4. đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài
2.1.3. Các giá thể sử dụng trong nghiên cứu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 2.1.4. Các loại phân bón sử dụng Hình 2.4. HVP 1601 WP N: P: K = 30: 10: 10 Hình 2.5. Growmore (Mỹ) N: P: K = 30: 10: 10 Hình 2.6. B1 Thái Lan
a) Phân bón HVP 1601 WP (30:10:10) phân bón qua lá và rễ, giúp cây lan sinh trưởng và phát triển tốt, có xuất xứ từ Việt Nam.
Thành Phần:
+ N tổng số: 30%; P2O5: 10%; K2O: 10%; Ca: 0,05%; B: 0,02%; Cu: 0,05% Fe: 0,15%; Mg: 0,015%; Mg: 0,015%; Mo: 0,005%; S: 0,2%; Zn: 0,15% + Alkylphenoxypolyethoxyenthanol: 0,05%
b) Phân bón Growmore có tỷ lệ N: P: K = 30: 10: 10 là loại phân bón qua lá và rễ, giúp cây lan sinh trưởng và phát triển tốt, có xuất xứ từ Mỹ.
Thành phần:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
+ Cu : 0,05%; Cu Ờ EDTA: 0,05%; Fe: 0,10% ; Fe Ờ EDTA: 0,10%; Mn: 0,05%; Mn Ờ EDTA: 0,05%; Mo: 0,0005%; Zn: 0,05%; Zn Ờ EDTA : 0,05% c) B1 Thái Lan là loại phân bón nước phun qua lá và rễ, giúp cây lan sinh trưởng và phát triển tốt, có xuất xứ từ Thái Lan.
Thành phần:
P2O5: 2,0%; Fe: 0,10%; Fe Ờ EDTA: 0,10%; B1: 0,10 %; α NAA: 0,04%.
2.2. Nội dung nghiên cứu
để ựạt ựược mục ựắch nghiên cứu, ựề tài thực hiện các nội dung chắnh sau ựây:
2.2.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi ựầu cho nuôi cấy in vitro
2.2.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. 2.2.3. Nghiên cứu tạo cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. hoàn chỉnh 2.2.4. Nghiên cứu ựưa cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. ra vườn ươm
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu, khử trùng và nuôi cấy tạo vật liệu khởi ựầu Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
- Các chồi và thân ựược lấy từ cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh ựược rửa sạch, cắt thành từng ựoạn dài 2 Ờ 3 cm. Các mẫu ựược lau bằng cồn 70o, sau ựó khử trùng bằng oxy già(15% H2O2), hypochlorite-Na (3% NaOCl) và rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy trên môi trường Murashige & Skoog (MS)
- Các công thức ựược bố trắ theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu/CT
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Thắ nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 và NaOCl tới
tỷ lệ sống vô trùng của mẫu cấy
Bảng 2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 và NaOCl
Công thức
Thời gian và nồng ựộ xử lý nước oxy già
(H2O2 ) Công thức Thời gian và nồng ựộ xử lý (NaOCl) CT1 15% H2O2+ 5 phút CT1 3% NaOCl + 5 phút CT2 15% H2O2+ 10 phút CT2 3 % NaOCl + 10 phút CT3 15% H2O2+ 15 phút CT3 3 % NaOCl + 15 phút CT4 15% H2O2+ 20 phút CT4 3 % NaOCl + 20 phút CT5 15% H2O2+ 25 phút CT5 3 % NaOCl + 25 phút CT6 3 % NaOCl + 30 phút Môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5 g/L thạch
Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ựến khả năng
tạo chồi từ mẫu cấy ban ựầu
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau ựến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ựầu
Công thức Môi trường khoáng cơ
bản Chất bổ sung
1 Murashige & Skoog (MS)
2 Vacin Went (VW)
3 Robert Ernst (RE)
20g ựường + 100ml nước dừa + 6,5g thạch trong 1lắt môi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Tất cả các công thức ựều bổ sung (20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5 g/L thạch)
Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng BA ựến khả năng tạo
chồi từ mẫu cấy ban ựầu
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5 g/L thạch) CT2: Nền + 0,5mg/L BA CT3: Nền + 1,0mg/L BA CT4: Nền + 1,5mg/L BA CT5: Nền + 2,0mg/L BA CT6: Nền + 2,5mg/L BA CT7: Nền + 3,0mg/L BA
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu nhân nhanh chồi cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. (Wall.) Lindl.
