ươm 70

3.4.1 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 71

3.4.2 Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh trưởng

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 80

1 Kết luận 80

2 ðề nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

Tiếng việt 82

Tiếng Anh 82

PHỤ LỤC 87

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA: Benzyladenine acid

CITES: Công ước về buôn bán quốc tế những loài ñộng, thực vật hoang

dã nguy cấp (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)

CT: Công thức

CTTN: Công thức thí nghiệm

CV% : Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants)

ð/C: ðối chứng

IAA: Indol-3-acetic acid

IBA: Indolbutyride acid

αNAA : α - Naphthalene acetic acid

Kin: Kinetin (6-furfuryl-aminopurine)

LSD: So sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức α ≤ 0,05

(Least Significant Difference) MS: Murashige and Skoog

RE: Robert Ernst

TB: Trung bình

TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)

VW: Vacin and Went

WHO: Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)

WWF: Quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên (World Wide Fund For

Nature)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 và NaOCl 35

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo

chồi từ mẫu cấy ban ñầu 35

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 lên mẫu cấy Lan A roxburghii

(Wall.) Lindl 44

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng NaOCl lên mẫu cấy Lan A

roxburghii (Wall.) Lindl. 46

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo

chồi từ mẫu cấy ban ñầu 47

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA ñến khả năng tạo

chồi từ mẫu cấy ban ñầu 50

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của Kin ñến khả năng nhân nhanh chồi Lan A

roxburghii (Wall.) Lindl. 52

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của TDZ ñến khả năng nhân nhanh chồi của Lan A

roxburghii (Wall.) Lindl. 55

Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ñến khả năng nhân

nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl. 57

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ñến khả năng nhân nhanh

chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl. 60

Bảng 3.9 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ñến khả năng

nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl. 62

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 66

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của αNAA tới giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh 68

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến sự sinh trưởng phát

triển của cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl (sau 12 tuần) 72

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ñến sự sinh

trưởng phát triển của cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl (sau 12

tuần) 74

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Lan kim tuyến (A roxburghii (Wall.) Lindl.) 18

Hình 2.1 Cây Lan kim tuyến (A roxburghii (Wall.) Lindl.) ñược ñưa vào nuôi cấy mô 31

Hình 2.2 Rêu Sphagnum moss 32

Hình 2.3 Dớn tổ quạ 32

Hình 2.4 HVP 1601 WP N: P: K = 30: 10: 10 33

Hình 2.5 Growmore (Mỹ) N: P: K = 30: 10: 10 33

Hình 2.6 B1 Thái Lan 33

Hình 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ñến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ñầu 48

Hình 3.2 Giai ñoạn nhân nhanh chồi Lan A roxburghii (Wall.) Lindl 64

Hình 3.3 Tạo cây hoàn chỉnh in vitro 70

Hình 3.4 Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ñến tỷ lệ sống của cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl (sau 12 tuần) 72

Hình 3.5 Ảnh hưởng của một số loại phân bón ñến số rễ mới xuất hiện của cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl (sau 12 tuần) 75

Hình 3.6 Cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl nuôi cấy mô sinh trưởng phát triển ở vườn ươm 76

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Theo tổ chức Y tế thế giới, hiện nay khoảng 80% dân số toàn cầu sử dụng các loại thảo dược truyền thống ñể bảo vệ sức khỏe Phong trào dùng cây thuốc ñể phòng và chữa bệnh trên thế giới ñã ñặt ra một vấn ñề cần quan tâm ñó là 2/3 trong số 50.000 loài cây thuốc ñược sử dụng là khai thác từ cây hoang dại mà không hề ñược trồng bổ sung Theo một nghiên cứu của nhà thực vật học người Anh, Alan Hamilton, thành viên của quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên (WWF) có tới 4.000 – 10.000 loài cây cỏ làm thuốc có nguy cơ

bị tuyệt chủng Nguyên nhân không phải hoàn toàn do sự phát triển của y học

cổ truyền mà theo tác giả là do thị trường dược thảo ở Châu Âu và Bắc Mỹ tăng 10% mỗi năm trong vòng 10 năm nay Trên quy mô toàn cầu, doanh thu mua bán cây thuốc hàng năm ước tính lên tới 16 tỷ Euro Ở Trung Quốc, mỗi năm có khoảng 700.000 tấn dược liệu ñược ñưa vào sản xuất 6.266 mặt hàng, mang lại doanh thu khoảng 17,57 tỷ USD; việc buôn bán dược liệu cũng là một nguồn thu lớn của Ấn ðộ, mặt hàng này ñem về cho quốc gia này trên 60

tỷ rupi, cung cấp 12% nhu cầu thế giới

Theo Pawar V M và Puri S N (2005) thị trường thảo dược tiếp tục tăng trưởng với tốc ñộ 15% /năm Theo ước tính của WHO thị trường toàn cầu về các sản phẩm thảo dược sẽ ñạt 5 nghìn tỷ USD Trong ñó Trung Quốc ñạt 5 tỷ USD từ thảo dược mỗi năm

Viện Thực vật học Trung Quốc cho rằng, cùng với Trung Quốc, Lào, Việt Nam là một trong những nước có tài nguyên cây thuốc phong phú nhất Tuy nhiên, nguồn cây thuốc của Việt Nam ñang cạn kiệt vì hoạt ñộng khai thác bừa bãi và sự yếu kém trong công tác bảo tồn, ngay cả ở các khu bảo tồn

thiên nhiên và rừng quốc gia Có một ñiều ñáng lưu ý là việc khai thác tài nguyên rừng trong ñó có cây thuốc là sinh kế chủ yếu của các dân tộc ít người trong vùng ñược các thương nhân khai thác Tuy vậy, việc tàn phá tài nguyên rừng cũng chỉ mang lại cho họ một mức sống rất thấp Trong khi ñó, các dự

