4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài
3.3.2.Ảnh hưởng của αNAA tới giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh
αNAAlà chất ựiều hoà sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, thường ựược sử dụng hầu hết trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, có tác dụng tạo rễ cho chồi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 68
Nó ựược sử dụng khác nhau phụ thuộc vào loài cây trồng cụ thể và thường ựược sử dụng dao ựộng từ 0,5 - 5mg/L.
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.10 cho thấy tại 1,0g/L than hoạt tắnh có tác dụng rất tắch cực tới việc tạo cây hoàn chỉnh của cây lan, nhưng số rễ của cây vẫn chưa ựược khỏe và nhiều. Vì vậy, chúng tôi chọn than hoạt tắnh có hàm lượng 1,0g/L kết hợp với các nồng ựộ αNAA khác nhau: 0; 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5mg/L vào môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 1,0g/L than hoạt tắnh, pH 5,5 ựể tiếp tục các thắ nghiệm nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh. Sau 8 tuần theo dõi ựược kết quả ựược trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của αNAA tới giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh
CTTN Nồng ựộ αNAA (mg/L) Chiều cao TB của cây (cm) Số lá TB (lá) Số rễ TB (rễ) Hình thái rễ CT1(đ/C) 0,0 5,68 d 3,80 b 3,54 c đầu rễ nâu CT2 0,3 5,90 cd 3,96 b 3,89 b đầu rễ nâu, ngắn CT3 0,6 6,59 a 4,38 a 4,11 a đầu rễ trắng, nhiều lông hút nhỏ, mập và dài ựều CT4 0,9 6,21 b 4,17 ab 3,85 b đầu rễ trắng, dài CT5 1,2 5,92 c 4,01 b 3,60 c đầu rễ trắng, mảnh CT6 1,5 5,30 e 3,82 b 3,57 c đầu rễ nâu, yếu
LSD 0,05 0,22 0,24 0,15
CV (%) 2,1 3,3 2,2
Ghi chú: đ/C: Nền môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 1,0g/L than hoạt tắnh, pH 5,5.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 69
Kết quả nghiên cứu cho thấy αNAA có ảnh hưởng rõ rệt ựến sự sinh trưởng và phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. Chiều cao cây, số lá, số rễ tăng lên rất nhiều khi bổ sung với nồng ựộ 0,6mg/L αNAA cụ thể: chiều cao trung bình của cây ựạt 6,59cm, số lá trung bình ựạt 4,38 lá, số rễ trung bình ựạt 4,11 rễ ựược xếp ở mức ỘaỢ. Trong khi ở công thức ựối chứng (không bổ sung αNAA) các chỉ tiêu theo dõi chỉ ựạt là: chiều cao trung bình của cây 5,68cm xếp ở mức ỘdỢ, số lá trung bình ựạt 3,80 lá xếp ở mức ỘbỢ, số rễ trung bình ựạt 3,54 rễ xếp ở mức ỘcỢ. Tuy nhiên khi tăng nồng ựộ αNAA lên quá 0,9mg/L các chỉ tiêu trên lại có xu hướng giảm dần. Ở công thức 4 (0,9mg/L αNAA) chiều cao trung bình của cây ựạt 6,21cm xếp ở mức ỘbỢ, số lá trung bình ựạt 4,17 lá xếp ở mức ỘabỢ và số rễ trung bình ựạt 3,85 xếp ở mức ỘbỢ. Ở công thức 5 (1,2mg/L αNAA) chiều cao trung bình của cây ựạt 5,92cm, số lá trung bình 4,01 lá xếp ở mức ỘbỢ và số rễ trung bình ựạt 3,60 rễ xếp ở mức ỘcỢ. Ở công 6 có nồng ựộ αNAA cao nhất 1,5mg/L thì các chỉ tiêu theo dõi ựiều giảm và còn thấp hơn so với ựối chứng cụ thể: Chiều cao trung bình của cây chỉ ựạt 5,30cm xếp ở mức ỘeỢ, số lá trung bình ựạt 3,82 lá xếp ở mức ỘbỢ, số rễ trung bình ựạt 3,57 rễ ựược xếp ở mức ỘcỢ, trong so sánh LSD.
Về chất lượng rễ cho thấy: Bổ sung 0,6mg/L αNAA chất lượng rễ rất tốt, rễ ra nhanh hơn, ựầu rễ trắng, mập và dài ựều hơn các công thức thắ nghiệm khác. Khi tăng nồng ựộ αNAA lên cao 1,5mg/L sẽ ức chế sự sinh trưởng của rễ thể hiện là số rễ và chiều dài rễ giảm, rễ có hiện tượng nâu hóa và yếu.