Các chồi in vitro thu ựược trong nuôi cấy ban ựầu chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch pH 5,5 và bổ sung các chất kắch thắch sinh trưởng Kinetin (Kin), Thidiazuron (TDZ), Benzyladenine acid (BA), Naphtyl axetic axit (αNAA) nồng ựộ dao ựộng từ 0,1 Ờ 3,0mg/L tùy theo mục ựắch thắ nghiệm. Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy còn bổ sung hợp chất hữu cơ tự nhiên như dịch nghiền khoai tây...
Các công thức ựược bố trắ theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu/CT.
Các thắ nghiệm tiến hành:
Thắ nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kin ựến khả năng nhân nhanh chồi
Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5 g/L thạch)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37 CT2: Nền + 0,5mg/L Kin CT3: Nền + 1,0mg/L Kin ` CT4: Nền + 1,5mg/L Kin CT5: Nền + 2,0mg/L Kin CT6: Nền + 2,5mg/L Kin
Thắ nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ ựến khả năng nhân nhanh
chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch) CT2: Nền + 0,2mg/L TDZ CT3: Nền + 0,4mg/L TDZ CT4: Nền + 0,6mg/L TDZ CT5: Nền + 0,8mg/L TDZ CT6: Nền + 1,0mg/L TDZ
Thắ nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (TDZ + IBA) ựến khả năng
nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
đề tài tìm hiểu ảnh hưởng của Auxin ựến quá trình phát sinh chồi có sự tương tác với TDZ. đề tài tiến hành bổ sung IBA với các nồng ựộ khác nhau vào môi trường là MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5 g/L thạch + 0,6 mg/L TDZ, pH 5,5 (môi trường này xác ựịnh là môi trường có hệ số nhân chồi cao nhất ở thắ nghiệm trên), nồng ựộ IBA thay ựổi là:
CT1(đ/C ): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 0,6mg/L TDZ )
CT2: Nền + 0,5mg/L IBA CT3: Nền + 1,0mg/L IBA CT4: Nền + 1,5mg/L IBA CT5: Nền + 2,0mg/L IBA
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Thắ nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) ựến khả
năng nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
Từ môi trường tốt nhất ở thắ nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BA ựến khả năng tạo chồi từ mẫu cấy ban ựầu, ựề tài tiến hành bổ sung αNAA ở các nồng ựộ thay ựổi như sau:
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 2,0 mg/L BA)
CT2: Nền + 0,5mg/L αNAA CT3: Nền + 1,0mg/L αNAA CT4: Nền + 1,5mg/L αNAA CT5: Nền + 2,0mg/L αNAA
Thắ nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nghiền khoai tây ựến khả năng
nhân nhanh chồi Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
Từ các thắ nghiệm trên, chúng tôi ựã thu ựược môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 2,0mg/L BA + 1,0mg/L αNAA, pH 5,5 là tốt nhất cho khả năng nhân nhanh chồi. Tuy nhiên, ựể tìm ra môi trường thắch hợp hơn cho nhân nhanh chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của dịch nghiền khoai tây với tổ hợp BA và αNAA. Với dịch nghiền khoai tây ựược bổ sung vào môi trường với hàm lượng thay ựổi là:
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 2,0mg/L BA + 1,0mg/L αNAA)
CT2: Nền + 20g/L dịch nghiền khoai tây CT3: Nền + 40g/L dịch nghiền khoai tây CT4: Nền + 60g/L dịch nghiền khoai tây CT5: Nền + 80g/L dịch nghiền khoai tây CT6: Nền + 100g/L dịch nghiền khoai tây
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu tạo cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. hoàn chỉnh hoàn chỉnh
Khi các chồi ựạt chiều cao khoảng 3 - 5cm với khoảng 3 - 4 lá thì chuyển sang giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh. Các thắ nghiệm ựược ựặt trên môi trường nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch, pH 5,5 ). Chúng tôi tiến hành các thắ nghiệm xác ựịnh ảnh hưởng của than hoạt tắnh có hàm lượng (0,5 Ờ 2,0g/L), chất ựiều tiết sinh trưởng αNAA (0,3 - 1,5mg/L)tới giai ựoạn tạo cây hoàn chỉnh.
