Nhân giống cây hoa tiên (asarum glabrum merr ) bằng phương pháp nuôi cấy mô

là một trong các loài cây thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong Y học dân tộc Việt Nam cũng như trong một số cộng đồng dân tộc thiểu số ở phía Bắc nước ta.. Các nghiên cứu nhân giống Ho

B ộ Y T Ế

TRƯ ỜNG ĐẠI H Ọ C D ư ợ c HÀ N Ộ I

TRẦN TIẾN DŨNG

NHÂN GIỐNG

CÂY HOA TIÊN ASARUM GLABRUM MERR

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CÂ Y MÔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA

Người hướng dẫn: ThS Tạ Như Thục Anh

ThS Vũ Vân Anh Noi thực hiện - Trung tâm Nghiên cứu trồng

và chế biến cây thuốc Hà Nội

- Xã Ba Vì huyện Ba Vì tỉnh Hà Tây

- Bộ môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội Thòi gian thực hiện: 5/2006 - 6/2007

je Ờ 3 ^ & ầ M C ffH

ắỊuéi Irhtắt Ihtửắ hiên, khứéi Luúết nàụ lò i đã- nhăềL đượe, ẳư ạivLfL đõ tậễt tình eựUL ắhàụ eA aà luỊềv bề

đîèi ăUt ụjửi Lài eảnv ờềi tmữv thjcmh, tthul lâi:

^CL Qlhu đîhjiJLe, cÂnh,

(ĩ)ũ (J)âữt cÂnlt

0 ’S đît^oit (Vaut Ớit

Ệiắtững ihầụ cồ^ ựtắ ehi ắlẫiv, ụiÚỊL đs tòi tậết tỉẾth trắ^iĩự ữiệe hứàếv (hành khécL luâềt noM j^

<ĩ)cL iÂi eủnạ, tưứv ihănh eảnt ổềt lởi ắờàiL bẠ lậệt ikỀ eáềt lĩẠ (Bậ mồềt đîhUa

(V ậ t đ îrU ônjg. <ợạ/ hjß^ H )ư ổe, 'Jôà, Q lệ i ữ ă < J)kồnjg ỆUA&i e ẩ ụ địÊ^ung i á j f t Q ắạ h iỀ ễ t

cứu đîmnjg Ú ỈL & iự biến, eojf ihuếe 'Jôci Qlậi đã giúp đs^f ỉẨ ỊL Ỡ điều kỉỉềt eỉu^ ỉỗi kjúà*t thành khúă Luậềt iứuậ.

'Tỗà QỉỈẬi^ nụàụ 15 ihánụ 4 nủm 2007

Sinh (VỉỀiL

^rầjn đîăin n^ăềvg.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

PHẦN 1 : TỔNG QUAN 5

1.1 Cây Hoa tiê n 5

1.1.1 Chi Asamm L 1753 5

1.1.2 Đặc điểm thực vật của Hoa tiên (Asarum glabrum Merr) 5

1.1.3 Thành phần hóa học của Hoa tiên 6

1.1.5 Công dụng 8

1.2 VQG Ba Vi và cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba V ì 8

1.2.1 Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên 8

1.2.2 Cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba V ì 9

1.3 Bảo tồn tài nguyên cây th u ố c 10

1.3.1 Giá trị của tài nguyên cây thuốc 10

1.3.2 Hiện trạng bảo tồn tài nguyên cây thuốc 11

1.3.4 Các phương pháp bảo tồn tài nguyên cây thuốc 12

1.4 Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro) 14

1.4.1 Nhân giống hữu tính 14

1.4.2 Nhân giống vô tính 15

1.4.3 Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro) 17

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 24

2.1 Nguyên vật liệu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Điều tra tình hình thu hái, chế hiến, mua bán, sử dụng Hoa tiên 24

2.2.2 Nuôi cấy In vitro 24

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỂ 3

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng, thu hái, chế biến và mua bán cây Hoa tiên trong (Ả glabrum Merr.) cộng đồng người Dao ở Ba Vì 28

3.2 Nghiên cứu nhân giống In vitro 32

3.2.1 Nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu 32

3.2.2 Ảnh hưởng của BAP và Kinetin tôi tỷ lệ hình thành chồi và hệ số nhân chồi.34 3.2.3 Ảnh hưởng của các tổ hợp BAP và a-NAA tới sự tái sinh chồi và hệ số nhân chồi 37

3,2.4 Ảnh hưởng của a-NAA tới sự ra rễ 40

3.2.5 Nghỉên cứu đưa cây ra đất 42

3.3 BÀN LUẬN 45

3.3.1 Điều tra tình hình thu hái, mua bán, sử dụng Hoa tiên trong cộng đồng người Dao ở khu vự VQG Ba V ì 45

3.3.2 Nhân giống nuôi cấy mô 46

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM K H Ả O 49

B ộ CÂU HỎI PHỎNG VẤN ĐlỂU TRA TÌNH HÌNH 53

PHỤ LỤC 2: CÔNG THỨC MÔI TRƯỜNG M S 55

PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC 57

GIÂY CHỨNG NHẬN MÃ s ố TIÊU BẢN 58

Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật hết sức đa dạng và phong phú, được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học bậc nhất trên thế giói [4] Nguồn tài nguyên này đã và đang góp phần tích cực trong việc phát triển kinh tế và chăm sóc sức khoẻ ban đầu cho nhân dân nofi mà điều kiện kinh tế còn gặp nhiều khó khăn Song, do chịu áp lực của điều kiện kinh tế còn nhiều khó khăn, nhận thức của nhân dân còn chưa đầy đủ thêm vào đó là sự yếu kém trong khâu quản lý nguồn tài nguyên cây thuốc nên tód việc khai thác ồ ạt, thiếu sự kiểm soát đã làm cho nguồn tài nguyên này bị suy giảm nhanh chóng, một số loài cây thuốc quý

có nguy cơ biến mất hoàn toàn Vậy làm sao để khai thác hçfp lý và bền vững là một thách thức không nhỏ

Hoa tiên (Asamm glabrum Merr hay A maximum Hemsl.) là một trong các

loài cây thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong Y học dân tộc Việt Nam cũng như trong một số cộng đồng dân tộc thiểu số ở phía Bắc nước ta Hoa tiên cũng đang bị xếp vào một trong các loài có nguy cơ tuyệt chủng (cấp độ E) trong danh mục sách