Như vậy: Ở công thức 3 có bổ sung 0,6mg/L αNAA vào môi trường (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 1,0g/L than hoạt tắnh, pH 5,5) là thắch hợp nhất cho sự sinh trưởng phát triển của cây trước khi ra ngoài vườn ươm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 70
Hình 3.3. Tạo cây hoàn chỉnh in vitro 3.4. Giai ựoạn ựưa cây in vitro ra vườn ươm
đây là giai ựoạn có ý nghĩa vô cùng quan trọng, quyết ựịnh khả năng ứng dụng của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro vào thực tiễn sản xuất. đây cũng là giai ựoạn gặp phải rất nhiều khó khăn cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm kéo theo sự thay ựổi ựột ngột các ựiều kiện sống từ môi trường nhân tạo sang ựiều kiện tự nhiên có nhiều yếu tố tự nhiên khó ựiều khiển ựược như: ánh sáng, nhiệt ựộ, ựộ ẩm, nấm, bệnh...
để có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt khi ựưa ra ngoài vườn ươm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số nền giá thể và một số loại phân bón khác nhau ựối với cây Lan con nuôi cấy in vitro.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 71
3.4.1. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ựến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
Cây Lan con ra rễ tốt trong ựiều kiện in vitro trên môi trường MS bổ sung 0,6 mg/L αNAA và 1,0 g/L than hoạt tắnh, ựược dùng ựể làm thắ nghiệm tiếp theo.
Mỗi một giá thể có ựặc tắnh khác nhau, sẽ phù hợp với mỗi loài cây trồng cũng như trong giai ựoạn vườn ươm chúng có yêu cầu khác nhau ựối với ựiều kiện ngoại cảnh. Nhìn chung, giá thể tốt là giá thể có khả năng giữ ẩm và thoát nước tốt, có khả năng cung cấp dinh dưỡng cho cây con giai ựoạn ựầu dễ dàng tiếp cận với môi trường sống tự nhiên. Cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. sau nuôi cấy mô có yêu cầu rất chặt chẽ ựối với ựiều kiện môi trường. Cụ thể: yêu cầu ựộ ẩm cao nhưng không bị úng, nhiệt ựộ môi trường không quá cao, giá thể sạch và có khả năng cung cấp dinh dưỡng cho giai ựoạn cây con trong vườn ươm. để xác ựịnh giá thể phù hợp, chúng tôi tiến hành thử nghiệm ra cây vào vụ thu và trồng trên 3 loại giá thể khác nhau, kết quả ựược trình bày qua bảng sau 3.12 và hình 3.4.
Qua bảng cho thấy: Các giá thể khác nhau ựã cho khả năng sống và sinh trưởng của cây con in vitro là khác nhau. Trên giá thể dớn tổ quạ có tỉ lệ sống của lan con ựạt thấp nhất 60,87%; chiều cao trung bình của cây ựạt 5,93cm, số rễ mới trung bình xuất hiện 1,58 rễ ựược xếp ở mức ỘcỢ. Còn số lá trung bình và số nhánh trung bình là 3,47 lá và 1,09 nhánh xếp ở mức ỘcỢ trong so sánh LSD. điều này có thể giải thắch là do loại giá thể này không có chất dinh dưỡng cung cấp cho cây trồng ban ựầu, kết hợp với ựộ thông thoáng của giá thể thấp, khả năng giữ nước quá cao, ựã gây ra hiện tượng thối rễ. Qua quan sát, cho thấy hình thái cây và màu sắc của lá cây yếu và nhỏ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 72
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ựến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần)
Chỉ tiêu theo dõi Công thức thắ nghiệm Chiều cao TB của cây (cm) Số lá TB (lá) Số nhánh TB (nhánh) Số rễ mới TB xuất hiện (rễ) CT1 6,14 b 4,22 a 1,21 b 1,75 b CT2 5,93 c 3,47 b 1,09 b 1,58c CT3 6,38 a 4,36 a 1,46 a 1,99 a LSD 0,05 0,11 0,14 0,19 0,13 CV (%) 0,9 1,7 7,4 3,6
Ghi chú: a, b, c: so sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức xác suất 95% Công thức 1: Rêu Sphagnum moss
Công thức 2: Dớn tổ quạ
Công thức 3: Rêu Sphagnum moss : Dớn tổ quạ
82,07 60,87 88,17 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 T ỷ l ệ s ố n g ( % ) CT1 CT2 CT3 Công thức thắ nghiệm
Hình 3.4. Ảnh hưởng của giá thể trồng khác nhau ựến tỷ lệ sống của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 73 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với giá thể rêu Sphagnum moss, có tỉ lệ sống của lan con ựạt tương ựối cao 82,07 %; chiều cao trung bình của cây ựạt 6,14cm, số nhánh trung bình là 1,21 nhánh, số rễ mới trung bình ựạt 1,75 rễ ựược xếp ở mức ỘbỢ trong so sánh LSD. Ở giá thể rêu Sphagnum moss tuy số lá trung bình ựạt khá cao 4,22 lá/ cây ựược xếp ở mức ỘaỢ, nhưng qua quan sát chúng tôi thấy giá thể này cây phát triển ở mức khá, bộ rễ lại không bám chắc vào giá thể.