án trồng rừng chủ yếu mới chỉ quan tâm ñến cây lấy gỗ, cây nguyên liệu và cây ăn quả mà chưa chú ý ñến cây dược liệu, loại cây có giá trị hàng hóa rất cao Chẳng hạn, số tiền thu ñược từ 0,2 ha sa nhân cũng tương ñương với thu nhập từ 1,5 ha dong riềng Vì vậy trong ñiều kiện kinh tế như hiện nay, việc

mở rộng khu vực trồng cây thuốc không chỉ nhằm phát triển nguồn dược liệu,

mà còn là biện pháp hữu hiệu ñể xóa ñói giảm nghèo tại ñịa phương

Orchidaceae là một trong những họ thực vật rất phong phú về chủng

loại ðây không những là một họ nổi tiếng và ñược yêu thích bởi có hoa rất ñẹp, nhiều màu sắc và hình dáng, mà có nhiều loài lan thuộc họ thực vật này còn là những vị thuốc chữa bệnh rất công hiệu Việt Nam có chủng loại Lan rất phong phú gồm tổng số 125 chi và 902 loài lan, trong ñó có nhiều loài Lan rất quý, ñược nước ngoài biết ñến và ñặt mua với số lượng lớn nhưng thực tế chủ yếu mới chỉ khai thác trong tự nhiên nên không ñáp ứng ñược nhu cầu của khách hàng, ñồng thời lại vi phạm các ñiều khoản của Hiệp ước CITES là khai thác ngày càng cạn kiệt các loài Lan, ñồng thời là cây dược liệu nguồn

gen quý hiếm của Việt Nam Ví dụ như: Thanh ñạm (Coelogyne cristata Lindl.), Thanh lan (Cymbidium cyperifolium Wall ex Lindl.) (một trong những loài lan ñẹp nhất thế giới), Mạc lan (Cymbidium ensifolium (L.) Sw.)

Trong ñó có những loài Lan ñược sử dụng làm thuốc chữa bệnh: Lan kim

tuyến (A roxburghii (Wall.) Lindl.), Lan kim tuyến (Ludisia discolor Gawl.) A Rich.), A lylei Rolfe ex Downie Seidenf, A lylei Rolfe ex Downie Seidenf, A formossanus, A calcareu ñặc biệt là loài Lan kim tuyến (A

(Ker-roxburghii (Wall.) Lindl.) hiện số lượng còn rất ít

Trên thực tế cho thấy Lan kim tuyến (A roxburghii (Wall.) Lindl.) là một cây thuốc quan trọng thuộc họ Lan (Orchidaceae) Nó không chỉ là một

loài hoa có bộ lá rất ñẹp mà nó còn là một loài dược liệu quý hiếm của Việt Nam và các nước Châu Á khác Nó thường ñược gọi với cái tên là “Lan kim

tuyến” A roxburghii (Wall.) Lindl phân bố ở các nước châu Á: Trung Quốc, Nhật Bản, Sri Lanka, Ấn ðộ, Nepal và Việt Nam Ở Việt Nam, A

roxburghii (Wall.) Lindl phân bố tại Huế, Tam ðảo, Lào Cai, Quảng Trị,

Kon Tum, Gia Lai Chúng mọc rải rác trong rừng núi ñá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe suối, ở ñộ cao 300 - 1800 m

A roxburghii (Wall.) Lindl ñược coi là một loại “thần dược” vì có tác

dụng chữa bệnh ña dạng như: ñiều trị tiểu ñường, ung thư, trẻ em suy dinh dưỡng, bệnh gan, bệnh tim mạch, viêm thận, cao huyết áp và trị rắn ñộc cắn (Xiao – Xue Wang và cộng sự, 2011)

Hiện nay, loài A roxburghii (Wall.) Lindl ở nước ta ñang ñứng trước

nguy cơ bị tuyệt chủng do nạn khai thác bừa bãi và buôn bán trái phép ra

nước ngoài Do ñó việc nghiên cứu nhân nhanh loài Lan kim tuyến (A

roxburghii (Wall.) Lindl.) của Việt Nam là hết sức cần thiết Vì lẽ ñó, chúng

tôi tiến hành ñề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh loài Lan kim tuyến

(Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) của Việt Nam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào” nhằm góp phần bảo tồn và phát triển loài Lan dược liệu

quý hiếm của Việt Nam

2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài

Mục ñích của ñề tài

Xây dựng ñược quy trình nhân nhanh loài Lan kim tuyến (A roxburghii

(Wall.) Lindl.) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo tồn

và phát triển loài Lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam

Yêu cầu của ñề tài

ðề tài tập trung giải quyết một số vấn ñề sau:

- Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi ñầu cho nuôi cấy mô tế bào, tìm ra phương pháp khử trùng tối ưu

- Nghiên cứu công ñoạn nhân nhanh chồi

- Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển của chồi và tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu kỹ thuật ñưa cây ra ngoài vườn ươm, bao gồm nghiên cứu về các giá thể và một số loại phân bón thích hợp

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

Ý nghĩa khoa học

- Bước ñầu xây dựng ñược quy trình nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy

mô cây Lan kim tuyến

- Góp phần trồng trọt và phát triển cây dược liệu quý hiếm mà trước ñó chỉ khai thác trong tự nhiên, trên cơ sở ñó bảo tồn nguồn gen quý hiếm ñang có nguy cơ tuyệt diệt

- Cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro các

loại cây dược liệu khác ở Việt Nam

Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài

- A roxburghii (Wall.) Lindl là nguồn gen quý hiếm của Việt Nam ñang

ñứng trước nguy cơ tuyệt chủng, nhân giống Lan kim tuyến là nhằm bảo tồn ñưa vào trồng trọt và phát triển nguồn gen quý hiếm này

- Tạo ra ñược nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh, giá cả phù hợp, ñáp ứng nhu cầu của thị trường, tạo nguồn nguyên liệu quý cho ngành Dược

- Góp phần giúp ñồng bào dân tộc ở vùng núi cao tăng thu nhập, góp phần xóa ñói giảm nghèo và ñồng thời là biện pháp tốt ñể bảo vệ rừng

4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài

- Cây Lan A roxburghii (Wall.) Lindl thu thập từ Sa Pa ñược nuôi trồng

trong nhà lưới và ñưa vào nuôi cấy mô tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật của Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ Thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 5/2011 ñến tháng 10/2012

- Quy trình nhân giống in vitro cây Lan kim tuyến ñến giai ñoạn ñưa cây ra

vườn ươm

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

CỦA ðỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người ðức Haberlandt, ñã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật ñể chứng minh tế bào là toàn năng Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng ñều có khả năng tiềm tàng ñể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy rằng, mỗi

tế bào của cơ thể ña bào ñều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm ðiều ñó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp ñiều kiện thuận lợi nhất ñịnh, những tế bào ñó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1953, Miller và Skoog ñã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh ñược tính toàn năng của tế bào Thành công trên

