4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài
1.1.4. Các giai ựoạn chắnh trong quá trình nhân giống nuôi cấy in vitro
Theo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tắnh in vitro bao gồm các bước sau:
Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, ựặc biệt là bệnh virus và ở giai ựoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong ựiều kiện môi trường thắch hợp với chế ựộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 1: Nuôi cấy khởi ựộng
Là giai ựoạn khử trùng ựưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai ựoạn này cần ựảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn ựúng loại mô, ựúng giai ựoạn phát triển của cây. Quan trọng nhất là ựỉnh chồi ngọn, ựỉnh chồi nách và sau ựó là ựỉnh chồi hoa và cuối cùng là ựoạn thân, mảnh lá...
Bước 2: Nhân nhanh
Là giai ựoạn kắch thắch mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con ựường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất ựịnh và tạo phôi vô tắnh. Vấn ựề là phải xác ựịnh ựược môi trường và ựiều kiện ngoại cảnh thắch hợp ựể có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 16
nhiều cytokinin sẽ kắch thắch tạo chồi. Chế ựộ nuôi cấy thường là 25 - 270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường ựộ ánh sáng 2000 - 4000 lux.
Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường ựược bỏ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất ựiều tiết sinh trưởng. Theo Murashige, giai ựoạn này là giai ựoạn ưu tiên cho sự tạo rễ của chồi ựể sau ựấy có thể chuyển chúng sang môi trường trồng trọt tự nhiên. Tạo rễ cho chồi là một phần rất quan trọng của bất kỳ quy trình nhân in vitro nào. đôi khi một số chồi cần ựược kéo dài trước khi tạo rễ. để giảm chi phắ nhân giống, nhiều phòng thắ nghiệm chuyển chồi không rễ từ môi trường in vitro và tạo rễ từ bên ngoài phòng nuôi cấy.
Bước 4: Thắch ứng cây in vitro ngoài ựiều kiện tự nhiên
để ựưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần ựảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống nghiệm ựã ựạt ựược những tiêu chuẩn hình thái nhất ựịnh (số lá, số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thắch hợp: Giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
+ Phải chủ ựộng ựiều chỉnh ựược ẩm ựộ, sự chiếu sáng của vườn vươm cũng như chế ựộ dinh dưỡng phù hợp.
Trong những năm gần ựây, nhân giống in vitro ựược áp dụng nhiều trong nhân giống cây trồng. Những ựặc ựiểm nổi bật của nhân giống in vitro
là cho hệ số nhân lớn (thường ựạt ựược ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36Ờ 1012/năm) trong một thời gian ngắn, dễ dàng sản xuất cây sạch bệnh, khỏe mạnh; Phương pháp nhân giống vô tắnh bằng nuôi cấy in vitro nhanh và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 17
hiệu quả, ựặc biệt ựược áp dụng cho các loài hoa, cây thuốc, cây ựặc sản quý hiếm có giá trị kinh tế cao.
1.2. Một vài nét về Lan kim tuyến
Chi Anoectochilus thuộc họ lan có hơn 40 loài có mặt ở hầu khắp các nước nhiệt ựới trải dài từ dãy Himalaya của Ấn độ ựến vùng đông Nam Á và kéo dài tới Hawai. Trong chi Anoectochilus có một số loài ựược sử dụng ựể làm thuốc ở Trung Quốc như: A. formosanus Hayata, A. koshunensis Hayata,
và A. roxburghii (Wall.) Lindl. Trong các loài này thì hai loài A. formosanus
Hayata và A. koshunensis Hayata chỉ phân bố ở đài Loan Ờ Trung Quốc và Okinawa Ờ Nhật Bản. A. roxburghii phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Srilanka, Ấn độ, Nepal và Việt Nam (Zhong HJ và công sự, 2000).