Đỏ Việt Nam phần thực vật [12] Loài này là một trong 7 loài cây thuốc bị ngưòi Dao ở Ba Vì khai thác và sử dụng nhiều nhất để làm thuốc bổ, tăng cường sinh lực cho nên giá trị kinh tế của loài này là khá cao đã làm cho số lượng loài này bị suy giảm một cách mạnh mẽ [20],[21] Hơn nữa khả năng tái sinh tự nhiên của Hoa tiên

là rất thấp Các nghiên cứu nhân giống Hoa tiên sử dụng các phưoĩig pháp như giâm hom, tái sinh bằng thân rễ đều không thành công do hệ số nhân thấp và gặp phải vấn

đề lớn về nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu [20] Những điều này dẫn đến nguy cơ Hoa tiên biến mất hẳn khỏi khu vực VQG Ba Vì

Chính vì vậy, chúng tôi chọn thực hiện đề tài "'Nhân giống cây Hoa tiên

(Asarum glabrum Merr.) bằng phương pháp nuôi cấy wô” vói mục tiêu đóng góp

thêm 1 phương pháp nhân giống Hoa tiên để có thể tìm ra giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững loài cây này

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỂ

Nội dung của khoá luận bao gồm 2 phần:

+ Điều tra tình hình khai thác, mua bán, sử dụng Hoa tiên của cộng đồng

người Dao khu vực VQG Ba Vì Hà Tây.

+ Nghiên cứu nhân giống Hoa tiên bằng phương pháp nuôi cấy mô.

1.1 Cây Hoa tiên

1.1.1 Chi Asarum L 1753

Trên thế giói, hiện có khoảng 90 loài thuộc chi Asarum L tập trung chủ yếu

ở khu vực Đông Nam Á, một vài loài ở khu vực Bắc Mỹ, một loài đặc hữu của châu

Âu, 39 loài ở Trung Quốc trong đó có 34 loài đặc hữu [26] Việt Nam có tất cả 7

loài thuộc chi Asarum L [11],[15],[23].

1.1.2 Đặc điểm thực vật của Hoa tiên (Asarum glabrum Merr)

Cây Hoa tiên (Ạsarum glabrum Merr.) thuộc họ Aristolochiaceae (Họ Mộc

hưofng) còn gọi là Trầu tiên, Dầu tiên, Trà tiên, Pền Phvả (Ba Vì), Phiu Hỏa Mia’(Sa Pa)

Cây cỏ, sống lâu năm, cao 20-30 cm Thân rễ mảnh, chia nhiều đốt ngắn, mỗi đốt thường ngắn hơn 1 cm Lá thưòỉng có từ 1-2 lá, hình tim dài 8-12cm, rộng 4-7

cm Cuống lá dài 10-18 cm Phiến lá nguyên, 2 mặt nhẩn, đầu lá nhọn, gốc lá hình khiên, mặt trên màu lục sáng, mặt dưói màu lục nhạt, 7 gân tỏa từ gốc lá, Hoa mọc đơn độc ở đầu ngọn, có cuống dài 2-3 cm Lá bắc dài, hẹp và nhọn Bao hoa màu xám nâu hoặc tím đậm, trên bao hoa có những vạch sọc xanh, tún xen kẽ, bao hoa hình ống, chia 3 thùy hình tim, Nhị 12 đều nhau, bao phấn dài hơn chỉ nhị Nhụy tập hçfp thành cột dày, ngắn hơn bao phấn [1],[12],[15],[26] Quả được bao bọc bỏi bao hoa tồn tại Hạt nhỏ màu tun, hoặc nâu đen bóng

Mùa ra hoa, quả từ tháng 3-6

Phân bố: mọc dọc theo các khe đá, bờ suối có độ cao từ 700m-1500m thuộc địa bàn các tỉnh Lào Cai (Sa Pa), Quảng Ninh (Yên Tử), Hà Giang (Mèo Vạc), Hà Tây (Ba Vì), w

PHẦN 1 : TỔNG QUAN

Hình 1: Cây Hoa tiên

1.1.3 Thành phần hóa học của Hoa tiên

Trong chi Asarum, hầu hết tất cả các loài đều chứa tinh dầu, hàm lượng

thay đổi từ 1-3% và là hỗn hợp của rất nhiều thành phần trong đó hầu hết đều có chứa methyl eugenol, safrole, [1],[2],[14],[22],[36],[41],[42]

Hiện chưa có nghiên cứu nào đầy đủ và về thành phần hóa học của cây Hoa tiên Một số nghiên cứu sơ bộ cho thấy trong thân và thân rễ Hoa tiên có chứa 1%- 3% là tinh dầu, tỷ lệ này thay đổi theo mùa và noi thu hái [1],[2],[14] Trong một vài nghiên cứu gần đây cho thấy, trong lá Hoa tiên cũng có chứa tinh dầu tinh dầu Thành phần chủ yếu của tinh dầu bao gồm: methyl eugenol, safrole, và một số thành phần khác Trong lá và hoa có chứa nhiều sắc tố anthocyanosid, khi ngâm vói rượu cho màu xanh đậm (lá) và màu hồng tươi hoặc hồng tím (hoa) [1],[2],[14],[22]

Một số loài khác trong chi Asarum đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về thành phần hóa học Phân tích thành phần hóa học trong lá và rễ Asarum forbeii

Maxim, bằng phương pháp sắc kí khí, Feng Zhang và cộng sự cho kết quả thành phần tinh dầu ngoài methyl eugenol và asarone, còn có chứa a-asarone, methyl isoeugenol Tinh dầu lá có chứa 20 hợp chất hữu cơ trong đó methyl isoeugenol chiếm 33,3%, a-asarone chiếm 19,3%- Trong lá có chứa 17 hợp chất trong đó a- asarone chiếm 58,8% và methyl eugenol 10,3% [41]

Theo kết quả nghiên cứu Zhang s x và cộng sự khi tiến hành phân tích bằng

phưoỉng pháp sắc kí dịch chiết methanol của A longer hizomatosum tách được 5 hợp

chất là: Asarone, 2,4,5-trimethoxybenzaldehyde, ß-sitosterol, 4(2,4,5trimethoxyphenyl)-3-en-butylone và 3-ß-hydroxylstigmast-en-7-one [42]

Theo từ điển bách khoa dược học thì trong thân và rễ của loài Tế tân A

heterotropoides Fr.Schmidit chứa 2,75% tinh dầu chủ yếu là pinen, methyl eugenol,

một số hợp chất ceton, 1 chất có nhóm chức phenol có T„c =110”c , acid hữu cơ và chất nhựa [22]

Loài Tế tân A sieboldii fMiq.) F Maekawa chứa 2,75% tinh dầu trong đó có

1,8-cineol, asaricin, methyl eugenol, croweacin, a-pinen, ß-pinen, a-thuyen, myrcen, terpinen -4-ol, a- terpineol, safrole, myristicin [1]

Theo kết quả nghiên cứu được đưa ra bỏd Rostogi và Mehrotra thì thành phẩn

hóa học của loài A europaenum L có chứa a asarone, triacylglycerid [36].