ñã tạo ra công nghệ mới: công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho ñến nay, con người ñã hoàn toàn chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

từ một tế bào riêng rẽ (Nguyễn Quang Thạch, 2003)

1.1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong ñó có nhiều loại tế

bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau Các mô có ñược cấu trúc chuyên môn hoá nhất ñịnh nhờ vào sự phân hoá

Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, ñảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá có thể biểu diễn như sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hoá chức năng Khi tế bào ñã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở ñiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào

tế bàoT

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen ñược hoạt hoá ñể cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt ñộng Quá trình này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp ñiều kiện bất lợi thì các gen ñược hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ ñược xảy ra theo một chương trình ñã ñịnh sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994)

Phân hóa

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa

ðể ñiều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường

bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật

là Auxin và Cytokinin Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng ñộ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của

mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân ñối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus)

1.1.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô

tế bào

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai ñoạn kế tiếp nhau, quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau:

1.1.3.1 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và ñiều kiện bên ngoài

ñược xem là vấn ñể quyết ñịnh sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy ñược xem là phần ñệm ñể cung cấp các chất dinh dưỡng cần

thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro

Cho ñến nay, ñã có nhiều môi trường dinh dưỡng ñược tìm ra (MS, WPM,

VW, RE, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào ñối tượng và mục ñích nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:

+ Nguồn các bon: Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang

hợp ñể tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải ñưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất ñịnh ñể cung cấp năng lượng cho tế bào và

mô Nguồn các bon ở ñây là các loại ñường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh

khối, ngoài ra nó ñóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Người

ta thường sử dụng 2 loại ñường ñó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994)

+ Nguồn Nitơ: Tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển

mô Thông thường, nguồn nitơ ñược ñưa vào môi trường ở hai dạng là NH4+

và NO3

- Trong ñó, việc hấp thụ NO3

-của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4 +

+ Nhưng ñôi khi NO3

gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitơ với tỷ lệ hợp lý ñược sử dụng rộng rãi nhất

+ Các nguyên tố ña lượng: Là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,

Ca… cần thiết và thay ñổi tuỳ ñối tượng nuôi cấy Nhìn chung, các nguyên tố này ñược sử dụng ở nồng ñộ trên 30 ppm

Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau có thể lựa chọn sử dụng Nói chung, môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu kali sẽ thúc ñẩy quá trình trao ñổi chất mạnh hơn

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất

quan trọng do chúng ñóng vai trò quan trọng trong các hoạt ñộng của enzym Chúng ñược dùng ở nồng ñộ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố ña lượng ñể ñảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp ñược vitamin,

nhưng không ñủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952) Do ñó, ñể cây sinh trưởng tối ưu một số vitamin nhóm B ñược bổ sung vào môi trường với lượng nhất ñịnh tuỳ theo từng hệ mô và giai ñoạn nuôi cấy Các vitamin B1 (Thiamin) và

B6 (Pyridocin) là những vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng ñộ thấp khoảng 0,1-1mg/L (Trần Văn Minh, 1994)

+ Dung dịch hữu cơ: Có thành phần không xác ñịnh như nước dừa, dịch chiết

nấm men, cà rốt, chuối, khoai tây ñược bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan

* Nước dừa: Thường chứa các axít amin, axít hữu cơ, ñường, ARN, ADN

ðặc biệt trong nước dừa có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in

vitro ñó là: myo - inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các glucosit của

cytokinin Do vậy, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy nước dừa kích thích

sự phân chia, sinh trưởng và phát sinh hình thái của tế bào, mô nuôi cấy Nước dừa thường ñược sử dụng rất hiệu quả trong việc thay thế các hợp chất ñiều tiết sinh trưởng tổng hợp nhân tạo khi nuôi cấy hoa lan (Mamoru Kusomoto, 1980)

Nước dừa ñược sử dụng như là một chất truyền thống trong nuôi cấy

mô nhân giống cây trồng, trong nước dừa có nhiều các thành phần ñộc ñáo của các loại ñường, vitamin, khoáng chất, axít amin và chất ñiều tiết sinh trưởng Các loại ñường có trong nước dừa như: saccaroza, glucoza, fructoza, mannitol, sorbitol, myo-inositol, scyllo-inositol…; các vitamin như: C, B1, B2, B3, B5, B6, folate, folic axít, biotin, niacin…; khoáng chất như: Ca, Fe,

Mg, P, K, Na, Zn, Cu, Mn, Se, Cl, S, Al ; Nhóm auxin có trong nước dừa chủ yếu là indole-3-acetic acid 40 chiếm 150,6 nM; nhóm cytokinin có: N6-isopentenyladenine chiếm 0,26 nM, dihydrozeatin chiếm 0,14 nM, trans-zeatin chiếm 0,09 nM, kinetin chiếm 0,31 nM (Jean W.H Yong và cộng sự, 2009)

* Dịch nghiền của khoai tây: Có chứa cacbonhydrat dưới dạng saccaroza,

glucose và fructose, amino axít (21 loại bao gồm cả lysine là một axít amin thường không có trong protein thực vật), các muối khoáng (K, Fe, Mg…) và

ñặc biệt là các vitamin (C, B1, B6) Dịch nghiền khoai tây thường ñược bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan và ñặc biệt có hiệu quả với một số

loài như: Phalaenopsis, Doritaenopsis (Thorpe và cộng sự, 2008)

+ Than hoạt tính: Bổ sung than hoạt tính vào trong môi trường nuôi cấy sẽ có

lợi ích và có tác dụng khử ñộc Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự tăng trưởng Than hoạt tính nói chung ảnh hưởng trên 3 mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất ñiều hòa sinh trưởng và các chất

làm ñen môi trường

Người ta cho rằng tác dụng ngăn cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có

sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do nó hút chất ñiều hòa sinh trưởng có trong môi trường NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tính Khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính là do nó kết hợp với các hợp chất phenol ñộc tiết ra trong thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường ñược bổ sung vào môi trường với nồng ñộ 0,5-3%, còn có ý nghĩa kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa Lan

