Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu cấy cho thấy tỷ lệ mẫu sạch thu được chỉ đạt cao nhất là 29,44%, thấp hơn khá nhiều so vói với các loài cây khác khi nhân giống In vitro như Hoa chuông đạt tỷ lệ mẫu sạch 55% [10], Ba kắch đạt 85% [13]. Kết quả thấp này có thể do loài này khá nhạy cảm với HgClj nên khi xử lý vói HgCl2 vói thòi gian dài và ở nồng độ cao thì làm tăng tỷ lệ mẫu chết đến 50,07% (HT 1.3) và làm tỷ lệ mẫu sạch thu được giảm đi đáng kể. Hoa tiên sống ở noi ẩm ướt nên tỷ lệ nhiễm vi nấm, vi khuẩn cao, nếu sử dụng HgCl2 ở nồng độ thấp thì tỷ lệ mẫu nhiễm tăng cao có thể đến 87,55% ( HT 1.6).
Môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất đối với Hoa tiên là MS + lmg/1 BAP + 0,2mg/l a-NAA (HT 4.2), tổ hợp này cho tỷ lệ hình thành chồi là 88,15% và hệ số nhân là 6,02 chồi/mẫu. Tổ hợp này cho kết quả cao hơn so vói công thức HT 2.4 (Công thức cho kết quả cao nhất vói môi trường chỉ có BAP) tói 1,22 lần về tỷ lệ hình thành chồi và gấp 1,61 lần về hê số nhân. Kết quả này cũng cao hctti so với công thức HT 3.5 (Công thức cho kết quả cao nhất với môi trường chỉ chứa K) tới 1,44 lần về tỷ lệ hình thành chồi và 1,75 về hệ số nhân.
Hệ số nhân của Hoa tiên cao nhất là 6,02 chồi/mẫu vói công thức HT 4.2, chỉ ở mức trung bình so với các loài cây khác được nuôi cấy mô như Ba kắch đạt hệ số nhân là 9,22 chồi/mẫu, Hoa chuông là 5,7 chồi/mẫu, Dứa Cayen là 7-10 chồi/mẫu
[9],[10],[13]. Hệ số nhân này cho thấy ưu điểm nổi bật của nhân giống In vitro so vói các phương pháp nhân giống khác khi nhân giống Hoa tiên.
Môi trường ra rễ thắch hợp với Hoa tiên là môi trường MS có bổ sung thêm 0,2mg/l a-NAA (HT 5.3), môi trường này cho tỷ lệ hình thành rễ là 82,7% cao hoĩi so với công thức HT 5.4 là 1,22 lần; với công thức HT 5.2 là 1,44 lần; so vói công thức HT 5.1 là 5,07 lần. Điều này cho thấy a-NAA có ảnh hưởng rõ rệt tói sự ra rễ của Hoa tiên. Công thức HT 5.4 tuy có tỷ lệ hình thành rễ thấp hom so vói công thức HT 5.3 nhưng lại có số rễ/mẫu cao hoắn và chất lượng rễ cũng như chiễu dài của rễ tương đương.
Giá thể thắch hợp để sử dụng cho việc đưa cây từ môi trường ống nghiệm ra môi trường tự nhiên là cát sạch. Giá thể này cho tỷ lệ cây sống là 63,59% cao hơn
1,58 lần so vói hỗn họfp giá thể đất và cát (HT 6.2); cao hơn 1,40 lần so vói hỗn hợp giá thể đất và mùn (HT 6.3); cao 1,70 lần so vói hỗn hợp giá thể đất, mùn, phân chuồng hoại mục (HT6.4). Sau 1 tháng phát triển ta thấy rằng số lá/mẫu ở tât cả các mẫu đều không thay đổi so với lúc bắt đầu đem trồng. Nguyên nhân có thể do Hoa tiên khi trưcmg thành cũng chỉ có 2-4 lá và thòi gian theo dõi khá ngắn (1 tháng).