Rất nhiều loài trong chi Asarum tìm thấy có sự xuất hiện của Acid

aristolochic một chất độc với thận và có khả năng gây ung thư đã được cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) khuyến cáo không nên sử dụng [25] Acid aristolochic I (AA-I) được tìm thấy không chỉ có trong các cây thuộc chi

Asarum mà còn tìm thấy trong nhiều cây thuộc các chi như Arìstolochia spp , Bragantia spp., Stephanỉa spp., Clematis spp., Akebia spp., Cocculus spp., Diploclisia spp., Menispernum spp., Sinomenium spp [25],[37].

Các cây trong chi Asarum có hàm lượng AA-I khác nhau và thay đổi khá

nhiều giữa các loài khác nhau Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng 9 loài thuộc chi này

đã được nghiên cứu có hàm lượng AA-I từ 3,3ng/mg (A sieboldii) đến 3376,9 ng/mg(A crispulatum ) [25],[29].

1.1.4 Tác dụng dược lý

a Tác dung gây tê cuc bổ

Dịch chiết bằng cồn của Hoa tiên trên tiêu bản thần kinh cơ đùi ếch có tác dụng phong bế dẫn truyền các xung thần kinh Khi bôi dạng cồn thuốc nên lưỡi sau

nửa phút thì đầu lưỡi có cảm giác cay lạnh, sau 1 phút thì đầu lưỡi tê, rồi cảm giác đau hoàn toàn biến mất, sau một giờ hồi phục dần Dạng nước sắc không có tác dụng Tinh dầu Hoa tiên có tác dụng gây tê bề mặt, nhỏ vào mắt làm mất phản xạ giác mạc [36].

b Tác dung trên tim mach

Dịch chiết bằng cồn tỷ lệ (1:2) trên động vật thực nghiệm bằng đường tiêm tĩnh mạch liều 0,4 ml/kg có tác dụng tăng cường co bóp cơ tim, tăng hiệu xuất làm việc tâm thất Trên chó thí nghiêm, dịch chiết cồn của Hoa tiên tiêm tĩnh mạch liều o.lmg/kg có tác dụng hạ huyết áp, giãn nhẹ mạch ngoại vi [36]

c Tác dung an thán, chống co giât

Tinh dầu Hoa tiên trên chuột nhắt trắng thí nghiệm, tiêm xoang bụng vói liều0,06ml/kg có tác dụng an thần, giảm hoạt động tự nhiên của chuột, dùng liều lớn hofn có tác dụng gây ngủ, gây mê Tinh dầu Hoa tiên dùng cùng cloral hydrat có tác dụng tăng cường ức chế thần kinh trung ương, đối kháng với co giật do kích thích điện và Strychnin gây nên [36]

1.1.5 Công dụng

Cây Hoa tiên mới chỉ được sử dụng trong phạm vi dân gian Nhân dân ở khu vực Ba Vì - Hà Tây dùng hoa ngâm rượu uống nhằm bồi bổ cơ thể và tăng cường thể lực, kích thích ăn ngon, ngủ tốt [3],[14],[20]

Theo một số tài liệu đã công bố cho thấy Hoa tiên được sử dụng khá nhiều vód mục đích dùng làm thuốc bổ [1],[2],[18],[23]

1.2 VQG Ba Vì và cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba Vi

1.2.1 Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên

VQG Ba Vì là một trong 22 VQG ở Việt Nam được thành lập năm 1991, với diện tích 6768 ha và vùng đệm có điện tích 14144 ha VQG Ba Vì phân bố từ độ cao lOOm -1296 m so vói mặt nước biển

Đia hình: VQG Ba Vì nằm trên khu vực núi trung bình, núi thấp tiếp giáp vùng bán S0fn địa Với 3 đỉnh cao nhất là đỉnh Vua (1296m), Ngọc Hoa (1131m), Tản Viên (1227m) Độ dốc trung bình 25°, khu vực từ 400m trở lên độ dốc 35°

Đất đai, thổ nhưỡng: Khu vực này có rất nhiều loại đất có nguồn gốc từ đá vôi, đá trầm tích Các loại đất chính bao gồm : Feralit vàng, Feralit vàng nâu phát triển trên thạch sét, phù sa vàng đỏ phát triển trên đá phiến thạch, phù sa cổ.

Khí hâu : Do phân bố ở độ cao từ lOOm đến 1296m nên chế độ nhiệt ở đây có

sự thay đổi lớn Nhiệt độ trung bình là 23,l°c Trên cao lOOOm là 16,l”c Biên độ nhiệt ngày đêm là 8°c, có thể thay đổi trong các mùa khác nhau Lượng mưa hàng năm tương đối lớn khoảng 2000mm nhưng phân bố không đều giữa sườn Đông và sườn Tây và giữa các tháng trong năm [19]

Hê thưc vât: Theo điều tra thì ở VQG Ba Vì đã phát hiện được khoảng 812 loài thực vật có hoa (theo dự đoán có thể đạt 1900 loài nếu được thống kê đầy đủ) thuộc 427 chi và 98 họ [19] Trong đó có một loài đặc hữu của khu vực và 10 loài được xếp vào danh mục các cây có giá trị cần bảo vệ Thảm thực vật gồm 2 loại chính :

+ Rừng mưa nhiệt đới có độ cao từ 800m trở xuống vói các cây thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), Dâu tằm (Moraceae), Đậu (Fabaceae), w

+ Rừng á nhiệt đód có độ cao từ 700m trở lên vói các họ thực vật đại diện là Chè (Theaceae), Long não ( Lauraceae), Dẻ (Fagaceae), w

1.2.2 Cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba Vì

Khu vực VQG Ba Vì và vùng đệm có tổng số 46.547 nhân khẩu thuộc 3 dân tộc Kinh (21.369 người), Mưòĩig (17.502 người), Dao (4636 ngưòi) phân bố tại 7 xã

là Ba Vì, Ba Trại, Khánh Thượng, Minh Quang, Tản Lĩnh, Vân Hoà, Yên Bài [19]