Các công thức ựược bố trắ theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 20 mẫu/CT.
Các thắ nghiệm tiến hành:
Thắ nghiệm 9: Ảnh hưởng của than hoạt tắnh
Than hoạt tắnh ựược bổ sung vào môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch, pH 5,5, hàm lượng than hoạt tắnh thay ựổi như sau:
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch)
CT2: Nền + 0,5g/L than hoạt tắnh CT3: Nền + 1,0g/L than hoạt tắnh CT4: Nền + 1,5g/L than hoạt tắnh CT5: Nền + 2,0g/L than hoạt tắnh
Thắ nghiệm 10: Ảnh hưởng của αNAA
Từ thắ nghiệm 9 chúng tôi tìm ra hàm lượng than hoạt tắnh 1,0g/L là tốt nhất cho khả năng tạo cây hoàn chỉnh. để tìm ra môi trường thắch hợp hơn cho khả năng tạo cây hoàn chỉnh, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng αNAA bổ sung vào môi trường MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
dừa + 6,5g/L thạch + 1,0g/L than hoạt tắnh, pH 5,5 với nồng ựộ αNAA thay ựổi trong mỗi công thức thắ nghiệm là:
CT1(đ/C): Nền (MS + 20g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch + 1,0g/L than hoạt tắnh) CT2: Nền + 0,3mg/L αNAA CT3: Nền + 0,6mg/L αNAA CT4: Nền + 0,9mg/L αNAA CT5: Nền + 1,2mg/L αNAA CT6: Nền + 1,5mg/L αNAA
điều kiện nuôi cấy: Môi trường ựược vô trùng ở 1210C và 1at trong 20 phút. Cường ựộ ánh sáng: 2400 - 3000 lux, nhiệt ựộ phòng nuôi: 25 20C, số giờ chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
Các thắ nghiệm trên ựược thực hiện ở phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật của Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ.
2.3.4. Phương pháp ựưa cây Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. ra vườn
ươm
Các cây sau khi nuôi cấy trong phòng thắ nghiệm ựạt tiêu chuẩn chiều cao khoảng 5 - 7cm, có khoảng 3 - 4 lá, 3 - 5 rễ tiến hành ra cây. Trước khi ựưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, tiến hành huấn luyện ựể cây quen dần với ựiều kiện môi trường bên ngoài. Thời gian này kéo dài 7 ngày và tăng dần cường ựộ vào những ngày cuối ựể tăng nhanh khả năng thắch nghi của cây. Các cây con trong ống nghiệm lấy ra ựược rửa hết thạch, tránh dập nát. Sau ựó nhúng vào dung dịch thuốc nấm rồi trồng vào các giá thể khác nhau tùy vào mục ựắch thắ nghiệm. Chúng tôi ra cây vào mùa thu và tiến hành các thắ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể, một số loại phân bón khác nhau ựể có tỷ lệ cây sống cao và cây sinh trưởng, phát triển tốt.
Các thắ nghiệm trên ựược nuôi trồng trong ựiều kiện nhà lưới với các ựiều kiện:
- độ ẩm giá thể: 70 Ờ 80% - độ ẩm không khắ: 90 Ờ 95% - Nhiệt ựộ nuôi trồng: 20-25 0C - Ánh sáng: độ che sáng > 70%
- Các cây con khi trồng ựược tưới nước 1-2 lần/ngày tùy theo ựiều kiện thời tiết.
- Các công thức ựược bố trắ theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 5 cây/chậu.
Các thắ nghiệm tiến hành:
Thắ nghiệm 11: Ảnh hưởng của giá thể
CT1: Rêu Sphagnum moss CT2: Dớn tổ quạ
CT3: Rêu Sphagnum moss + Dớn tổ quạ (1:1)
Phun phân bón Growmore (30:10:10), phun 1tuần/lần, liều lượng 0,5g/L.