Than hoạt tính cũng giúp làm giảm ñộc tố bằng cách ñào thải các hợp chất ñộc (ví dụ: phenol) ñược tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì

+ Chất làm ñông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của

tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/L ðộ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt ñến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng ñộ thạch dao ñộng trong khoảng 6-10g/L tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy

1.1.3.2 Các chất ñiều hoà sinh trưởng

Các Phytohormon là những chất có tác dụng ñiều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng ñến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác Các

phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic axít Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết ñịnh ñến sự thành công của kết quả nuôi cấy

+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid),

IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường ñược sử dụng ñể kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

+ Cytokinin: ðược bổ sung vào môi trường chủ yếu ñể kích thích sự phân chia

tế bào và quyết ñịnh sự phân hoá chồi bất ñịnh từ mô sẹo và cơ quan Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine – C10H 9NO5), BAP (6-Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kinetin và BAP ñược sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao

và giá thành rẻ Ở nồng ñộ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng ñộ 10-6 - 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi Trong nuôi cấy mô ñể kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng ñộ 10-6- 10-4 M (Lê Văn Chi, 1992)

+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan

trọng nhất là GA3 (Gibberellin acid 3) GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng ñốt thân cành Bên cạnh ñó GA3còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ (Street, 1974) Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng ñến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng sinh dưỡng của cây

+ Axít Abscisic (ABA): Là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn ñược dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro ABA có ảnh hưởng âm tính ñến mô nuôi

cấy, khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (Lê Văn Chi, 1992)

+ Ethylen: Có biểu hiện tác ñộng hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở

giai ñoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai ñoạn muộn Trong một số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

Ngoài ra, cần phải chú ý tới ñộ pH của môi trường ðộ pH thường ñược

sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6

1.1.3.3 Môi trường vật lý

Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý ñược quan tâm ñó là ánh sáng, ñộ ẩm, nhiệt ñộ

+ Ánh sáng: ðây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái

của các mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường ñộ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng

có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với ña số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12h/ngày Cường ñộ ánh sáng ảnh hưởng ñến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy

Cường ñộ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường ñộ thấp gây nên sự tạo chồi Nhìn chung, cường ñộ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường ñộ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng ñỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của ñèn huỳnh quang với cường ñộ 2000 - 3000 lux

+ Nhiệt ñộ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt ñến sự phân chia tế bào và các

quá trình trao ñổi chất của mô nuôi cấy, ñồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt ñộng của auxin, do ñó làm ảnh hưởng ñến khả năng ra rễ của cây mô Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt ñộ ngày/ñêm là

200C/150C hoặc 200C/180C tỷ lệ ra rễ ñạt ñược khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn Ở nhiệt ñộ trung bình thì hoạt ñộng trao ñổi chất tốt hơn Còn ở nhiệt ñộ cao lại tạo nhiều tế bào không có tổ chức Trong nuôi cấy mô, nhiệt

ñộ thường ñược duy trì ổn ñịnh, ban ngày từ 25 - 300C và ban ñêm từ 17 -

200C

+ ðộ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì ñộ ẩm tương ñối luôn bằng 100% ñể

ñảm bảo sự phát sinh phát triển bình thường của cây nuôi cấy mô

1.1.3.4 Vật liệu nuôi cấy

Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết ñịnh ñến sự thành bại của quá

trình nhân giống in vitro Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên

hoá ñều có tính toàn năng, nghĩa là ñều có thể nuôi cấy thành công Thực tế cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức ñộ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi ñến các tế bào của ñỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh ñỉnh ngọn, ñầu rễ, lá non, tượng tầng… sau ñó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai ñoạn non (Nguyễn ðức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995)

1.1.3.5 ðiều kiện vô trùng

ðây là ñiều kiện cơ bản ñầu tiên quyết ñịnh sự thành bại của quá trình

nuôi cấy in vitro Nếu ñiều kiện này không ñược ñảm bảo thì mẫu nuôi cấy

hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai

ñoạn sau sẽ bị ngừng lại Do ñó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần

ñảm bảo ñiều kiện vô trùng tuyệt ñối Muốn ñảm bảo ñiều kiện vô trùng cần

có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện ñại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng

Chọn ñúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ ñạt tốc ñộ sinh trưởng nhanh

1.1.4 Các giai ñoạn chính trong quá trình nhân giống nuôi cấy in vitro

Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các

bước sau:

Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây

mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh, ñặc biệt

là bệnh virus và ở giai ñoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong ñiều kiện môi trường thích hợp với chế ñộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng

sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 1: Nuôi cấy khởi ñộng

Là giai ñoạn khử trùng ñưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai ñoạn này

cần ñảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của cây Quan trọng nhất là ñỉnh chồi ngọn, ñỉnh chồi nách và sau ñó là ñỉnh chồi hoa và cuối cùng là ñoạn thân, mảnh lá

Bước 2: Nhân nhanh

Là giai ñoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh

số lượng thông qua các con ñường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất ñịnh và tạo phôi vô tính Vấn ñề là phải xác ñịnh ñược môi trường và ñiều kiện ngoại cảnh thích hợp ñể có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có

nhiều cytokinin sẽ kắch thắch tạo chồi Chế ựộ nuôi cấy thường là 25 - 270C và

16 giờ chiếu sáng/ngày, cường ựộ ánh sáng 2000 - 4000 lux

Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường ựược bỏ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất ựiều tiết sinh trưởng Theo Murashige, giai ựoạn này là giai ựoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi ựể sau ựấy có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên Tạo

rễ cho chồi là một phần rất quan trọng của bất kỳ quy trình nhân in vitro nào

đôi khi một số chồi cần ựược kéo dài trước khi tạo rễ để giảm chi phắ nhân

giống, nhiều phòng thắ nghiệm chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro và

tạo rễ từ bên ngoài phòng nuôi cấy

Bước 4: Thắch ứng cây in vitro ngoài ựiều kiện tự nhiên

để ựưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần ựảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm ựã ựạt ựược những tiêu chuẩn hình thái nhất ựịnh (số

lá, số rễ, chiều cao cây)