Người Dao ở xã Ba Vì với số lưẹmg gần 1700 ngưòd tập trung ở 3 thôn Yên

Sofn, Họfp Sơn, Họfp Nhất, là cộng đồng có tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc phong phú nhất, cũng là cộng đồng khai thác, sử dụng cây cỏ làm thuốc lớn nhất và có ảnh hưởng lớn nhất đến sự khai thác, trồng trọt và bảo tồn của cây thuốc tại khu vực VQG Ba Vì [19],[20]

Tri thức sử dụng cây thuốc của người Dao ở Ba Vì là rất phong phú vói khoảng 503 loài cây thuốc đã được kiểm kê thuộc 321 chi và 118 họ thuộc 5 ngành

thực vật khác nhau là: Lycopodiophyta, Equiestophyla, Polypodiophyta, Pinophyta,

và Magnoliophyta [20]

1.3 Bảo tồn tài nguyên cây thuốc

1.3.1 Giá trị của tài nguyên cây thuốc

Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng cho mục đích bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ con ngưòi Có tói hơn 80% dân số thế giới (4,3 tỷ người) sử dụng cây cỏ hay các sản phẩm có nguồn gốc từ cây cỏ cho mục đích chăm sóc sức khoẻ ban đầu, đặc biệt là người dân ở các khu vực vùng sâu, vùng xa và vùng nông thôn Giá trị kinh tế của nguồn tài nguyên này cũng hết sức to lớn, ước tính nếu khai thác hết tiềm năng thì giá trị kinh tế có thể đạt tód 900 tỷ USD mỗi năm [4],[38]

Việt Nam là đất nước có nguồn tài nguyên về thực vật nói chung và tài nguyên cây thuốc nói riêng hết sức phong phú và đa dạng Hệ thực vật Việt Nam có khoảng 1000 loài tảo, khoảng 12000 loài thực vật bậc cao thuộc 2046 chi, 395 họ và theo ước đoán Việt Nam có thể có tới 15000 loài [32] Trong số 12000 loài cây đã được thống kê thì có tới 3850 loài được sử dụng vói mục đích làm thuốc (Viện dược liệu, 2003) Trong bộ sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của GS Đỗ Tất Lợi xuất bản năm 1999 giói thiệu 800 cây, con, vị thuốc Bộ sách “Cây thuốc Việt Nam” của lưoíng y Lê Trần Đức đã đề cập tói 830 loài cây thuốc được sử dụng vód mục đích chữa bệnh Tác giả Võ Văn Chi trong cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” cũng đã đề cập tód 3200 loài cây thuốc Bộ sách “ Cây thuốc và động vật làm thuốc

ở Việt Nam” cũng đã giới thiệu 800 loài cây thuốc được sử dụng ở Việt Nam Theo

dự đoán nếu thống được kê đầy đủ thì ở Việt Nam có thể có tói 6000 loài cây thuốc [1],[2],[3],[23]

Việt Nam là ngôi nhà chung của 54 dân tộc anh em và mỗi dân tộc đều có tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc riêng của mình Đây là nguồn tri thức có giá trị to lớn

mà cần được quan tâm nhiều hofn nữa Hiện nay, đã có nhiều sản phẩm có nguồn gốc thảo dược đã được nghiên cứu phát triển thành công và đưa ra thị trường dựa trên tri thức sử dụng cây cỏ của cộng đồng, như Ampelop của Traphaco dựa trên tri

thức sử dụng cây chè Dây (Ampélopsis cantonensis Hook, et Am.) của ngưòi Tày-

Cao Bằng Nếu được quan tâm và đầu tư đúng mức chúng ta hoàn toàn có thể phát

triển được rất nhiều bài thuốc cổ truyền thành các chế phẩm thuốc có giá trị kinh tế cao,

1.3.2 Hiện trạng bảo tồn tài nguyên cây thuốc

Nước ta có nguồn tài nguyên cây thuốc đa dang và phong phú nhưng vì nhiều

lý do khách quan cũng như chủ quan đã làm cho nguồn tài nguyên này suy giảm nhanh chóng Lý do khách quan như chiến tranh tàn phá, gia tăng dân số, nền kinh

tế còn gặp nhiều khó khăn, thu nhập bình quân đầu ngưòi thấp, w Lý do chủ quan như trình độ dân trí còn thấp, sự khai thác rừng bừa bãi thiếu kiểm soát, trình

độ quản lý còn nhiều yếu kém và bất cậ p

Chính những lý do trên đã làm cho tài nguyên rừng bị khai thác một cách cạn kiệt, làm cho diện tích rừng cũng như chất lượng rừng suy giảm nhanh chóng Diện tích rừng tự nhiên của Việt Nam đã giảm từ 14.325 nghìn ha năm 1943 xuống 8.252 nghìn ha năm 1995 (Bảng 1)

Bảng 1.1 : Diện tích rừng và tỷ lệ che phủ rừng của Việt Nam

Năm Diện tích rừng

tự nhiên

Diện tích rừng trồng

Tổng diện tích rừng

Tỷ lệ % diện tích che phủ

Nguồn: FIPI (1995), State directive Commission o f Forest Conventory (2001) Đơn vị: nghìn ha

Cùng vód sự mất đi của tài nguyên rừng kéo theo đó là sự suy giảm nhanh chóng về số lượng cũng như chất lưọíig của nguồn dược liệu Rất nhiều loài cây thuốc trước đây rất sẩn có nhưng hiện nay đã hầu như biến mất như Bảy lá một hoa

{P polyphylla), Hoàng liên chân gà (C quinquesesta W.T.Wang.), Hoàng đằng (F.

tinctorìa Lour.), Ba kích (M officinalis How.),w Nhiều loài cây thuốc đã biến mất

hoàn toàn và còn có rất nhiều loài đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng

Nguồn tài nguyên cây thuốc bị đe doạ không chỉ ở khía cạnh nguồn dược liệu

mà còn ở khía cạnh tri thức sử dụng Tri thức sử dụng trong dân gian chưa được tư liệu hóa một cách đầy đủ, không được ghi chép trong các tài liệu về Y học dân tộc

và trong các cộng đồng để có thể lưu giữ lâu dài Thêm vào đó cùng với sự phát triển của cơ chế thị trưcmg, tư tưỏng xem nhẹ tri thức Y học cổ truyền đã xuất hiện trong một bộ phận nhân dân nhất là giód trẻ cũng góp phần làm giảm ảnh hưởng của

Y học cổ truyền trong việc chăm sóc sức khoẻ nhân dân

1.3.4, Các phương pháp bảo tồn tài nguyên cây thuốc.

a Bảo tổn nguvẽn vi iỉn situ).