Thắ nghiệm 12: Ảnh hưởng của một số loại phân bón khác nhau
CT1: HVP (30:10:10)
CT2: Growmore (30: 10:10) CT3: B1 Thái Lan
Các phân bón ựược phun 1tuần/lần, liều lượng 0,5g/L.
Các thắ nghiệm ngoài vườn ươm: được ựặt trong nhà lưới của Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
2.4. Các chỉ tiêu theo dõi
* Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro
Tổng số mẫu nhiễm
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100 Tổng số mẫu ựưa vào Tổng số mẫu sống
- Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu ựưa vào
Tổng số mẫu chết - Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 Tổng số mẫu ựưa vào
Tổng số chồi sau 8 tuần nuôi cấy - Hệ số nhân chồi (lần ) =
Tổng số chồi ban ựầu
Tổng chiều cao chồi - Chiều cao trung bình của chồi (cm) =
Tổng số cây thắ nghiệm - Số lá trung bình/chồi (lá) = Tổng số lá/Tổng số chồi thắ nghiệm - Chất lượng chồi bật:
Chồi tốt: chồi mập, lá xanh thẫm Chồi khá: chồi bình thường, lá xanh Chồi trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
Chồi kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt, hoặc chồi bị dị dạng Tổng chiều cao cây - Chiều cao trung bình của cây (cm) =
Tổng số cây thắ nghiệm - Số lá trung bình/cây (lá) = Tổng số lá/Tổng số cây thắ nghiệm - Số rễ trung bình (rễ) = Tổng số rễ/Tổng số cây thắ nghiệm
- Số nhánh trung bình (nhánh) = Tổng số nhánh/Tổng số cây thắ nghiệm
* Các chỉ tiêu theo dõi thắ nghiệm ở giai ựoạn ựưa cây ra vườn ươm (theo
dõi sau 12 tuần):
Tổng cây sống (cây)
- Tỷ lệ cây sống (%) = x 100 Tổng cây ban ựầu (cây)
Tổng chiều cao cây - Chiều cao trung bình của cây (cm) =
Tổng số cây thắ nghiệm - Số lá trung bình (lá) = Tổng số lá/Tổng số cây thắ nghiệm
- Số rễ trung bình mới xuất hiện (rễ) = Tổng số rễ mới ra/Tổng số cây thắ nghiệm
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp thống kê sinh học ựể phân tắch các số liệu thắ nghiệm trên chương trình IRRISTAT for Windows (5.0).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng tạo vật liệu khởi ựầu cho nuôi cấy in
vitro loài Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl.
đây là giai ựoạn ựưa ựối tượng nuôi cấy từ ngoài vào ựiều kiện nuôi cấy vô trùng in vitro. Vì vậy, ựối với tất cả các loài cây trồng khác nhau, việc lựa chọn loại hóa chất, nồng ựộ và thời gian khử trùng thắch hợp có ý nghĩa ựối với thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Giai ựoạn này cần ựạt ựược các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại, phân hóa và sinh trưởng tốt.
3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng tới tỷ lệ sống của mẫu cấy trên môi trường MS của mẫu cấy trên môi trường MS
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 lên mẫu cấy Lan
A. roxburghii (Wall.) Lindl.
CTTN
Thời gian và nồng ựộ xử lý nước oxy già
(H2O2 ) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) CT1 15% H2O2+ 5 phút 3,6 e 80,8 a 15,6 e CT2 15% H2O2+ 10 phút 5,4 d 70,6 b 24,5 c CT3 15% H2O2+ 15 phút 20,9 c 35,9 c 43,2 a CT4 15% H2O2+ 20 phút 40,5 b 24,0 d 35,7b CT5 15% H2O2+ 25 phút 57,2 a 22,1 e 20,7 d LSD 0,05 1,06 1,67 0,34 CV (%) 2,3 2,0 2,1
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
Ghi chú: Nền môi trường MS + 20 g/L ựường + 100ml/L nước dừa + 6,5g/L thạch, pH 5,5 a, b, c, d, e: so sánh theo giá trị khác biệt có nghĩa nhỏ nhất ở mức xác suất 95%
Các mẫu nuôi cấy là chồi ựỉnh, chồi bên có chiều dài 20 - 30cm của loài Lan A. roxburghii (Wall.) Lindl. ựược ựưa vào khử trùng bằng H2O2, NaOCl