QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I Giới thiệu tổng quan Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho Phịng thí nghiệm Ni cấy mơ tế bào thực vật Đối tượng áp dụng: Áp dụng lĩnh vực Nuôi cấy mô tế bào thực vật, lan Hồ điệp Đặc điểm, đặc tính 3.1 Giới thiệu lan Hồ điệp Lan Hồ điệp phát vào năm 1750, ông Rumphius đặt tên Angcraecum Album Năm 1753, Linne đổi tên thành Epidendrum Đến năm 1825, nhà Thực vật Hà Lan định danh lại thành Phalaenopsis Hồ Điệp có 70 lồi ngày lai tạo nhiều giống Hồ điệp lai (Doritaenopsis) Lồi hoa có xuất xứ miền Bắc Australia, Ấn Độ nước Đông Nam Á Philippines, Indonesia, bán đảo Đơng Dương Cây mọc xứ nhiệt đới đồi núi cao 2.000 mét nên vừa thích hợp khí hậu nóng ẩm lại vừa thích hợp khí hậu mát, nhiệt độ trung bình từ 20 0C đến 300C, điều kiện khí hậu tối ưu cho việc ni trồng lồi hoa từ 220C - 270C Hồ Điệp loài đơn thân với thân ngắn, to, dày, mọc cách, mọc sát vào Hồ điệp trổ hoa dạng phát hoa, hoa nở từ gốc đến ngọn, hai cánh hoa cạnh tròn, cánh hoa sau khác cánh hoa gọi môi (labelle) Môi thường có hình thù màu sắc đặc biệt Phấn hoa dính thành phấn khối, chín nắp bao phấn tróc phấn khối bày ra, thụ phấn xảy thường phải nhờ vào côn trùng, trồng người ta phải gây thụ phấn nhân tạo Cũng mà hoa lan lâu tàn khơng thụ phấn (Phạm Hồng Hộ, 1975) Thời kì nở hoa thay đổi theo lồi thường nở vài tháng Lan Hồ điệp có màu sắc đa dạng trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến loại Hồ điệp có sọc nằm ngang thẳng đứng, có đốm to hay nhỏ Rễ bất định khí sinh mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ Rễ nhiều phân nhánh, rễ mập, phân nhánh tùy thuộc vào sinh trưởng cây, rễ bám chặt giá thể Cây hút nước khơng khí khống chất từ mà sống bám đó, màu xanh rễ cho thấy chúng có hoạt động quang hợp (Võ Thị Bạch Mai, 1996) Sự tạo thành trục phát hoa sớm phân biệt với phát triển rễ Sự xuất đầu trục phát hoa tạo thành khe thẳng xuyên qua bao vỏ lá, trục phát hoa bên, đơn giản hay phân nhánh, mang hoa hai bên, hoa đính vào trục nhờ cuống hoa Trong ấy, xuất rễ ghi nhận mở vòng tròn Trong giai đoạn trổ hoa, phát triển quan dinh dưỡng có phần bị chậm lại, tưới nước dinh dưỡng đầy đủ tiếp tục tăng trưởng tốt Phát hoa có chiều dài thay đổi khác nhau, tùy thuộc vào giống chế độ chăm sóc Các mầm ngủ phát hoa bao bọc thu nhỏ, mầm phát triển thành chồi dinh dưỡng sinh sản Cây Hồ điệp nhiệt độ thấp tăng trưởng chậm lại để cảm ứng hoa Đối với giống Hồ điệp lai, giai đoạn trổ hoa khó xác định cách xác (Võ Thị Bạch Mai, 1996) 3.2 Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật 3.2.1 Giới thiệu nhân giống in vitro Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô thuật ngữ mô tả phương thức nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường xác định điều kiện vơ trùng Mơi trường có chất dinh dưỡng thích hợp muối khống, vitamin, hormone tăng trưởng đường Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi quan từ mô lá, thân, hoa rễ Trước người ta dùng phương pháp nuôi cấy tế bào mô thực vật để nghiên cứu đặc tính tế bào phân chia, di truyền tác dụng hóa chất tế bào mơ q trình ni cấy Ngày phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật hướng ứng dụng thực tiễn, liên hệ mật thiết với giống trồng Các nhà thực vật học áp dụng phương pháp với mục đích sau  Tạo quần thể lớn đồng thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm sốt  Tạo nhiều từ mô quan (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn, chồi phát hoa…) mà ngồi thiên nhiên khơng thực  Làm nguồn virus cho cách cấy mô phân sinh Cải tiến giống trồng công nghệ sinh học (Dương Công Kiên, 2002) 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng in vitro thực vật 3.2.2.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Một yếu tố quan trọng tăng trưởng phát sinh hình thái tế bào mô thực vật nuôi cấy mô thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào mô thực vật thay đổi tùy theo lồi phận ni cấy Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm thành phần mơi trường thay đổi Môi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa mẫu cấy Tuy vậy, tất môi trường nuôi cấy bao gồm năm thành phần: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Khoáng đa lượng: Nhu cầu khống mơ, tế bào thực vật tách rời khơng khác nhiều so với trồng điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt Khoáng vi lượng: nguyên