Bảo tồn nguyên vị là hình thức bảo vệ cây thuốc ở noi sống tự nhiên của chúng, giữ nguyên trạng các mối quan hệ sinh thái giữa các loài, giữa các loài với môi trường sống và các nền văn hoá

Bảo tồn nguyên vị có thể là xây dựng các khu bảo tồn chính thức của nhà nước như thành lập các vườn quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên, w, hay là việc thành lập các khu bảo tồn không chính thức của cộng đồng như khu vực hạn chế khai thác, hay có khi chỉ là việc thu hạt về hàng năm để trồng [4],[27]

Hiện nay phương pháp này được áp dụng khá phổ biến không chỉ ở Việt Nam

mà còn trên thế giói Thế mạnh của bảo tồn nguyên vị là duy trì được sự tiến hoá của các loài, nguồn gen cũng như sự tiến hoá trong tri thức sử dụng cây thuốc

Việt Nam đã chính thức thành lập các VQG và khu BTTN từ năm 1991 và có ngày càng nhiều các VQG và khu BTTN được thành lập đã cho thấy rằng tầm quan trọng của phưoíig pháp bảo tồn nguyên vị Hiện nay công tác kiểm kê đánh giá nguồn tài nguyên sinh vật nói chung và nguồn tài nguyên cây thuốc nói riêng tại các VQG và khu BTTN đã đang được tiến hành một cách có hệ thống hơn nhằm kiểm

kê đầy đủ số lượng cũng trữ lượng các loài (bảng 2) Từ đó có thể đưa ra được định hướng cho việc bảo tồn các loài cây thuốc quý hiếm và phát triển những cây dược liệu có giá trị

Bảng 1.2 : Một SỐVQG tại Việt Nam và số loài cây thuốc đã được kiểm kê

trong mỗi vườn

TT Tên VQG Diện tích ( ha) Số loài cây thuốc

b Bảo tổn chuyển v i( Ex sitù).

Bảo tồn chuyển vị là di chuyển cây ra khỏi nơi trồng tói nơi có điều kiện quản lý tập trung

Bảo tồn chuyển vị có thể được thực hiện ở các vưòíi thực vật, nhà kính, vườn sưu tầm, trong các kho bảo quản lạnh Bảo tồn chuyển vị bao hàm cả việc trồng trọt không chính thức các loài cây hoang dại trong các vườn ươm, vườn gia đình,w

Nhược điểm trong bảo tồn chuyển vị là các mẫu bảo tồn chuyển vị chỉ là một

số dòng gen hẹp trong số rất nhiều dòng gen của mỗi loài cây thuốc Các cây thuốc được bảo tồn chuyển vị có nguy cơ phụ thuộc vào sự chăm sóc của con ngưòi và xói mòn cả về tri thức sử dụng Do đó, bảo tồn chuyển vị không thể thay thế cho bảo tồn nguyên vị mà cả hai phải đồng thời được áp dụng và phải bổ sung cho nhau

Cần ưu tiên bảo tồn chuyển vị đối vói cây thuốc mà noi sống đã bị phá huỷ, hay đối với các loài sắp có nguy cơ tuyệt chủng sau đó phải trồng lại thiên nhiên.

Một số hình thức bảo tồn chuyển vị

- Đưa các cây thuốc vào các vườn thực vật

- Bảo quản trong các ngân hàng gen trong đó có bảo quản lạnh hạt

c Bảo tổn trẽn đổng ruổng (on farm)

Bảo tồn trên trang trại đó là trồng trọt và quản lý liên tục sự đa dạng của các quần thể cây thuốc, được ngưòd nông dân thực hiện tổng thể các hệ sinh thái nông nghiệp nơi cây trồng đã tiến hoá

Bảo tồn trên đồng ruộng quan tâm đến toàn bộ hệ sinh thái nông nghiệp, kể

cả các loài có ích trước mắt cũng như các loài liên quan như loài hoang dại, cỏ dại

Để có được hiệu quả trong việc bảo tồn tài nguyên cây thuốc của mỗi quốc gia thì cần tiến hành song song các phưorng pháp trên và phải phối hợp thực hiện giữa các phương pháp [4],[8],[20],[27],[34],[35]

1.4 Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi

cấy mô (nhân giống In vitro).

Nhân giống cây trồng là quá trình tạo ra và phát triển cá thể mới Các cá thể này dùng để thiết lập nên mùa vụ mới

Có 2 phương pháp nhân giống chính đó là: nhân giống hữu tính (sexual) dùng hạt và phuofng pháp nhân giống vô tính hay còn gọi là phưofng pháp nhân giống sinh dưỡng (vegetative) dựa và khả năng tái sinh của tất cả các bộ phận sinh dưỡng của cây như thân, lá, rễ, mô, tế bào

1.4.1 Nhân giống hữu tính

Nhân giống hữu tính là thu lấy hạt của cây, tạo điều kiện thích hợp về nhiệt

độ, độ ẩm, ánh sáng cho hạt nảy mầm tạo thành cây con

• ư u điểm :

+ Có hệ số nhân cao

+ Dễ bảo quản và vận chuyển

+ Có khả năng thu được các biến dị mới, tính trạng tốt hơn so vód dòng cha

mẹ xuất hiện

+ Chi phí thấp

• Nhược điểm:

+ Nhân giống gặp khó khăn rất lớn đối vói các loài cây lâu cho ra hoa, quả

Ví dụ Sơn thù, Đỗ trọng {Ẹ ulmoides Oliv.) là cây thuốc quý nhập nội về trổng ở Sa

Pa, phải mất 10 năm cây mói có khả năng cho hạt Bộ phận làm thuốc của Sofn thù là

quả khi còn trẻ cây chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả Đỗ trọng là cây đcfn tính

cùng gốc nên khi nhân giống Đỗ trọng bằng hạt không những lâu mà còn không chủ

động được hạt do hạt chỉ thu được trên cây cái mà trước khi trồng ta không thể nhận

biết đâu là cây đực đâu là cây cái nên rất khó khăn khi nhân giống bằng hạt

+ Khó khăn cũng gặp phải trong nhân giống hữu tính đối vói một số loài cây

thuốc như Ô đầu (A carmichaeli Debx.), Bạch thược (P lactiflora Pall.) do hạt của

chúng nảy mầm rất chậm do có sự ngủ nghỉ kéo dài Một số loài khác như Đan sâm

(5 miltirrohiza Bunge.) thì có hạt chín không đều gây ra nhiều khó khăn cho thu

hoạch, Khi trồng với diện tích lớn thì thòi gian ươm phải kéo dài tói 2 năm mà cho

hiệu quả kinh tế thấp [5],[6],

+ Nhìn chung thì hạt cây thuốc có thòi gian bảo quản tương đối ngắn, tỷ lệ

nảy mầm của hạt cũ thucfng thấp hơn so vói hạt tươi mói Tỷ lệ này con thấp hơn đi

rất nhiều đối vói hạt cũ để cách năm [5],[6]

+ Khi nhân giống bằng hạt có thể tạo ra các cây con có tính trạng khác vói bố

mẹ và không hoàn toàn đồng nhất cả về hình thái lẫn thành phần hoá học Đặc biệt

với cây thuốc thì hàm lượng hoạt chất có thể không ổn định

1.4,2 Nhân giống vô tính

- Là khái niệm sử dụng khả năng tái sinh của các cơ quan sinh dưỡng khác nhau như cành, thân, rễ, mô, tế bào, w

Nhân giống vô tính bao gồm nhân giống truyền thống ( giâm, chiết, ghép) và

nhân giống In vitro (nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy tế bào,w ).