+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thắch hợp: Giá thể sạch, tơi xốp, thoát

là cho hệ số nhân lớn (thường ựạt ựược ở các loài cây khác nhau trong phạm

vi từ 36Ờ 1012/năm) trong một thời gian ngắn, dễ dàng sản xuất cây sạch bệnh,

khỏe mạnh; Phương pháp nhân giống vô tắnh bằng nuôi cấy in vitro nhanh và

hiệu quả, ựặc biệt ựược áp dụng cho các loài hoa, cây thuốc, cây ựặc sản quý hiếm có giá trị kinh tế cao

1.2 Một vài nét về Lan kim tuyến

Chi Anoectochilus thuộc họ lan có hơn 40 loài có mặt ở hầu khắp các

nước nhiệt ựới trải dài từ dãy Himalaya của Ấn độ ựến vùng đông Nam Á và

kéo dài tới Hawai Trong chi Anoectochilus có một số loài ựược sử dụng ựể làm thuốc ở Trung Quốc như: A formosanus Hayata, A koshunensis Hayata,

và A roxburghii (Wall.) Lindl Trong các loài này thì hai loài A formosanus Hayata và A koshunensis Hayata chỉ phân bố ở đài Loan Ờ Trung Quốc và Okinawa Ờ Nhật Bản A roxburghii phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật

Bản, Srilanka, Ấn độ, Nepal và Việt Nam (Zhong HJ và công sự, 2000)

Tên khác: Kim tuyến tơ; Giải thùy tơ; Giải thùy roxburgh; Sứa hồng

Chi: Kim tuyến (Anoectochilus)

Họ: Họ phong lan (Orchidaceae)

1.2.2 đặc ựiểm hình thái

Cây thân thảo, mọc ở ựất, có thân rễ mọc dài; thân trên ựất mọng nước

và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xòe sát ựất Lá hình trứng, gần tròn

ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu ựỏ nâu - ựỏ với mạng gân màu vàng - lục hay hồng); cuống lá dài 2 - 3cm Cụm hoa dài 10 - 15cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng,

chóp thóp nhọn, dài 8 - 10mm, màu hồng Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm

Hình 1.1 Cây Lan kim tuyến (A roxburghii (Wall.) Lindl.)

1.2.3 Sinh học và sinh thái

Mùa hoa nở vào tháng 10 - 12 Mùa quả chín từ tháng 12 ñến tháng 3 năm sau Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, sinh trưởng rất chậm Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là rừng nguyên thủy, thường xanh nhiệt ñới, rừng cây lá rộng trên sườn núi ñá granit, riôlit, phiến sét, ở ñộ cao 500 - 1600m rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên ñất ẩm, rất giàu mùn

1.2.5 Giá trị dược liệu của A roxburghii (Wall.) Lindl

1.2.5.1 Hoạt tính sinh học của A roxburghii (Wall.) Lindl

Trên thế giới việc xác ñịnh các chất có hoạt tính sinh học bằng các

phương pháp khác nhau ở Lan kim tuyến ñã ñược rất nhiều nhà khoa học sử

dụng

He CN và cộng sự (2005) ñã sử dụng phương pháp sắc ký phân lập

ñược 5 hợp chất là: p-Hydroxybenzaldehyde (I), ferulic acid (II), quercetin

(III), daucosterol (IV), cirsilineol (V)

Trong Lan kim tuyến còn chứa các hợp chất chống oxy hóa là dẫn xuất

của phenol như: 8–hydroxybenzylquercetin, isorhamnetin–7–O–β–D– glucopy–ranoside, isorhamnetin–3–O–β–D–glucopyranoside, kaempferol–3–

O–β–D–glucopyranoside, kaempferol–7–β–D–glucopyranoside, 5–hydroxy–

3', 4', 7–trimethoxyflavonol–3–β–D–rutinoside, isorhamnetin–3–β–D

rutinoside và quercetin–7–O–β–D–[6''–O–(trans–feruloyl)]–glucopyranoside

các hoạt chất này có khả năng tự tìm ra gốc tự do DPPH

Theo nghiên cứu của Chun-Nian He và cộng sự (2006), trong A

roxburghii (Wall.) Lindl có chứa quercetin-7-O-β-D-[6''-O-(trans-feruloyl)]-

glucopyranoside (compound 1), 8-C-p-Hydroxybenzylquercetin (compound

2), isorhamnetin-7-O-β-Dglucopyranoside (compound 3), β-D-glucopyranoside (compound 4), kaempferol-3-O-β-Dglucopyranoside (compound 5), kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside (compound 6), 5- hydroxy-3',4',7- trimethoxyflavonol-3-O-β-D-rutinoside (compound 7), and isorhamnetin-3-O-β-D-rutinoside (compound 8)

isorhamnetin-3-O-Liying Huang và cộng sự (2007) dùng các phương pháp sắc ký HPLC/APCI/MS ñã nhận dạng và xác ñịnh ñược 3 hợp chất là ergosterol, stigmasterol và β-sitosterol với nồng ñộ ño ñược lần lượt là 0,5 – 150µg/ml với hệ số tương quan r = 0,9999 ergosterol, 5 – 400µg/ml với hệ số r = 0,9999 stigmasterol và 10 - 2000µg/ml với hệ số r = 0,9998 β-sitosterol

Liying Huang và cộng sự (2007) cũng dùng phương pháp sắc ký APCI-IT-MS ñã phân tích và phân lập ñược hai hợp chất là Oleanolic acid

LC-(OA) và axit ursolic (UA) rất quan trọng có trong A roxburghii(Wall.) Lindl

và ñã ñược sử dụng như một loài thuốc truyền thống của Trung Quốc với nồng ñộ tương ứng lần lượt là 0,5 – 80 (r = 0.9992) và 0,5 – 50µg/ml (r =

0,9989)

Mei-Hua Han và cộng sự (2008) ñã tách chiết ñược 2 ester mới là

sorghumol 3-O-Z-p-coumarate và sorghumol 3-O-E-p-coumarate, và một alkaloid mới là Anoectochine từ toàn bộ cây A roxburghii cùng với

cây Lan kim tuyến với kết quả tương ứng lần lượt là 4,0 – 110,0µg/ml với hệ

số tương quan r = 0,9985 và 2,5 – 50µg/ml với hệ số tương quan r = 0,9995, bằng phương pháp Soxhlet xác ñịnh ñược 0,189mg/g axit ferulic, 0,091mg/g axit cinnamic