Qua nghiên cứu bước đầu, chúng tôi đã cho ra được một quy trình nhân giống nuôi cấy mô cây Hoa tiên. Quy trình này tuy chưa thật hoàn thiện song cũng cho thấy khả năng áp dụng phưoắng pháp nuôi cây mô để bảo tồn cây Hoa tiên là có thể thành công. Từ đây, mở rộng có thể nghiên cứu phuofng pháp nuôi cấy mô cho việc nhân giống bảo tồn các loài cây thuốc quý đang có nguy cơ bị tuyệt chủng
KẾT LUẬN
Hoa tiên là một trong những cây thuốc quan trọng nhất của ngưòi Dao ở Ba Vì, được người dân ở đây sử dụng để điều trị tód 21 chứng, bệnh.
Chế độ khử trùng mẫu thắch hợp nhất đối với hoa tiên là sử dụng HgClj 0,1% trong thời gian 10 đạt tỷ lệ mẫu sạch là 29,44%.
Môi trường nhân nhanh chồi thắch hợp nhất là môi trương MS + 0,lmg/l BAP + 0,2mg/l a-NAA, đạt hệ số nhân là 88,15 và tỷ lệ tái sinh chồi là 6,02
Môi trường ra rễ thắch hợp nhất là môi trường MS + 0,2mg/l a-NAA, đạt tỷ lệ 82,7% ra rễ và số rễ đạt 4,12.
Giá thể thắch hợp cho việc đưa cây ra đất là cát sạch và có tỷ lệ sống sót đạt 63,59%.
TầI LIỆU THAM KHẢO
TầI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Duy Bắch, Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Tập,..., (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc, tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
2. Đỗ Tất Lợi(2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
3. Lê Đình Bắch, Trần Văn ơn, Nguyễn Thị Sinh (2003), Nghiên cứu bảo tồn cây thuốc ỵ học dân tộc Dao khu vực Vườn quốc gia Ba Vì - Hà Tây.
4. Lê Đình Bắch, Trần Văn ơn, Hoàng Quỳnh Hoa (2005), Thực Vật học, Hà Nội.
5. Lê Trần Đức (1995), Kỹ thuật trồng cây thuốc,
6. Kỹ thuật nuôi trồng và chế biến dược liệu, Nhà xuất bản Nông nghiệp 1979. 7. Mai Tất Tố, Đào Thị Vui, (2005), Dược lý học, tập 1, Hà Nội, trang 89-99 8. Nguyễn Bá Hoạt,(2003), ỀBảo tồn nguồn gen và giống cây thuốc Việt NamỂ,
Tài liệu hội nghị dược liệu toàn quốc lần thứ nhất Ề Phát triển dược liệu bền vững trong thế kỷ 21 Hà Nội tháng 3/2003.
9. Nguyễn Đức Thành, 2000, nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu và ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, 2000.
10. Nguyên Quang Thạch, Vũ Ngọc Lan, Nguyên Xuân Trường, (2004), ỀNghiên cứu nhân nhanh cây Hoa Chuông Sinnigia speciosa'\ Tạp chắ Khoa học Kỹ Thuật Nông Nghiệp, tập 2 năm 2004.
11. Nguyễn Tiến Bân, Trần Thị Phương Anh, Lê Kim Biên, (2003), Danh mục các loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, trang 102-123.
Vl.Sách đỏ Việt Nam (1996), tập 2, phần Thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật năm 1996.
13. Nguyên Thị Thuỷ, Nguyễn Trọng Hy, (2002), Ề Nghiên cứu nhân nhanh cây Ba kắch Morida officinalis'’ Tạp chắ Dược liệu , số 3, năm 2002.
15. Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ
16. Tạ Như Thục Anh, (2003), Nghiên cứu công nghệ nhân nhanh In vitro cây Trinh nữ hoàng cung ịCrinum latifolia L.).
17. Trần Công Khánh, Ề Sử dụng tài nguyên cây thuốc- sự chia sẻ lợi ắch cân bằng và hợp lýỂ, Tạp chắ dược học số 7, trang 7Ồ 11 năm 2004.
18. Trần Công Khánh (2004) ỀCây thuốc quý trong khu bảo tồn thiên nhiên Yên TửỂ, Tạp chắ Cây thuốc quý 2004, số 21, trang 8.
19. Trần Minh Tuấn (2001), Giới thiệu vườn quốc gia Ba Vì.
20. Trần Văn ơ n ,(2003), Góp phần nghiên cứu bảo tồn cầy thuốc dân tộc Dao ở vườn quốc gia Ba Vì, Luận án tiến sỹ dược học.