Nhân giống truvền thống bao gồm:

Chiết: là phưong pháp tạo cá thể mới, thường là trên thân cây, trước khi tách

khỏi cây mẹ (thường chỉ áp dụng với cây gỗ), ư u điểm là cành chiết được cây mẹ nuồi có thể hình thành bộ rễ trước khi tự nuôi sống mình

Ghép: là sự tạo liên kết giữa hai bộ phận cành ghép và gốc ghép của hai cá

thể khác nhau Cây ghép thường có m thế của cả cành ghép và gốc ghép Hạn chế

là chỉ áp dụng được với cây sinh trưởng thứ cấp (cây hạt trần và cây hai lá mầm) thêm vào đó cành ghép và gốc ghép phải có sự gần gũi nhau về mặt phân loại học thì mới có cơ hội thành công

Giâm: là sự tạo cây con từ một nhát cắt của thân, lá, rễ, củ sau khi tách khỏi

cơ thể mẹ được nuôi trong điều kiện ẩm từ đó hình thành cá thể mới Phương pháp này cho hệ số nhân giống cao hơn hai phương pháp trên nhưng cần đảm bảo điều kiện ngoại cảnh khá khắt khe cho quá trình tái sinh và tạo rễ cho cá thể mói

• ư u điểm của nhân giống truyền thống, đó là:

+ Rút ngắn thòi gian sinh trưởng và phát triển tạo điều kiện tăng vụ tăng sản

phẩm, tăng hiệu quả kinh tế Để thu được năng suất như nhau các loài Dioscorea

nếu trồng bằng hạt sẽ kéo dài hơn trồng bằng củ ít nhất 6 tháng

+ Áp dụng được vód hầu hết các loài cây kể cả cây lâu cho quả

• Nhược điểm

+ Sự lây bệnh qua nguyên liệu giống diễn ra phức tạp, phổ biến và khó kiểm soát Sự lây nhiễm và tích tụ các ký sinh trùng đặc hiệu nhất là virus, vi nấm gây giảm năng suất và chất lượng cây trồng

+ Hệ số nhân của phưoíig pháp nhân giống vô tính thường thấp Ví dụ hệ số

nhân của Dioscorea floribunda khi nhân bằng củ đạt 8-10 cây/năm, của Cam thảo là 5-7 của Bạc hà Mentha arvensis là 6-7.

+ Việc sử dụng chính bộ phận làm thuốc đé nhân giống gây lãng phí và tốnkém

1.4.3 Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro)

Là phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng để tái sinh thành cây non

Nhân giống In vitro là một trong các phương pháp bổ sung cho các kỹ thuật

nhân giống truyền thống và có nhiều ưu điểm nổi bật, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp truyền thống

a Cơ sở lý luân của phương pháp nuối cây mồ

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào In vitro dựa trên học

thuyết về tính toàn năng của tế bào Theo Haberlandt G 1902 thì “Tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, trong điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh”

Thực tế đã chứng minh tính đúng đắn của học thuyết về tính toàn năng của tế

bào Hiện nay đã có hàng nghìn loài cây đã được nhân giống In vitro thành công,

hàng trăm loài cây đã trở thành sản phẩm thương mại có giá trị như lan Hồ điệp

Cymbidium, các giống hoa Tulip,w Trong suốt khoảng thòi gian từ đầu thế kỷ 20

đến trước năm 1962 thì phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không đạt được nhiều thành tựu đáng kể Nhưng đến năm 1962 khi môi trường nuôi cấy MS (Murashige & Knoog) ra đòd đã mở ra kỷ nguyên mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật vói rất nhiều thành tựu to lớn, [38]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô In vitro tế bào thực vật thực

chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá Tất cả các tế bào trong các

cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tiếp tế bào từ phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các chức năng khác nhau gọi là sự phân hoá tế bào Còn quá trình ngược lại gọi là sự phản phân hoá, các tế bào chuyên hoá chuyển thành các mô chức năng nhưng chúng khồng hề mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dang |jiối

/ Ẩ v r / í ’i^ÌTHƯ-VlỆN

Quá trình có thể tóm tắt bằng sơ đồ sau:

Bản chất của quá trình này là sự hoạt hoá gen theo chương trình Trong quá trình phát triển của cá thể ở từng thòi điểm, trong từng môi trường thì một số gen nhất định được hoạt hóa, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Sự hoạt hoá hay

ức chế của các gen còn chịu sự chi phối lớn của các tế bào, các mô xung quanh Khi được tách ra riêng rẽ thì các gen trong tế bào đựơc hoạt hoá theo một chưofng trình định sẵn

b ư u nhươc điểm của nhân giống In vitro

- Có ứng dụng lớn trong việc tạo dòng thuần của các cây tạp giao Điều này

có ý nghĩa to lớn trong việc chọn giống cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng

- Có thể tạo được các nguồn gen mới như đa bội thể hay đofn bội thể

- Bảo quản và liru trữ được tập đoàn gen

- Phục tráng giống bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và cải tạo giống bằng kỹ thuật gen

- Có khả năng sản xuất giống quanh năm

- Có thể áp dụng tốt đối vói nhiều loại cây từ cây không kết hạt, cây lâu cho quả, cây gặp khó khăn trong việc thu hái quả.