Theo Hu Guo-hai và cộng sự (2010), dùng phương pháp phân tích quang kế ngọn lửa (FAAS) ñể ñánh giá và xác ñịnh hàm lượng của các

nguyên tố vi lượng (Zn, Mn, Cu, Fe, Ni, Co, Cr, Cd, Pb) có trong Lan kim

tuyến nuôi trồng và Lan kim tuyến trong tự nhiên Kết quả cho thấy ñã xác ñịnh ñược sự có mặt của các nguyên tố vi lượng là 99,8% với giá trị RSD = 0,66% Các nguyên tố Fe, Mn, Zn, Co và Cu trong Lan kim tuyến nuôi trồng thấp hơn so với các nguyên tố này ở Lan kim tuyến trong tự nhiên Tuy nhiên nguyên tố Cr trong Lan kim tuyến nuôi trồng lại cao hơn so với Lan kim tuyến trong tự nhiên

Zhong Tian-hua và cộng sự (2011) ñã xác ñịnh các axit amin tự do có trong Lan kim tuyến bằng phương pháp sắc ký anion ñã xác ñịnh ñược 17 axit amin với nồng ñộ từ 0,23 – 3,37 pmol có ñường tuyến tính với cao ñiểm 2 –

3 và giá trị RSDs của 5 ñường có giá trị từ 0,96 – 4,2%

Liying Huang và cộng sự (2011) ñã nghiên cứu sử dụng HSCCC speed counter-current chromatography) tách chiết và tinh sạch ñược

(high-ergosterol và stigmasterol là hai hợp chất sterol chủ yếu của A roxburghii

(Wall) Lindl với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng Nhóm nghiên cứu ñã

tách chiết ñược 36,5mg ergosterol và 43,6mg stigmasterol từ 100g of A

roxburghii với ñộ tinh khiết 92,0 – 95,5%

Xiao – Xue Wang và cộng sự (2011) bằng phương pháp cộng hưởng từ

và phương pháp sắc ký lỏng cộng ñầu dò khối phổ (NRM/LRC-MS PDS) ñã

xác ñịnh ñược 13 hợp chất cùng cấu trúc phân tử của các hợp chất là: p–

hydroxybenzaldehyde (1), trans–4–hydroxycinnamic acid (2), trans–3– hydroxycinnamic acid (3)¯, trans–2– hydroxycinnamic acid (4), Isorhamnetin–

3–O-[6’’– rhamnosyl(1→6)] glucopyranoside (5), 5–hydroxyferulic acid (6),

3, 5–dihydroxy–3‟, 4‟, 7– trimethoflavone (7), 5, 6, 3‟, 4‟ - tetrahydroxy–7,

5‟-trimethoflavonol–3‟–O–glucoside (8)¯, 5, 4‟–dihydroxy–6, 7, 3‟–trimethoflavone (9), Quercetin (10), Kaempferol (11), Isorhamnetin (12), Quercetin 3, 4‟–dimethyl ether (13), trong ñó các hợp chất 3, 4, 6, 8, 11 là các hợp chất ñược phân lập lần ñầu tiên

1.2.5.2 Tác dụng và công dụng của A roxburghii (Wall.) Lindl

A roxburghii (Wall.) Lindl với sự phong phú của các hoạt chất trong

cây ñược coi là một loại “thần dược” vì có tác dụng chữa bệnh ña dạng như: ñiều trị tiểu ñường, ung thư, trẻ em suy dinh dưỡng, bệnh gan, bệnh tim mạch, viêm thận, cao huyết áp và trị rắn ñộc cắn (Xiao – Xue Wang và cộng sự, 2011)

Theo tác giả Cai Wen-yan (2008) ñã ñánh giá hoạt ñộng kháng khuẩn

và nồng ñộ ức chế tối thiểu của nước chiết toàn cây Lan kim tuyến kết quả cho thấy nước chiết xuất của toàn cây có khả năng ức chế sự tăng trưởng của

4 loại vi khuẩn và 2 loại nấm thí nghiệm, tương tự tác dụng ức chế trên vi khuẩn mạnh hơn trên nấm với nồng ñộ không cao hơn 12,5mg/ml ñối với vi khuẩn và 25mg/ml ñối với nấm

Shi-Chao Cui và cộng sự (2012) ñã nghiên cứu tác dụng hạ ñường

huyết và chống oxy hóa bằng chất alloxan ñược chiết xuất từ A roxburghii ñể

thử nghiệm trên những con chuột mắc bệnh tiểu ñường Với liều từ 2g/kg trong 14 ngày ñã làm giảm ñáng kể lượng ñường trong máu, giảm

cholesterol Ngoài ra làm tăng các hoạt ñộng của enzym chất chống oxy hóa

và mức ñộ vitamin E trong gan và thận của chuột bị tiểu ñường

Yonghui Zhang và công sự (2007) ñã thử nghiệm trên chuột, với việc

dùng hoạt chất kinsenoside có trong Lan A roxburghii ở liều lượng 15mg/1kg

trọng lượng cơ thể, ñiều khiển ñược hoạt ñộng của các enzym chống oxy hóa, loại bỏ các gốc tự do và giảm hàm lượng NO-, làm tăng các tế bào β nguyên vẹn trong tuyến nội tiết sản sinh insulin ở chuột ñược ñiều trị so với chuột không ñược ñiều trị bằng hoạt chất kisennoside

1.2.6 Thực trạng khai thác và phát triển cây Lan A roxburghii (Wall.)

Lindl.)

