Nghiên cứu tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao giàu saponin từ ngưu tất (achyranthes bidentata blume)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU SAPONIN TỪ NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ LAN ANH Mã sinh viên: 1301009 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO GIÀU SAPONIN TỪ NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Hân PGS.TS Lê Việt Dũng Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Khoa CNCX – Viện Dược Liệu HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Hân thầy PGS.TS Lê Việt Dũng – người hướng dẫn cho em lý luận lời khuyên quý báu q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Em muốn gửi lời biết ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Tuấn Hiệp người dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo cho em kiến thức chuyên sâu, tạo điều kiện học tập nghiên cứu thuận lợi giúp em hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất, Viện Dược Liệu, đặc biệt anh Đỗ Quang Thái giúp đỡ góp ý cho em suốt q trình thí nghiệm Chân thành cám ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu cho em hội thực tập viện Em xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô môn Chiết xuất dược liệu – Công nghiệp Dược giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình thực đề tài Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người thân gia đình, bạn bè ln giúp đỡ, động viên, quan tâm tạo điều kiện cho em suốt trình học tập nghiên cứu để đạt kết ngày hôm Mặc dù em cố gắng để khóa luận hồn thiện khơng tránh khỏi có sai sót q trình thực Vì vậy, kính mong thầy anh chị bảo, góp ý để khóa luận em hoàn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Lê Thị Lan Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………………… DANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………………… DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ………………………………………………… ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loài Achyranthes bidentata Blume 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố sinh thái 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.3.1 Thu hái 1.1.3.2 Chế biến, bào chế cổ truyền 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.4.1 Saponin 1.1.4.2 Phytoecdyson 1.1.4.3 Polysaccharid 1.1.5 Tác dụng sinh học 1.1.5.1 Theo y học cổ truyền 1.1.5.2 Theo y học đại 1.2 Nhóm chất saponin 1.2.1 Cấu trúc hóa học phân loại 1.2.2 Tính chất hóa lý saponin 11 1.3 Các phương pháp chiết xuất saponin ứng dụng Ngưu tất 11 1.4 Phương pháp đáp ứng bề mặt 14 1.4.1 Giới thiệu phương pháp đáp ứng bề mặt 14 1.4.2 Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt 15 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Thiết bị, hóa chất nghiên cứu 17 2.1.2.1 Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm 17 2.1.2.2 Hóa chất 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp định tính, định lượng 19 2.3.1.1 Phương pháp thủy phân saponin triterpenoid 19 2.3.1.2 Phương pháp định tính 19 2.3.1.3 Phương pháp định lượng 19 2.3.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp dung môi chiết xuất phù hợp 20 2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình chiết xuất saponin tổng từ rễ Ngưu tất 22 2.3.3.1 Khảo sát nồng độ ethanol 23 2.3.3.2 Khảo sát thời gian chiết 24 2.3.3.3 Khảo sát tỷ lệ dung môi dược liệu 24 2.3.4 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin 24 2.3.5 Nâng cấp lên quy mô 1kg dược liệu/mẻ 26 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Sơ khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến quy trình chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất (Radix Achyranthes bidentata Blume) 27 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol 27 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian chiết xuất 28 3.1.