Trên loại giá thể phối trộn rêu Sphagnum moss : dớn tổ quạ (1:1) ựã cho tỷ lệ sống cao nhất ựạt 88,17%. Các chỉ tiêu sinh trưởng khác: chiều cao trung bình của cây ựạt 6,38cm; số lá trung bình ựạt 4,36 lá; số nhánh trung bình là 1,46 nhánh và số rễ mới trung bình cũng ựạt cao nhất 1,99 rễ ựược xếp ở mức ỘaỢ trong so sánh LSD. Trên giá thể này do sự phối hợp của hai giá thể rêu Sphagnum moss + dớn tổ quạ ựã bổ sung cho nhau tạo ựiều kiện cung cấp ựầy ựủ dinh dưỡng cho cây con, có khả năng giữ và thoát nước tốt. Qua quan sát chúng tôi thấy cây cứng cáp, lá xanh bóng, rễ khỏe và bám chắc vào giá thể.
Như vậy, giá thể thắch hợp nhất cho cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. trong giai ựoạn vườn ươm là giá thể phối trộn rêu Sphagnum moss : dớn tổ quạ (1:1) cho tỷ lệ cây sống cao và giá thành rẻ hơn rêu ngoại.
3.4.2. Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ựến sự sinh trưởng phát triển cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. phát triển cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
Phân bón là một trong những yếu tố quan trọng quyết ựịnh ựến quá trình sinh trưởng, phát triển của cây trồng. Cây Lan rất nhảy cảm với yếu tố dinh dưỡng, nếu dinh dưỡng ựầy ựủ không những giúp cây trồng sinh trưởng, phát triển tốt mà còn cho năng suất, cũng như chất lượng cao.
Dựa vào kết quả nghiên cứu về loại giá thể thắch hợp, ựề tài ựã chọn loại giá thể rêu Sphagnum moss : dớn tổ quạ tỷ lệ (1:1) ựể tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau nhằm tìm ra loại phân bón
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 74
thắch hợp nhất cho sinh trưởng của cây lan con sau khi ra vườn ươm. Ảnh hưởng của phân bón lên sinh trưởng của cây lan con ựược thể hiện tại ở bảng 3.13 và hình 3.5.
Sau 12 tuần theo dõi về phun loại phân bón HVP ựã có các chỉ tiêu ựều thấp hơn so với phân bón Growmore và B1- Thái Lan cụ thể là: Chiều cao trung bình của cây chỉ ựạt 6,92cm, số lá trung bình ựạt 4,53 lá; số nhánh là 1,29 nhánh xếp ở mức ỘbỢ, số rễ mới trung bình xuất hiện 2,22 rễ xếp ở mức ỘcỢ. Cũng như hình thái, màu sắc của lá nhỏ và xanh nhạt.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau ựến sự sinh trưởng phát triển của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần)
Chỉ tiêu theo dõi Loại phân bón Chiều cao TB của cây (cm) Số lá TB (lá) Số nhánh TB (nhánh ) HVP (30:10:10) 6,92 c 4,53 c 1,29 b Growmore (30:10:10) 7,21 b 4,89 b 1,61 b B1 -Thái Lan 7,53 a 5,24 a 1,86 a LSD 0,05 0,12 0,18 0,13 CV (%) 0,8 1,9 4,1
Ghi chú: a, b, c: so sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức xác suất 95%).