Ở Việt Nam Lan kim tuyến có phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể không nhiều, tái sinh chậm ñòi hỏi ñiều kiện sống ngặt nghèo ngày càng hiếm Do bị thu hái nhiều ñể bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài Lan kim tuyến ñang bị ñe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, Lan kim tuyến ñược xếp trong nhóm IA của Nghị ñịnh 32/2006/Nð-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục ñích thương mại và nhóm thực vật ñang nguy cấp EN A1a,c,d (Sách ñỏ Việt Nam, 2007)

1.3 Nuôi trồng Lan kim tuyến

Lan kim tuyến là cây sinh trưởng rất chậm, tuy nhiên trong ñiều kiện thuận lợi chúng vẫn phát triển tốt Những ñiều kiện ñó là: nhiệt ñộ, ñộ ẩm và che bóng thích hợp Ngoài ra Lan kim tuyến phát triển trên các giá thể như là: rêu, dớn, tổ quạ, xơ dừa, than, gạch vụn, vỏ cây

1.3.1 Ánh sáng

Lan kim tuyến phát triển những nơi có ánh sáng yếu Ánh sáng thích hợp cho Lan kim tuyến 30 – 40% so với ánh sáng tự nhiên

1.3.2 Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ thích hợp cũng tùy thuộc vào từng loài, tùy thuộc vào ñịa ñiểm phát sinh của chúng Nói chung, nhiệt ñộ lý tưởng cho Lan kim tuyến 13° - 16°C vào ban ñêm, 24° - 30°C vào ban ngày Cây sẽ chịu ñược nhiệt ñộ

100C và lên tới 380C trong một thời gian ngắn, ở nhiệt ñộ cao hơn cần tạo sự thông gió tốt trong vườn

1.3.4 Nguồn nước tưới

Dùng bất cứ nguồn nước tưới nào cho Lan kim tuyến cũng ñược, miễn

là nước sạch, không mặn, không vôi, không có clo và có ñộ pH 5,5 – 7 ðối với những cây lan con trồng trong chậu yêu cầu tưới phun sương nhẹ Lan kim tuyến cần ñộ ẩm cao, nhưng cũng cần sự thông thoáng tạo ra không gian thích hợp làm cho cây sinh trưởng phát triển

1.4 Một số nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn cây Lan kim tuyến

1.4.1 Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến trên thế giới

Những năm gần ñây, thuốc ñông dược trở thành một ñề tài quan trọng mang tính toàn cầu Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong ñiều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn ñược dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa Theo các ñánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học Vấn ñề ñặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc ñang biến mất nhanh chóng do sự không ổn ñịnh của ñiều kiện môi trường và các yếu tố khác Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu ñủ lớn ñể tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm ðiều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính ñến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác ñể cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này Trong những năm gần ñây, trên thế giới ñã có nhiều cơ sở nghiên cứu tìm các biện pháp nhân giống loài Lan kim tuyến quí hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng

Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loài Lan

A sikkimensis và A regalis Hai loài Lan kim tuyến này ñược nuôi cấy trên

môi trường WPM sau 12 tuần tỷ lệ callus ñược tạo ra 4,8 - 5,6 và số chồi tương ứng 95 – 98% Khi mẫu ñược cấy chuyển sang môi trường tương tự

trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi ñỉnh là 8,2 ñối với loài A regalis, sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê Còn ñối với loài A sikkimensis sự bật chồi

chậm hơn, số chồi bên ñạt 12,3 và chồi ñỉnh là 4,3 Các chồi dài (4 - 6cm) ñược cấy sang môi trường có chứa (2,70 µM) NAA và 0,2% than hoạt tính Các cây có khả năng sống 95 - 98% trong các chậu Sau 6 tháng trồng trong

nhà kính, Lan A regalis ñược ñưa ra môi trường tự nhiên với tỷ lệ sống là

95% và sau 12 tháng tỷ lệ sống còn 70% Các cây trồng trong chậu hay

ngoài môi trường tự nhiên ựều không bị thay ựổi về hình thái và khả năng sinh trưởng

Yih-Juh Shiau và cộng sự (2001) ựã bảo tồn A formosanus Hayata bằng phương pháp thụ phấn nhân tạo và nuôi cấy hạt in vitro Các tác giả ựã tối ưu hóa phương pháp tăng sinh khối các hạt giống A formosanus qua thụ

phấn chéo và nảy mầm hạt giống không cộng sinh với nấm Tỷ lệ thành công nhờ thụ phấn bằng tay ựạt 86,7%, các hạt giống sau khi thụ phấn 7 tuần thì ựược nảy mầm trên môi trường ơ MS và MS có bổ sung 0,2% than hoạt tắnh

và 8% dịch chuối sau 4 tháng nuôi cấy Các hạt giống nảy mầm ựược nuôi cấy trong môi trường ơ MS lỏng có chứa 2,0mg/L BA trong 2 tháng nuôi cấy Cây giống trước khi ựưa ra ngoài vườn ươm, ựược nuôi trồng trên môi trường 1/2MS có bổ sung 0,2% than hoạt tắnh, 8% dịch chuối, 2,0mg/L BA và 0,5 mg/L NAA cho thân và rễ phát triển tốt hơn Có khoảng 90% cây nuôi cấy từ hạt 2 tháng tuổi ựược ựưa ra bầu với hỗn hợp rêu + than bùn

Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A roxburghii tác giả

Huang H và cộng sự (2002) ựã tìm ra ựược môi trường Knudson C có bổ sung 0,5mg/L BA + 20% dịch khoai tây là thắch hợp nhất cho sự phát triển

protocorm từ hạt của A roxburghii

Vi nhân giống cây A formossanus ựược tác giả Ket N.V và cộng sự

(2004) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý có nguy cơ bị tuyệt diệt đã tìm ra ựược môi trường nhân nhanh cụm chồi thắch hợp nhất là môi trường Hyponex có bổ sung 1g dmỜ3Benzyl adenin hoặc 1Ờ2mg dmỜ3

Thidiazuron (TDZ) Bổ sung 1g dmỜ3 than hoạt tắnh vào môi trường có chứa TDZ thúc phát triển nhiều chồi (11,1 chồi/mô cấy) Tuy nhiên, tốc ựộ chồi tái sinh chậm và không kéo dài thân Trên môi trường H3 bổ sung 2% ựường và 0,5g dmỜ3 than hoạt tắnh thắch hợp cho sự phát triển của cụm chồi và tỷ lệ cây

ra rễ là 100%

Y.J Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài Lan kim

tuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl var.) bằng phương pháp gieo hạt in

vitro Các hạt ñược cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung 3% sucrose and

0,85% thạch Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ½ MS bổ sung 0,2% hoạt tính, 8% dịch chuối, 0,1mg dm−3 (TDZ) và 1,0mg dm−3 (NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt Có tới 96% cây sống sau khi chuyển ra nhà kính

