4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài
1.4.1.Nghiên cứu nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Lan kim tuyến
trên thế giới
Những năm gần ựây, thuốc ựông dược trở thành một ựề tài quan trọng mang tắnh toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong ựiều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn ựược dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các ựánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn ựề ựặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc ựang biến mất nhanh chóng do sự không ổn ựịnh của ựiều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu ựủ lớn ựể tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tắnh ựến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác ựể cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này.
Trong những năm gần ựây, trên thế giới ựã có nhiều cơ sở nghiên cứu tìm các biện pháp nhân giống loài Lan kim tuyến quắ hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng.
Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loài Lan
A. sikkimensis và A. regalis. Hai loài Lan kim tuyến này ựược nuôi cấy trên môi trường WPM sau 12 tuần tỷ lệ callus ựược tạo ra 4,8 - 5,6 và số chồi tương ứng 95 Ờ 98%. Khi mẫu ựược cấy chuyển sang môi trường tương tự trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi ựỉnh là 8,2 ựối với loài A. regalis, sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê. Còn ựối với loài A. sikkimensis sự bật chồi chậm hơn, số chồi bên ựạt 12,3 và chồi ựỉnh là 4,3. Các chồi dài (4 - 6cm) ựược cấy sang môi trường có chứa (2,70 ộM) NAA và 0,2% than hoạt tắnh. Các cây có khả năng sống 95 - 98% trong các chậu. Sau 6 tháng trồng trong nhà kắnh, Lan A. regalis ựược ựưa ra môi trường tự nhiên với tỷ lệ sống là 95% và sau 12 tháng tỷ lệ sống còn 70%. Các cây trồng trong chậu hay
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
ngoài môi trường tự nhiên ựều không bị thay ựổi về hình thái và khả năng sinh trưởng.
Yih-Juh Shiau và cộng sự (2001) ựã bảo tồn A. formosanus Hayata bằng phương pháp thụ phấn nhân tạo và nuôi cấy hạt in vitro. Các tác giả ựã tối ưu hóa phương pháp tăng sinh khối các hạt giống A. formosanus qua thụ phấn chéo và nảy mầm hạt giống không cộng sinh với nấm. Tỷ lệ thành công nhờ thụ phấn bằng tay ựạt 86,7%, các hạt giống sau khi thụ phấn 7 tuần thì ựược nảy mầm trên môi trường ơ MS và MS có bổ sung 0,2% than hoạt tắnh và 8% dịch chuối sau 4 tháng nuôi cấy. Các hạt giống nảy mầm ựược nuôi cấy trong môi trường ơ MS lỏng có chứa 2,0mg/L BA trong 2 tháng nuôi cấy. Cây giống trước khi ựưa ra ngoài vườn ươm, ựược nuôi trồng trên môi trường 1/2MS có bổ sung 0,2% than hoạt tắnh, 8% dịch chuối, 2,0mg/L BA và 0,5 mg/L NAA cho thân và rễ phát triển tốt hơn. Có khoảng 90% cây nuôi cấy từ hạt 2 tháng tuổi ựược ựưa ra bầu với hỗn hợp rêu + than bùn.
Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii tác giả Huang H và cộng sự (2002) ựã tìm ra ựược môi trường Knudson C có bổ sung 0,5mg/L BA + 20% dịch khoai tây là thắch hợp nhất cho sự phát triển protocorm từ hạt của A. roxburghii.
Vi nhân giống cây A. formossanus ựược tác giả Ket N.V và cộng sự (2004) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý có nguy cơ bị tuyệt diệt. đã tìm ra ựược môi trường nhân nhanh cụm chồi thắch hợp nhất là môi trường Hyponex có bổ sung 1g dmỜ3Benzyl adenin hoặc 1Ờ2mg dmỜ3 Thidiazuron (TDZ). Bổ sung 1g dmỜ3 than hoạt tắnh vào môi trường có chứa TDZ thúc phát triển nhiều chồi (11,1 chồi/mô cấy). Tuy nhiên, tốc ựộ chồi tái sinh chậm và không kéo dài thân. Trên môi trường H3 bổ sung 2% ựường và 0,5g dmỜ3 than hoạt tắnh thắch hợp cho sự phát triển của cụm chồi và tỷ lệ cây ra rễ là 100%.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
Y.J. Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài Lan kim tuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl. var.) bằng phương pháp gieo hạt in vitro. Các hạt ựược cấy trên môi trường ơ MS có bổ sung 3% sucrose and 0,85% thạch. Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ơ MS bổ sung 0,2% hoạt tắnh, 8% dịch chuối, 0,1mg dm−3 (TDZ) và 1,0mg dm−3 (NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Có tới 96% cây sống sau khi chuyển ra nhà kắnh.