Tại các công thức phun loại phân bón Growmore, nhận thấy cây sinh trưởng và phát triển khá tốt, thể hiện ở các chỉ tiêu như: chiều cao trung bình của cây ựạt 7,21cm; số lá trung bình ựạt 4,89; số nhánh trung bình là 1,61 nhánh; số rễ mới trung bình ựạt 2,36 rễ ựược xếp ở mức ỘbỢ trong so sánh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 75
LSD. Về chất lượng cây qua quan sát nhận thấy cây tương ựối khỏe và lá xanh. 2,62 2,36 2,22 2 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7
HVP (30:10:10) Growmore (30:10:10) B1 -Thái Lan
Loại phân bón S ố r ễ m ớ i T B x u ấ t h iệ n ( rễ ) Hình 3.5. Ảnh hưởng của một số loại phân bón ựến số rễ mới xuất hiện
của cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (sau 12 tuần)
Với loại phân bón B1- Thái Lan cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất so với hai loại phân bón trên. Chiều cao trung bình của cây ựạt cao nhất 7,53cm; số lá trung bình ựạt 5,24 lá; số nhánh trung bình là 1,86 nhánh và số rễ mới trung bình cũng ựạt cao nhất 2,62 rễ ựược xếp ở mức ỘaỢ trong so sánh LSD. Khi quan sát hình thái cây, chúng tôi cũng thấy phun loại phân bón này cây mập, bộ lá và rễ phát triển tốt hơn ở 2 loại còn lại.
Như vậy, ở giai ựoạn vườn ươm có thể sử dụng phân bón lá B1 ỜThái Lan phun 1tuần/lần với liều lượng 0,5g/L. Khi phun phân bón này cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất, cây xanh khỏe và có bộ rễ mập và dài.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 76
Hình 3.6. Cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. nuôi cấy mô sinh trưởng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 77
Từ các kết quả nghiên cứu thu ựược, chúng tôi ựi ựến ựề xuất quy trình nhân giống in vitro với loài Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. như sau:
Vật liệu nuôi cấy (1)
Chồi bên, chồi ựỉnh
Khử trùng mẫu (2)
NaOCl 3% + 15 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tạo vật liệu khởi ựầu (3)
MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 2,0mg/L BA + 6,5g/L thạch, pH 5,5
(4 tuần)
Nhân nhanh cụm chồi (4)
MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 2,0mg/L BA + 1,0mg/L αNAA + 80g/L dịch nghiền khoai tây + 6,5g/L
thạch, pH 5,5 (8 tuần)
Tạo cây hoàn chỉnh in vitro (5)
MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 1,0g/L than hoạt tắnh + 0,6mg/L αNAA + 6,5g/L thạch, pH 5,5
(8 tuần)
Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm (6)
Giá thể: rêu Sphagnum moss + dớn tổ quạ (1:1)
Bón phân B1 ỜThái Lan, phun 1tuần/lần với liều lượng 0,5 g/L (12 tuần)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 78
Bước 1: Chọn nguyên liệu khởi ựầu
Chồi bên, chồi ựỉnh lấy từ cây mẹ trưởng thành nhằm hạn chế tối ựa mẫu nhiễm và sự biến dị soma về sau.
Bước 2: Khử trùng mẫu
Các mẫu cây ựược khử trùng bằng NaOCl 3% trong 15 phút có tỷ lệ sống cao nhất (65,5%).
Bước 3: Tạo vật liệu khởi ựầu (4 tuần)
Trên môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 2,0mg/L BA + 6,5g/L thạch, pH 5,5 cho hệ số nhân chồi ựạt 4,44 lần; chiều cao trung bình của chồi ựạt 2,53cm
Bước 4: Nhân nhanh cụm chồi (8 tuần)
Chồi hình thành trong bước (3) tiếp tục cấy chuyển sang môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 2,0mg/L BA + 1,0mg/L αNAA + 80g/L dịch nghiền khoai tây + 6,5g/L thạch, pH 5,5 cho hệ số nhân chồi cao nhất 21,83 chồi; chiều cao trung bình của chồi ựạt 4,31cm; chất lượng chồi tốt nhất, kéo dài tuổi thọ của chồi trong nhân nhanh.
Bước 5: Tạo cây hoàn chỉnh in vitro (8 tuần)
Tách các chồi từ cụm chồi cấy sang môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 1,0g/L than hoạt tắnh + 0,6mg/L αNAA + 6,5g/L thạch, pH 5,5 cho chiều cao trung bình của cây ựạt cao nhất 6,59cm; số lá trung bình 4,38 lá; số rễ trung bình ựạt 4,11 rễ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 79