- Đặc biệt nhân giống In vitro chỉ cần một lượng nhỏ nguyên liệu nhân giống,

vì vậy có khả năng áp dụng rất tốt đối với các cây quý hiếm hay đang trong tình trạng đe doạ tuyệt chủng

- ưu điểm lớn nhất của phương pháp nhân giống In vitro là hệ số nhân rất cao

từ 3^ tói lO^Vnăm cao gấp nhiều lần so vói các phưoíig pháp khác

• Nhược điểm

- Nhược điểm chính của phương pháp nhân giống In vitro là đòi hỏi phải có

trang thiết bị đắt tiền, kỹ thuật tiến hành khá phức tạp, yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt, chỉ có những người được trang bị kỹ thuật tốt và phải có kinh nghiệm mới có

thể tiến hành nhân giống In vitro Giá thành nhân giống cây có thể cao hofn so với

các phương pháp nhân giống khác

- Mặc dù thu được hệ số nhân rất lớn nhưng cây con thu được có kích thước nhỏ và cần có chế độ chăm sóc đặc biệt trước khi đưa ra trồng

- Một tỷ lệ nhỏ có thể thu được tính trạng không mong muốn do có khả năng sinh đột biến

- Nếu không tiến hành một cách cẩn thận cây có thể nhiễm bệnh đồng loạt

c Nhân giống In vitro

Nhân giống In vitro có thể chia thành các bước như sau:

1 Lựa chọn đối tượng, tùy theo mục đích nhân giống mà ta lựa chọn loài nhân giống, bộ phận nhân giống Thưòtìg chọn những bộ phận có khả năng sinh trưởng tốt, có độ tuổi sinh lý trẻ và mẫu tương đối sạch vi khuẩn Có thể lựa chọn các đoạn thân rễ, thân, cuống lá, phiến lá, hạt phấn, noãn,w

2 Khử trùng mẫu cấy

Nguyên liệu đã chọn tuy là mẫu sạch bệnh nhưng nhìn chung không thể tránh khỏi sự nhiễm các vi sinh vật như vi khuẩn, vi nấm tuỳ thuộc vào sự tiếp xúc của chúng đối với môi trường và cả vào thòi gian, Một số bộ phận như hạt phấn, mô bên

trong quả thì thường ít nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác đặc biệt là củ, thân

rễ Để đảm bảo cho mẫu nuồi cấy được vô khuẩn người ta phải tiến hành khử trùng

mẫu cấy bằng các hoá chất diệt vi khuẩn và vi nấm

- Tác nhân khử trùng mẫu (hoá chất khử trùng mẫu) phải được lựa chọn dựa trên các yếu tố như mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của mẫu cấy đối vói hoá

chất khử trùng

3 Xác định điều kiện nuôi cấy

Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng)

để điều khiển quá trình phát triển của mô nuôi cây theo định hướng nghiên cứu

4 Xác định môi trường nuôi cấy

Cho đến nay có rất nhiều các loại môi trường khác nhau như Murashige và

Skoog (1962), môi trưòtig Linsmainer và Skoog (1963), môi trưòíng Gamborg

(1968), môi trường Knop (1974),w đây là các môi trường cơ bản và được cải

tiến cho phù hợp với các đối tương nghiên cứu khác nhau Trong đó môi trường MS

(Murashige và Skoog 1962) được đánh giá là phù hợp với đa số các loài thực vật

Thành phần chủ yếu của môi trường bao gồm các muối khoáng đa lượng và

vi lượng (muối clorid, nitrat, Sulfat, phosphat, iodide của Ca, Mg, K, Na, Fe, Mn,

Zn, Mo, Co, Cu và B) các vitamin, nguồn cung cấp c, các yếu tố sinh trưởng hữu cơ

như pepton, acid amin và các hormon điều hoà sinh trưởng

Các nguyên tố đa lượng như N, K, p, Ca, Mg, Fe đóng vai trò hết sức quan

trọng để các loài thực vật nói chung có thể phát triển được và thực vật nuôi cấy mô

không thể lấy các chất này từ môi trường nên việc cung cấp các khoáng đa lượng

cho cây là hết sức cần thiết Ngoài ra còn có một lượng nhỏ các khoáng vi lượng

như B, Mn, I, Zn, Mo, Co, Cu Tuy có hàm lượng nhỏ những chúng đóng vai trò

quan trọng tham gia các quá trình chuyển hoá của các loài thực vật nếu thiếu chúng

thì cây phát triển chậm thậm chí có thể không phát triển được Tất cả các khoáng

nói trên cũng tham gia vào tạo áp lực thẩm thấu của môi trường

Đường có vai trò cung cấp nguồn carbon và cung cấp năng lượng, không thể

thiếu trong bất cứ môi trường nuôi cấy thực vật nào Mô tế bào nuôi cấy In vitro chủ

yếu sống dị dưỡng mặc dù chúng cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ ánh sáng nhân tạo và lục lạp có chứa diệp lục và có khả năng quang hợp Mặt khác đường có vai trò tạo áp lực thẩm thấu chính trong môi trường Nồng độ của đưcttig saccharose thường được dùng với nồng độ từ 1-8% Ngoài ra một số đường như manitol, maltose, glucose cũng có thể được sử dụng trong môi trường nuôi cấy

Các vitamin có vai trò xúc tác cho các quá trình trao đổi chất diễn ra bên trong tế bào Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tự tổng hợp các vitamin cần thiết song thường là không đủ lượng cần thiết cho sự sinh trưcíng tối ưu của cây vì vậy ta thường bổ sung thêm các vitamin như BI (thiamin), vitamin pp (acid nicotinic), vitamin B5, vitamin B6 (piridoxin) Trong đó vitamin B1 là quan trọng nhất đối với sự phát triển của tế bào thực vật Các vitamin thường dùng ở nồng độ từ0,1-1 mg/l

Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (horaion thực vật) là yếu tố quan trọng bậc nhất trong môi trường nuôi cấy Trong khi các yếu tố như khoáng đa lượng, vi lượng, đưòíig, các vitamin là yếu tố cần cho sự nhân nên của tế bào và ít thay đổi ở các loài thực vật khác nhau Thì các chất điều hoà sinh trưởng lại là yếu tố cần cho

sự biệt hoá của tế bào và thay đổi ở các loài thực vật khác nhau và trong từng giai đoạn trong quá trình nuôi cấy [48],[49] Dựa vào yếu tố này mà người ta có thể điều

khiển được quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy In vitro Có 2 nhóm chất điều hoà sinh trưởng hay được dùng trong nuôi cấy In vitro là Auxin và Cytokinin.