X F Xu (2008) tiến hành nghiên cứu nhân nhanh và nuôi trồng cây A

formosanus Các kết quả cho thấy, môi trường B5 + 5mg/L BA + 0,3mg/L

NAA là thích hợp nhất cho nhân chồi Môi trường MS + 5mg/L IBA là thích hợp nhất cho sự ra rễ Các cây ra ngoài vườn ươm, phun 0,2% carbamide, 0,2% KH2PO4 4 lần và nửa tháng/lần Sau 4-5 tháng cây phát triển ñến chiều dài 10cm, 1-2g trọng lượng tươi có thể thu hoạch

Zhang F và cộng sự (2009) ñã ứng dụng phần mềm SPSS trong nuôi

cấy mô cây A roxburghii, các cây ñược thu hoạch sau khi nuôi cấy 60 ngày

Các thí nghiệm của ông nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và BA ñến số

lá, chồi ñỉnh, chồi bên và chiều cao của chồi Tất cả số liệu ñược sử lý bằng phần mềm SPSS Kết quả các nồng ñộ NAA khác nhau từ <1mg/L hoặc

>1mg/L ñều có ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng và phát triển của A roxburghii

Trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L NAA và 1mg/L BA thích hợp nhất cho phát triển các chồi ñỉnh, với nồng ñộ 1mg/L NAA và 2mg/L BA thích hợp nhất cho sự phát triển của chồi bên và hệ số nhân chồi Các nồng ñộ khác nhau của NAA và BA ñều có ảnh hưởng khác nhau ñến sự tăng trưởng giữa

chồi ñỉnh và chồi bên của A roxburghii

Zhou YuMei và cộng sự (2009) ñã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân

nhanh giống cây A formosanus Kết quả cho thấy: Môi trường tối ưu cho

nhân nhanh chồi là môi trường MS bổ sung 0,1mg/L TDZ, 5% nước dừa và

3% ñường Môi trường thích hợp cho rễ phát triển là môi trường MS bổ sung 0,1mg/L BA + 0,5mg/L IBA và 2g/L than hoạt tính Giá thể ra cây trong vườn ươm tốt nhất là rêu và sử dụng dinh dưỡng Hyponex 2 (20: 20: 20) bón tốt

nhất cho cây A formosanus trong vườn ươm

Qiu Yue và cộng sự (2010) ñã tiến hành nghiên cứu nảy mầm của hạt

giống và nhân nhanh protocorm loài A roxburghii Thí nghiệm nghiên cứu

về nảy mầm không cộng sinh với nấm của hạt giống A roxburghii và ảnh

hưởng của 4 yếu tố (môi trường nuôi cấy, chất BA, ZT và NAA) ñến việc

nhân nhanh protocorm của loài A roxburghii Kết quả cho thấy rằng: kiểu

thụ phấn là một nhân tố quan trọng ñối với sự nảy mầm của hạt giống không

cộng sinh với nấm ở A roxburghii, tỷ lệ nảy mầm của hạt giống giao phấn

ñạt 78,53% và hạt giống thụ phấn khác hoa cùng gốc ñạt 69,62% còn ở hạt giống tự thụ thì tỷ lệ nảy mầm chỉ ñạt 39,87% Quả nang phát triển 150 ngày

là thời gian thành thục nhất, tỷ lệ nảy mầm của hạt giống có thể ñạt 78,59% Sức sống của hạt giống bị ảnh hưởng bởi thời gian bảo quản lạnh và khi tăng thời gian bảo quản trong kho lạnh lên thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giống giảm

Xử lý hạt giống bằng NaOCl 10% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giống không thay ñổi so với việc không xử lý NAA ảnh hưởng rất tốt ñến sự tăng nhanh

protocorm, môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nhân nhanh protocorm là

½ MS + 0,5mg/L ZT + 1,0mg/L NAA

Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn

và phát triển cây A elatus Lindley, tác giả N Ahamed Sherif và cộng sự (2012) ñã sử dụng chồi ñỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Trên môi trường MS có bổ sung 3,0mg/L TDZ và 3,5mg/L Kin thích hợp nhất cho nhân nhanh cụm chồi Tỷ lệ ra rễ ñạt cao nhất khi bổ sung vào môi trường 0,3g/L than hoạt tính

1.4.2 Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến ở

Việt Nam

Việt Nam ñược xếp thứ 16 trong số các nước có ña dang sinh học cao nhất thế giới Nhưng sự ña dạng sinh học của nước ta ñang bị suy thoái ở mức báo ñộng Diện tích rừng bị giảm rất nhanh kéo theo nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài ñộng thực vật quý hiếm trong ñó có các loài Lan nói chung và Lan kim tuyến nói riêng Con người ñang khai thác tự nhiên một cách quá mức, thậm chí huỷ diệt nguồn tài nguyên thiên nhiên ñể phục vụ nhu cầu trước mắt

mà quên mất những hiểm họa kéo theo sau ñó trong tương lai Việc duy trì ña dạng sinh học có vai trò rất quan trọng trong ñời sống vật chất và tinh thần của con người, cũng như trong việc duy trì các chu trình tự nhiên và sự cân bằng sinh thái

Các kết quả nghiên cứu nhân giống Lan kim tuyến ở Việt Nam còn rất hạn chế Chỉ trong một số năm gần ñây mới có một vài tác giả công bố các kết quả nghiên cứu về nhân giống loài Lan này Rõ rệt nhất là tác giả Phùng Văn Phê và cộng sự (2010), theo ông môi trường phù hợp nhất ñể nhân nhanh chồi

Lan kim tuyến (A roxburghii (Wall.) Lindl.) in vitro là Knud Thể chồi 8 tuần

tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2 - 3cm là phù hợp nhất ñể nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud bổ sung 0,5mg/L BAP + 0,3mg/L Kinetin + 0,3mg/L NAA + 100ml/L nước dừa + 100g/L dịch chiết khoai tây + 20g/L ñường + 7g/L thạch + 0,5g/L than hoạt tính

Gần ñây nhất theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012), cho biết cơ quan vào mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt ñốt ngang thân ñối với loài Lan

kim tuyến Anoectochilus setaceus ñược khử trùng và ñưa vào các môi trường

nền khác nhau (MS, Knud, Knudson) Các chồi và mắt ñốt ñược chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BA, Kinetin, αNAA trong 4 tuần Môi trường thích hợp nhất ñể nhân nhanh thể chồi và mắt ñốt ngang thân là Knud