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi dược liệu (tỷ lệ DM/DL) 29 3.2 Tối ưu trình chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất theo phương pháp bề mặt đáp ứng RSM 30 3.2.1 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin 30 3.2.2 Chọn phương án chiết xuất tối ưu 37 3.3 Nâng cấp quy mô 1kg dược liệu rễ Ngưu tất/mẻ 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Nội dung đầy đủ HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) RRLC Sắc ký lỏng phân giải nhanh (Rapid-resolution liquid chromatography) Q-TOF MS/MS Phổ khối tứ cực thời gian bay song song (Quadrupole – time of flight tandem mass spectrometry) AbP Achyranthes bidentata Polysaccharid SAbP SulfatAchyranthes bidentata Polysaccharid AbS Achyranthes bidentata Saponin RSM Phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology) CCD Thiết kế cấu trúc có tâm (Central composite design) EtOH Ethanol DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Cấu trúc số hợp chất saponin triterpenoid rễ Ngưu tất 2.1 Tên hóa chất nguồn gốc 20 3.1 Các mức thí nghiệm sử dụng mơ hình RSM-CCD 33 3.2 Kết hàm mục tiêu quy hoạch thực nghiệm 34 3.3 Kết phân tích ANOVA tối ưu q trình tổng hợp yếu tố 35 3.4 Kết phân tích phù hợp mơ hình với thực nghiệm 36 3.5 Kết chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất theo thực nghiệm dự đoán 3.6 Kết chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất mẻ 1kg 39 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Ngưu tất – Achyranthes bidentata 1.2 Cấu trúc số phytoecdyson rễ Ngưu tất 1.3 Cấu trúc số khung nhóm Saponin triterpenoid pentacyclin 10 1.4 Cấu trúc số khung nhóm Saponin triterpenoid tetracyclin 10 1.5 Cấu trúc số khung nhóm Saponin steroid 11 1.6 Các kĩ thuật chiết xuất saponin sử dụng 15 1.7 Sơ đồ phương pháp RSM để thiết kế tối ưu 17 1.8 Hình ảnh thiết kế CCD với yếu tố 18 2.1 Hình ảnh dược liệu Ngưu tất 19 2.2 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 20 2.3 Sơ đồ Ishikawa cho quy trình chiết ngâm 24 2.4 Mơ hình q trình tối ưu hóa 27 3.1 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết hàm lượng saponin cao 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi dược liệu đến hiệu suất chiết hàm lượng saponin cao 3.3 Ảnh hưởng thời gian chiết xuất đến hiệu suất chiết hàm lượng saponin cao 3.4 Bề mặt đáp ứng cặp yếu tố ảnh hưởng hiệu suất chiết saponin 29 30 32 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước giàu tiềm thuốc Trong năm gần xu hướng giới dùng thuốc từ dược liệu ngày tăng lên, việc nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để ngành công nghiệp dược nước ta phát triển theo hướng đại hóa thuốc y học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu tận dụng nguồn tài nguyên dược liệu Cây Ngưu tất, tên khoa học Achyranthes bidentata Blume, họ Rau dền, trồng nhiều miền bắc Việt Nam Từ lâu rễ Ngưu tất sử dụng thuốc cổ truyền vị thuốc bổ, để điều trị chứng ứ máu, lợi tiểu, điều kinh nguyệt, đau xương khớp, cải thiện chức gan thận [45] Các nghiên cứu dược lý học đại cho thấy rễ Ngưu tất có khả tăng cường miễn dịch, kích thích tử cung, kháng u, chống viêm kháng khuẩn, chống loãng xương, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, hỗ trợ điều trị ung thư Thành phần bao gồm polysaccharid, saponin, phytoecdyson Nghiên cứu hóa thực vật, đặc biệt dược lý học chứng minh nhóm saponin oleanan thành phần tạo tác dụng sinh học rễ Ngưu tất [33], [43] Bởi tầm quan trọng saponin nên cần thiết phải xây dựng quy trình chiết xuất để đạt hiệu suất tối đa, đáp ứng với nhu cầu ngày tăng bệnh nhân Trên giới Việt Nam có nghiên cứu chiết tách, tinh chế, định lượng saponin rễ Ngưu tất Tuy nhiên với mục tiêu tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin có vài nghiên cứu đa phần tập trung theo hướng nghiên cứu tối ưu luân phiên yếu tố ảnh hưởng [2] Phương pháp không phản ánh đầy đủ chất trình xảy hệ có tương tác nhân tố Do nhóm tiến hành đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất cao giàu saponin từ Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume)” với mục tiêu là: Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến quy trình chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất Tối ưu hóa quy trình chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất Nâng cấp quy trình chiết xuất cỡ mẻ 1kg Bảng 3.3: Kết phân tích ANOVA tối ưu q trình tổng hợp yếu tố Trung bình Tổng bình Bậc tự phương Mơ hình 389,73 43,30 117,09