21. Trần Văn ơn, Đỗ Duy Bắch, Trần Khắc Bảo, Nguyễn Thị Sinh, (2003), Ề Nghiên cứu bảo tồn cây thuốc dân tộc Dao ở khu vực vườn quốc gia Ba Vì- Hà TâyỂ, Tài liệu hội nghị khoa học lần thứ nhất, phát triển dược liệu bền vững trong thế kỷ 21 trang 302-324.
22. Từ điển bách khoa dược học Hà Nội 1999, trang 76-77.
23. Võ Văn Chi, (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1 , Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
TầI LIỆU TIẾNG ANH
24. Dan Palevitch,1991, ỀAgronomy Applied to Medicinal Plant ConservationỂ,
Conference Proceedings Forty-fourth World Health Assembly, 1991, WHO. 25. FDA Concerned About Botanical Products, Including Dietary Supplements,
Containing Aristolochic A cid, May 31 2000
26. Flora o f china: 246-257.2003.
27. Guidelines on the Conservation o f Medicináis plants, WHO.
28?)l. Forman et D. Bridson, The Herbal Handbook, Published by the Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, Surrey TW9 3AB, UK.
29. Jing-Jing Jong, Maw-Rong Lee, Shun-Sheng Hsiao, Analysis o f aristolochic acid in nine suorces of )Sxin, a traditinonal chinense medicine, by liquid chromatography! atmospheric pressure chemical ionization! tandem mass spectometry
30. Jong TT, Lee MR, Hsiao SS, Hsai JL, Wu TS, Chiang ST, Cai SQ J Pharm Biomed Anal. 2003 Nov 24;33(4):831-7.^^J
3L Le Trong Cue, National report on sustainable.Forestry in Viet Nam, 1995. ^
32.Le Trong Cue, (2003), Uplands o f Vietnam, in lanscapes o f diversity. ^
33.McNeely, J.A., Economics and Biological Diversity: Developing and Using Economic Incentives to Conserve Biological Resources, lUCN, 1988, 236
p p .
3A. Medicinal Plant Conservation vol. 2 , pp. 4-6,1996. WHO
35. Medicinal Plant Conservation vol. 3 , pp. 5-7,1997. WHO
36.Rostogi, Mehrotra, Compend Indian Medicinal plants vol 4, PID, New Dehli, 1999, p 79.
9 37. Stary.F.,(1983) Poisonuos plants, Hamlyn ISBN # 0-600-35666-3 >
V ...
38.Stawds, (1995), Tisssue culture techniques an introduction, New Delhi Pub. 39. Schumacher, H.M., "Biotechnology in the Production and Conservation of
Medicinal Plants", Conference Proceedings Forty-fourth World Health Assembly, 1991, WHO.
40. Vietnam’s Country report to the FAO international technical conference on plant genetic resource (1996), Leipzig, p 12.
41. Feng Zhang, Qing Xu, Shaoping Fu(2001) Studies on the chemical constituents o f Asarum spp, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116012, People's Republic of China.
42. Zhang SX, Cai SQ, Zhao YY, ỀStudies on the chemical constituents of
Asarum longerhizomatosum C. F. Liang et C. S. YangỂ, Zhongguo Zhong Yao ZaZhi magazine. 2001 Nov;26(ll):762-3.
43.Vanusia C. Franca, Karlete Vánia M. vierra, Edeltrusdes. (1996) Estudo fitoquimico das parties aéreas de Aristolochia birostis Dutch.
Aristolochiaceae.
44.Murashige T., Skoog F. (1962), ỀA rivised medium for rapid growth and bioassays with tobabo tissue cultureỂ, Physiol, 25, p 135-166.
PHỤ LỤC 1
BỘ CÂU HỎI PHỎNG VẤN Đ lỂU TRA TỉNH HỉNH
M UA BÁN, SỬ DỤNG, TH U HÁ I, C H Ế B IẾN H O A TIÊN A. Thông tin về ngưòi cung cấp tin
Tên...
Tuổi...
Giới tắn h ...
