Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus Tristeza Virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành bản luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời gian tôi học tập chương trình thạc sĩ. Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của Th.s. Đặng Thị Hương, Tập thể cán bộ Phòng Công nghê tế bào thưc vât? Viên Công nghê sinh hoc. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong thời gian qua. Hà Nội, tháng 10 năm 2010 La Việt Hồng LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC TỪ VIÉT TẮT MỤC 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. 3 Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g) Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB đặc, long Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV Hlnh 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển vi điện tử âm bản nucleocapsid Hình 3.1. Ket quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1% Hình 3.2. Ket quả điện di sản phấm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M: marker lkb Hình 3.3. Ket quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M: Marker 1 kb Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37°c trên môi trường LB đặc Hình 3.6. Ket quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18 trên gel agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb Hình 3.7. Ket quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmide pBT tái tố hợp bằng enzyme giới hạn đôi với mấu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb DANH MỤC 4 Hình 3.8. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank Hình 3.10. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen F của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank DANH MỤC 5 Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn p giữa các mẫu CT, HG, HN và VL Hình 3.13. Cây phát sỉnh chủng loạỉ xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự đoạn gen p của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên GenBank |jg microgram |Li 1 microlitre jam micrometer bp base pair BYV Beet yellows virus cDNA Complementary DNA cs Cộng sự CP/NCP Protein VỎ (Coat protein/Nucleocapsid Protein) CCM Cây có múi CTV Citrus tristezci virus CT Cần Thơ (mẫu thu tại tỉnh cần Thơ) DDBJ Ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh học có địa chỉ truy cập: www.ddbi.nig.ac.ip DEPC Diethyl pyro Carbonate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) EMBL Phòng Sinh học phân tử Châu Au thuộc Viện Thông tin Sinh học Châu Âu có địa chỉ truy cập: www.ebi.ac.uk HSP70 Heat shock protein 70- protein sốc nhiệt HG Hà Giang (mẫu thu tại tỉnh Hà Giang) HN Hà Nội (Mau thu tại Hà Nội) IPTG Isopropylthio-ị3-D-galactoside Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Marker (thang đo kích thước DNA) NCBI Trung tâm Thôngtin côngnghệ sinh học quốc giacủa Hoa Kỳ có địa chỉ truy cập: www.NCBI.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer ORF Open reading frames - khung đọc mở PNAS Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PCS Polycloning site - vùng nhân dòng đa điểm cắt PMF Polymethoxylated flavones RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phảnứng PCR phiên mă ngược) TAE Tris - Acetate - EDTA Taq Thermus aquatỉcus v/p vòng/phút VL Vĩnh Long (mẫu thu tại tỉnh Vĩnh Long) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-ị3-D-galactosidase MỞ ĐÀU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh cùng họ Rutaceae [45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại cây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm ngon, được nhiều người ưa dùng. Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến thức ăn, làm mứt, chế biến nước giải khát, làm hương liệu Trên thế giới, sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg quả/năm. Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình quân gần 7%, CCM được trồng nhiều ở các tỉnh: cần Thơ, Ben Tre, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang [48]. Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng cao chất lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza làm cho sản lượng cũng như chất lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn lụi có tác nhân là vỉrus Citrus Tristeza gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn quả có múi [10], [40], [25]. Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây ảnh hưởng tới năng suất và phẩm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh Greening. Tuy vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa dạng về hệ gen của virus này. Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus trỉsteza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam” 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới để có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi. - Góp thêm tư liệu khoa học cho việc xác định trình tự nucleotide toàn bộ hệ genome của virus Citrus Tristeia ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di truyền của các chủng virus được chính xác. Bên cạnh đó còn có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. 3. Nhiệm vụ nghiên cửu - Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long. - Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long. Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi dòng virus, xây dựng cây phân loại về sự đa dạng di truyền của 4 dòng virus nghiên cứu. CHƯƠNG 1. TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi CCM thuộc họ Rutaceae và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45]. CCM phát sinh từ vùng Đông Nam Châu Á, trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ biên giới Đông Bắc của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của Đảo Hải Nam. Những loài này bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi, cam ngọt, cam chua [6]. Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu nhiệt đới và Á nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 35° Nam đến Bắc, những vùng thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 20° Nam hay Bắc của xích đạo. Ở Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam. Riêng Đồng bằng sông Cửu Long, CCM hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh [...]... chua cũng giảm khả năng sinh sản [15] Ngoài ra, CTV có thể gây ra thân rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là nguyên nhân quan trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả Đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu Ầu [15], [21], [22] Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài năm cây tàn lụi và chết... nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với triệu chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân trong và dòng virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44] (A) Bệnh úa vàng trên cây cam ngọt ghép với gốc cam chua bị nhiễm bệnh do CTV, so với cây bình thường ở giữa (B) Tristeza gây ra sự suy giảm nhanh chóng của cây cam ngọt trên gốc ghép cam chua (cây ở giữa)... Nha) trên cây phát sinh chủng loại CTV được chia thành 5 chủng chính [46]: • Virus seedling yellows • Virus grapefruit pitting • Virus grapefruit stunt bush • Virus lime die-back • Virus Ellendale mandarin decline 1.2.4.4 Chuẩn đoán và phòng chổng bệnh Bệnh Tristeza gây ra từ nhiều dòng virus khác nhau, việc hiểu rõ dòng virus gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, các dòng CTV khác nhau thì gây. .. tác nhân gây bệnh là virus thuộc họ cỉosterovirus Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống, dòng virus nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]: • Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân trong hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy ( Citrus aurantifolia) • Vàng lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange, Citrus aurantỉum), chanh giấy ( Citrus ỉỉmơn),... các cây với các trạng thái bệnh khác nhau suy giảm chậm (C và D) thân của cây cam ngọt nhiễm CTV khi ghép với gốc cam chua, và có dạng tổ ong ở mặt trong của vỏ cây của các gốc cam chua dưới đoạn chồi của cây bị nhiễm Tristeza (E, F và G) Tristeza là cho quả nhỏ (so với một loại trái cây bình thường trên bàn tay) các cành và thân của một cây bưởi bị rỗ 1.2.4.2 Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh. .. phần gỗ bị lõm vào rất nhiều • Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh tốt, tuy nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng phần nửa dưới lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng cho nhà vườn Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo ở Nam Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil trong thập... Dùng dòng gây bệnh nhẹ đế chủng lên cây và cây sẽ chống chịu tốt khi có dòng khác độc hơn tấn công (cơ chế bảo vệ chéo - Mild strain crossprotection) - Sử dụng giống kháng hoặc gốc ghép kháng: nhiều giống CCM tỏ ra chống chịu bệnh này nghĩa là virus vẫn tồn tại trên cây nhưng không lộ triệu chứng Một số giống khác kháng lại bệnh cũng có nghĩa là virus không nhân mật số trên cây bị nhiễm Những cây này... ( Citrus ỉỉmơn), và bưởi chùm ( Citrus paradỉsi) • Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật ( Citrus sinensis ) trên gốc ghép cam chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh • Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi bóc vỏ khỏi thân Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn và dễ gãy • Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân chính... khoảng 25 kDa (chi m 95%) và 27 kDa (chi m 5%) [41] Protein CP cấu tạo nên phần thân của virus còn protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của virus Hình thành hạt virion có cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion, cấu trúc virion bất thườn này lân đâu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus) [19] Những phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức năng khác nhau... “Huanglongbing”, Nam Phi gọi là Greening Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM [8] Thái lan có khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông [12], nhiều nước khác cũng cho thấy thiệt hại của Greening Ớ Việt Nam, bệnh này cũng gây thiệt hại nặng từ Bắc chí Nam Có hai dòng chủ yếu gây bệnh này: dòng Châu Phi . những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus trỉsteza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định. sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới để có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi. -. có rất nhiều nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu Ầu [15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ vài năm cây tàn lụi và