Nhóm Auxin gồm một số chất có chứa nhân indol trong phân tử Trong môi trường nuôi cấy thì Auxin thúc đẩy sự hoạt hoá phân chia và giãn nở tế bào, kích thích quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia quá trình phân hoá của rễ và chồi [38] Các Auxin đều có tác dụng sinh lý giống nhau nhưng được dùng ở các nồng độ khác nhau do hoạt tính của chúng khác nhau và thay đổi từ 10'^ đến 10'^ tùy từng chất, mục đích nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu Khi thêm Auxin vào môi trường

sẽ kết hợp vói Auxin nội sinh để điều khiển cường độ và chiều hướng của quá trình sinh trưởng Khi hàm lượng Auxin thấp sẽ kích sự phân hoá tạo rễ và còn khi hàm

lượng cao sẽ thúc đẩy tạo mô sẹo Các Auxin hay dùng là IBA (indol butyric acid),

NAA (a-naphtytacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indol

acetic acid)

Cytokinin là nhóm phytohormon là dẫn chất của Adenin, có liên quan mật

thiết tói sự phân bào và quá trình trẻ hoá cơ quan, giảm ưu thế ngọn, kích thích sự

phân hoá chồi từ mô sẹo ở nồng độ cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ

Các Cytokinin hay được sử dụng là Kinetin, BAP (benzylaminopurin) vói nồng độ từ

10-4 tói 10-^ [9],[21],[38],[39],[44]

Sự biệt hoá các cơ quan thực vật nuôi cấy In vitro là kết quả của sự tác động

qua lại giữa hai nhóm horaion là Auxin và Cytokinin Cân bằng tỷ lệ

Auxin/Cytokinin nghiêng về phía Auxin thì kích thích hình thành rễ và ngược lại khi

nghiêng về phía Cytokinin thì sẽ thúc đẩy sự tạo chồi, còn khi cân bằng sẽ thúc đẩy

tạo mô sẹo Đây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hình thái

trong nuôi cấy mô Các mô khác nhau, ở các giai đoạn khác nhau, các loài khác

nhau thì sự nhạy cảm của chúng với các chất điều hoà sinh trưỏng cũng khác nhau

do đó việc tìm ra tổ hợp nồng độ và tỷ lê Auxin/Cytokinin thích hợp là công việc

quan trọng nhất trong nuôi cấy mô tế bào

5 Đưa cây nuôi cấy In vitro ra môi trường tự nhiên

Đây là giai đoạn huấn luyện cho cây In vitro thích nghi trở lại với điều kiện

bên ngoài phòng nuồi cấy Ban đầu thì cây có bộ rễ được hình thành trong các bình

nuôi cấy bộ rễ này khi đưa ra ngoài điều kiện tự nhiên thường sẽ không có khả năng

hấp thu chất dinh dưỡng và hút đủ nước để giúp cây sống sót

d Ouv trình nhân giống In vitro

Quy nhân giống In vitro gồm 5 giai đoạn.

- Lấy mẫu và xử lý mẫu: đây là giai đoạn quyết định quy trình nhân giống In

vitro Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, thời điểm lấy

mẫu, vị trí lấy mẫu, cách xử lý mẫu, điều kiện khử trùng mẫu Mỗi cây đều có điểm

mà ở đó nhiệt độ và độ ẩm phù hợp với sự bảo quản và xử lý mẫu

- Tái sinh mẫu cấy: mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan mẫu nuôi cấy Mẫu thường là đỉnh sinh trưcmg, chồi nách hay lát cắt đốt thân tuỳ đối tượng và mục đích nuôi cấy Khả năng thành công của mẫu nuôi cấy phụ thuộc vào trạng thái sinh lý và độ tuổi của mẫu nghiên cứu Tế bào phôi là lựa chọn hàng đầu sau đó đến đỉnh sinh trưởng như đỉnh ngọn, đầu rẽ sau đó đến tế bào nghỉ (chồi nách).

- Nhân nhanh chồi: Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống quyết định tói hệ số nhân của chồi và của cả quá trinh vi nhân giống Môi trường ở giai đoạn này được bổ sung các chất điều hào sinh trưởng, tăng thời gian chiếu sáng lên đến 16h/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux

- Tái sinh rễ : khi chồi đã đạt đến kích thước nhất định thì sẽ được chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ có bổ sung thêm các chất( IBA, NAA, 2,4-D) ở nồng độ thích hợp

- Đưa cây ra đất Chuyển cây từ trạng thái dị dưỡng hoàn toàn hoặc một phần sang tự dưỡng hoàn toàn, giúp cho cây con có đủ thời gian để thích nghi vód môi trường bên ngoài [9],[21],[38],[44]

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên vật liệu

Hoa tiên dùng trong nghiên cứu được thu từ VQG Ba Vì và một phần thu tại VQG Tam Đảo

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Điều tra tình hình thu hái, chế biến, mua bán, sử dụng Hoa tiên

- Phương pháp phỏng vấn bán cấu trúc dựa trên mẫu tươi.

- Các thông tin phỏng vấn bao gồm: công dụng, cách sử dụng, thu hái, chế biến, mua bán

- Đối tượng phỏng vấn là các thầy lang ngưòi Dao tại xã Ba Vì có kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc và hay vào khu vực VQG Ba Vì thu hái cây thuốc

- SỐ lượng thầy lang được phỏng vấn: 25

Công thức tính độ tin cậy:

Độ tin cậy = SỐ thầy lang sử dụng xl00%/25

2.2.2 Nuôi cấy ỉn vitro

+ Nhân giống In vitro

a Mối trường nuối cấv

- Môi trường cơ bản là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962), có cải

tiến bổ sung thêm các chất ĐHST ở các nồng độ khác nhau.

- pH của môi trường được điều chỉnh tód 5,8 rồi hấp tiệt trùng trong 2h ở

nhiệt độ 121^C, latm

b Điéu kiên nuối cấy

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ổn định ở 25°c ± 2°c

- Số mẫu nhắc lại: 30mẫu/công thức

• Điều kiên khử trùns mẫu cấy:

Sử dụng dung dịch HgCl2 ở nồng độ khác nhau và thòi gian khác nhau để khử

trùng mẫu cấy Thí nghiệm được bố trí như trong bảng 2.1

Bảng 2.1 : Cách bố trí thí nghiêm nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu

• Nshiên cứu tái sinh trưc tiếv:

+ Ảnh hưởng của BAP tói sư tái sinh chổi và hê số nhân chổi.

+ Ảnh hưỏmg cùa Kínetin (K) tới sư tái sinh chổi và hê số nhân chổi Công thức:

+ Ảnh hưòng của ạ- NAA tới sư ra rễ của chổi

Chỉ tiêu theo dõi; Tỷ lệ ra rễ, số rễ/mẫu, độ dài của rễ

• Nshiên cứu đưa cây ra đất

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ sống, chiều cao, số lá, kích thước lá sau 4 tuần

PC* : phân chuồng hoại mục