Địa chỉ... B. Thông tin điều tra cây thuốc
- Anh (chị) đã gặp loài cây này bao giờ chưa? Có Không - Tên cây này là cây gì?
- Đã bao giờ lấy cây này làm thuốc chưa?
- Hằng năm lấy có nhiều không? Bao nhiêu?
- Cây này hay gặp ở khu vực nào trong vườn quốc gia Ba Vì?
- Ngoài Ba Vì anh ( chị) có biết ở đâu có cây này không?
- Đã bao giờ anh ( chị ) đến đó lấy cây này không? Bao nhiều lần?
- Mỗi lẫn lấy bao nhiêu? Lấy vào thời gian nào?
-Bệnh 1( mô tả triệu chứng bệnh)
Dùng bộ phận nào?
Chữa như thế nào
-Bệnh 2 (mô tả triệu chứng bệnh)
Dùng bộ phận nào?
PH Ụ LỤ C 2: CÔNG THỨC M Ô I TRƯ Ờ NG MS
Dung dịch MSI: lượng chất cần lấy để pha 2 lắt dung dịch MSI mẹ
N H4N O3 33g
K H2P O4 3,4g
K N O3 38g
CaCl2.2ỈỈ20 8,8g
MgS04.7H2Ơ 9,2g
Khi dùng lấy lOOml pha ra 1 lắt môi trường
Dung dịch MS2: lượng chất lấy pha 1 lắt dung dịch MS2 mẹ
FeS04.7H2Ơ 5,57g
NaEDTA 7,45g
Khi pha lấy 5ml pha ra 1 lắt môi trường
Dung dịch MS3: lượng hoá chất lấy để pha 1 lắt dung dich MS3 mẹ
H3B O3 620mg MnS04.4H20 2230mg ZnS04.4ĩỈ20 869mg KI 83mg Na2Mo04.2ĩỈ20 25mg C0CI2..6H2O 2,5mg CUSO4 2,5mg
Khi pha lấy 10 ml pha ra 1 lắt môi trường
Các vitamin
Glycine 3mg/l
Pyridoxin 0,5mg/l Vitamin BI 0,lmg/l Các thành phần khác : Inositol lOOmg/1 Agar-Agar 6,2g/l Saccarose 20-30g/l PH 5,8
TRƯ Ờ N G ĐẠ I H Ọ C Dược Hầ N Ộ I Bộ môn T hực v ật
PHIỂU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
Số: tắ/.đ /T V D
Mầu cây do: Trần Tiến Dũng Địa chỉ: A2K57
Lấy ngày: 9/2/2007
Mang đến: Bộ môn Thực vật, ĐH Dược Hà Nội Gồm có: Thân
Yêu cầu: Giám định tên khoa học
Kết quả giám định: Căn cứ vào các tài liệu hiện cỏ tại Trường đại học Dược và các đặc điểm của các bộ phận đã xác định mẫu trên có:
- Tên khoa học: Asarum glabrum Merr. - Họ: Aristolochiaceae
- Tên thường gọi: Hoa tiên
Các tiêu bản trên được lưu tại: Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật Trường đại học Dược Hà nội (HNIP, Mã tiêu bản: HNIP/15306/07)
Hà Nội, ngày 20 thảng 2 năm 2007
B ộ MÔN THựC VẬT Người giám định
T ^ v
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC Hầ NỘI BỘ MÔN THỰC VẬT
PHồNG TIÊU BẢN CÂY THUỐC (HNIP)
GIẤY CHứSễG NHẬN Mấ số TIÊU BẢN
1. Tên mẫu cây:
Tên khoa học: Asarum glabrum Meư., Aristolochiaceae Tên thường dùng: Hoa tiên
Tên địa phương: pền phvả 2. Nguồn gốc: VQG Ba Vì
3. Ngày thu mẫu: 09/02/2007
4. Người thu mẫu: Trần Tiến Dũng Cơ quan: s v A2 K57
5. Người nộp mẫu: Trần Tiến Dũng Cơ quan: sv A2 K57
6. Số hiệu phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật: HNIP/15306/07 7. Người giám định: ThS. Vũ Vân Anh
8. Ngày nộp mẫu: 21 tháng 05 năm 2007
Người nộp mẫu Người nhận mẫu