X F Xu (2008) tiến hành nghiên cứu nhân nhanh và nuôi trồng cây A. formosanus. Các kết quả cho thấy, môi trường B5 + 5mg/L BA + 0,3mg/L NAA là thắch hợp nhất cho nhân chồi. Môi trường MS + 5mg/L IBA là thắch hợp nhất cho sự ra rễ. Các cây ra ngoài vườn ươm, phun 0,2% carbamide, 0,2% KH2PO4 4 lần và nửa tháng/lần. Sau 4-5 tháng cây phát triển ựến chiều dài 10cm, 1-2g trọng lượng tươi có thể thu hoạch.
Zhang F và cộng sự (2009) ựã ứng dụng phần mềm SPSS trong nuôi cấy mô cây A. roxburghii, các cây ựược thu hoạch sau khi nuôi cấy 60 ngày. Các thắ nghiệm của ông nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và BA ựến số lá, chồi ựỉnh, chồi bên và chiều cao của chồi. Tất cả số liệu ựược sử lý bằng phần mềm SPSS. Kết quả các nồng ựộ NAA khác nhau từ <1mg/L hoặc >1mg/L ựều có ảnh hưởng ựến sự sinh trưởng và phát triển của A. roxburghii. Trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/L NAA và 1mg/L BA thắch hợp nhất cho phát triển các chồi ựỉnh, với nồng ựộ 1mg/L NAA và 2mg/L BA thắch hợp nhất cho sự phát triển của chồi bên và hệ số nhân chồi. Các nồng ựộ khác nhau của NAA và BA ựều có ảnh hưởng khác nhau ựến sự tăng trưởng giữa chồi ựỉnh và chồi bên của A. roxburghii.
Zhou YuMei và cộng sự (2009) ựã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống cây A. formosanus. Kết quả cho thấy: Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi là môi trường MS bổ sung 0,1mg/L TDZ, 5% nước dừa và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
3% ựường. Môi trường thắch hợp cho rễ phát triển là môi trường MS bổ sung 0,1mg/L BA + 0,5mg/L IBA và 2g/L than hoạt tắnh. Giá thể ra cây trong vườn ươm tốt nhất là rêu và sử dụng dinh dưỡng Hyponex 2 (20: 20: 20) bón tốt nhất cho cây A. formosanus trong vườn ươm.
Qiu Yue và cộng sự (2010) ựã tiến hành nghiên cứu nảy mầm của hạt giống và nhân nhanh protocorm loài A. roxburghii. Thắ nghiệm nghiên cứu về nảy mầm không cộng sinh với nấm của hạt giống A. roxburghii và ảnh hưởng của 4 yếu tố (môi trường nuôi cấy, chất BA, ZT và NAA) ựến việc nhân nhanh protocorm của loài A. roxburghii. Kết quả cho thấy rằng: kiểu thụ phấn là một nhân tố quan trọng ựối với sự nảy mầm của hạt giống không cộng sinh với nấm ở A. roxburghii, tỷ lệ nảy mầm của hạt giống giao phấn ựạt 78,53% và hạt giống thụ phấn khác hoa cùng gốc ựạt 69,62% còn ở hạt giống tự thụ thì tỷ lệ nảy mầm chỉ ựạt 39,87%. Quả nang phát triển 150 ngày là thời gian thành thục nhất, tỷ lệ nảy mầm của hạt giống có thể ựạt 78,59%. Sức sống của hạt giống bị ảnh hưởng bởi thời gian bảo quản lạnh và khi tăng thời gian bảo quản trong kho lạnh lên thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giống giảm. Xử lý hạt giống bằng NaOCl 10% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt giống không thay ựổi so với việc không xử lý. NAA ảnh hưởng rất tốt ựến sự tăng nhanh
protocorm, môi trường nuôi cấy thắch hợp nhất cho nhân nhanh protocorm là ơ MS + 0,5mg/L ZT + 1,0mg/L NAA.
Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy ựỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây A. elatus Lindley, tác giả N. Ahamed Sherif và cộng sự (2012) ựã sử dụng chồi ựỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Trên môi trường MS có bổ sung 3,0mg/L TDZ và 3,5mg/L Kin thắch hợp nhất cho nhân nhanh cụm chồi. Tỷ lệ ra rễ ựạt cao nhất khi bổ sung vào môi trường 0,3g/L than hoạt tắnh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29