tố sử dụng với nồng độ 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy cần lượng nhỏ môi trường nuôi cấy chúng thành phần thiếu cho sinh trưởng phát triển mô Hàm lượng nguyên tố đa lượng nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy đối tượng nuôi cấy Carbon nguồn lượng: Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối q trình quang hợp cung cấp mà nguồn carbon bổ sung vào môi trường dạng đường Hai dạng đường thường gặp nuôi cấy in vitro glucose sucrose, sucrose sử dụng phổ biến Tùy theo mục đích ni cấy, nồng độ sucrose thay đổi từ – 6% (w/v), thông thường 2% w/v, tương ứng với 58,4mM (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp vitamin cần thiết cho tăng trưởng phát triển chúng Thực vật cần vitamin để xúc tác trình biến dưỡng khác Khi tế bào mơ ni cấy in vitro vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn phát triển chúng Các vitamin thường sử dụng nhiều nuôi cấy mô là: thiamin,acid nicotinic, pyridoxine myo inositol Thiamin vitamin cần thiết cho tăng trưởng tất tế bào Các hợp chất hữu bổ sung không xác định: Bổ sung nhiều chất trích hữu khác vào mơi trường nuôi cấy thường mang lại kết thuận lợi cho tăng trưởng mô Các chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua Tuy nhiên chất hữu không xác định nên sử dụng giải pháp cuối có nước dừa protein hydrolysate sử dụng rộng rãi Amino acid nguồn cung cấp nitrogen khác: tế bào có khả tổng hợp tất amino acid cần thiết bổ sung amino acid vào môi trường ni cấy để kích thích tăng trưởng tế bào Việc sử dụng amino acid đặc biệt quan trọng môi trường nuôi cấy tế bào nuôi cấy tế bào trần Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu tế bào nguồn nitrogen tế bào hấp thu nhanh nitrogen vô (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2006) 3.2.2.2 Ảnh hưởng mẫu nuôi cấy Tuổi cây: mô phơi thường có khả tái sinh cao ngũ cốc người ta thường dùng phôi hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi già đi, khả tái sinh chúng giảm theo phận non dễ tái sinh trường hợp bụi Một vài ví dụ cụ thể khác khả tái sinh phân chia tế bào già non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj Pierik, 1974) Anthurium andreanum (Pierik cs., 1974) Khi mô phân sinh chồi đỉnh tách khỏi mẹ chúng giữ đặc tính già hay non điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già bước trẻ hóa tăng khả tái sinh phân chia tế bào Điều chứng minh đối tượng Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica (Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Tuổi mơ quan: Những mơ cịn non mềm thường dễ nuôi cấy mô cứng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống non tái sinh tốt mẫu cấy từ cuống già quan chúng già nên khả tái sinh phân chia tế bào giảm Khả tái sinh loài khác tăng lên suốt giai đoạn hoa: phận phát hoa non đơi tái sinh mạnh, ví dụ Freesia (Bajaj Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik ctv, 1974) Tình trạng sinh lý: Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả tái sinh khả phân chia tế bào in vitro Thông thường phận giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy huệ tây giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt mẫu cấy giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các chồi giai đoạn ngủ đơng (cuối thu đầu đơng) khó ni cấy in vitro chồi vượt qua giai đoạn (vào mùa xuân trước chúng bắt đầu phát triển) Vị trí mẫu cấy cây: Có ảnh hưởng vị trí mẫu cấy lên sinh trưởng phát triển in vitro Theo đó, chồi ban đầu tách từ vị trí thấp phát triển mơi trường in vitro tốt chồi gốc tăng trưởng nhanh chồi nách Sự hình thành giả hành bất định mẫu cấy lan hương tách từ phần gốc vảy hành tốt từ phần đỉnh Điều xảy tương tự lily (Robb, 1957) Điều đáng lưu ý mô sẹo phát sinh từ mẫu cấy có nguồn gốc từ phần khác rễ, chồi, cuống có phản ứng in vitro giống Kích thước mẫu cấy: Các cấu trúc nhỏ tế bào, cụm tế bào mơ phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng cấu trúc lớn thân, lá, củ Các phần tách rời khỏi tự cung cấp chất dinh dưỡng hormone, mẫu cấy có kích thước lớn dễ tái sinh phát triển Các phận có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ củ, thân hành thường dễ tái sinh môi trường in vitro quan chất dự trữ Đối với mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt mẫu bị tổn thương ảnh hưởng đến khả tái sinh Ảnh hưởng vết thương lên tái sinh mẫu cấy từ vảy hành lily chứng minh (Aartrijk, 1984) Vết thương: Sự tổn thương bề mặt mẫu cấy đóng vai trị quan trọng tái sinh mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng chất điều hòa đồng thời ethylene tạo nhiều Ngồi ra, tăng cường hình thành rễ bất định vết thương Phương pháp cấy: Các mẫu cấy đặt mơi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) không cực (cắm phần xuống môi trường) Chồi rễ thường tái sinh dễ nhanh mẫu cấy không cực (Pierik Steegmans, 1975) Mẫu tái sinh tốt cung cấp đầy đủ oxy nhân tốt khác đóng vai trị quan trọng Phần gốc mẫu cấy khơng cực có chất dự trữ khơng có khả khuếch tán vào agar không tiếp xúc với môi trường Như trường hợp tất thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik ctv, 1974), tái sinh xảy phần gốc vảy hành, phương pháp cấy khơng cực dẫn đến hình thành thân hành bất định tốt phương pháp cấy có cực 3.2.2.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới phân chia tế bào q trình trao đổi chất mơ ni cấy, đồng thời ảnh hưởng đến hoạt động auxin ảnh hưởng trực tiếp đến khả rễ nuôi cấy mô Nhiệt độ nuôi cấy cần giữ ổn định khoảng 25 – 27oC Ánh sáng: Có ảnh hưởng mạnh đến trình phát sinh hình thái mơ ni cấy, bao gồm cường độ, chu kì thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ 1000 – 2500 lux dùng phổ biến nuôi cấy nhiều loại mơ Với cường độ ánh sáng lớn sinh trưởng chồi chậm lại thúc đẩy trình tạo rễ (Lê Xuân Đắc ctv, 2004) 3.2.2.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hoà sinh trưởng thực vật chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, tổng hợp quan gây ảnh hưởng điều tiết đến trình sinh lý, trao đổi chất quan khác Chất điều hồ sinh trưởng sản phẩm trao đổi chất bình thường thể thực vật Nó đóng vai trị chủ đạo trình sinh trưởng, phát triển q trình sinh lý, hố sinh khác phản ứng thích nghi thực vật điều kiện môi trường (Bùi Trang Việt, 2002) Chất điều hịa sinh trưởng auxin Auxin có số vai trị khác sinh trưởng phát triển thực vật Auxin kích thích tế bào kéo dài tăng trưởng, kích thích phân chia tế bào cách đặc biệt trình hình thành callus hình thành rễ bất định Ở nồng độ cao ức chế phát triển chồi nách thông qua chế ưu hình thành phơi soma mơi trường ni cấy callus Auxin hoạt hố phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho tạo mạch dẫn rễ, tăng trưởng quả, tạo khơng hạt, kích thích sinh trưởng ống phấn (Bùi Trang Việt, 2002) Ở nồng độ thấp thường dùng kết hợp với cytokinin auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vượt nồng độ giới hạn auxin ngăn cản phát triển hay mơ phân sinh bên Auxin kích thích mạnh kéo dài tế bào diệp tiêu Sự kéo dài tế bào rễ cần nồng độ auxin thấp nhiều so với thân chồi Hiệu ứng auxin giảm nồng độ auxin nhỏ nồng độ tối ưu trở nên độc nồng độ cao Trong hình thành rễ, đặc biệt rễ bất định phát sinh từ quan dinh dưỡng hiệu auxin đặc trưng Nếu mơi trường cho chất điều hịa sinh trưởng auxin mơ ni cấy xuất rễ mà thơi Cịn muốn tạo chồi để có hồn chỉnh phải bổ sung vào mơi trường chất tạo chồi cytokinin (Bùi Trang Việt, 2002) Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin Nhóm bao gồm dạng tự nhiên 2iP [γ-dimethylallylaminopurine), zeatin dạng tổng hợp BAP (N6-benzylaminopurine) Kinetin (6-furfurylaminopurine) Dạng tổng hợp có hoạt tính sinh học cao nên sử dụng rộng rãi nuôi cấy mô Cytokinin làm cho mô phồng lên, cảm ứng phát triển chồi nách chồi bất định, điều khiển phân chia tế bào Cytokinin bền nhiệt bổ sung vào mơi trường trước hấp vô trùng Trong nhân giống thường sử dụng BA nhiều so với chất khác nhóm cytokinin hoạt tính cao, bền với nhiệt, ánh sáng giá thành thấp chất khác Sự sinh trưởng tổng hợp cytokinin xảy vùng khác nhau, đặc biệt nơi có phân chia tế bào mạnh (ở thân hay rễ) Nó diện hầu hết mô, đặc biệt hạt, trái rễ Tuy nhiên, rễ nơi tổng hợp nhiều Vì rễ bị tổn thương thấy nụ phát triển yếu khơng tạo đủ cytokinin Nó hoạt hoá phân bào, song tác động thể phối hợp với auxin Trong nuôi cấy mơ, cytokinin thể tính chất cho phép giải khó khăn việc trì sống mơ, kích thích phân chia tế bào định hướng tế bào đường phân hoá (Bùi Trang Việt, 2002) Các yêu cầu mơ hình  Nguồn nước: - Nước giếng khoan để rửa dụng cụ - Nước lọc RO để pha môi trường sản xuất - Nước cất lần để pha hóa chất  Năng lượng: điện  Lao động: lao động kỹ thuật, lao động phổ thông  Diện tích: - Phịng cấy vơ trùng: 20 m2 - Phịng Ni cây: 50 – 100 m2 - Phịng pha mơi trường: 20 m2 - Phịng hấp mơi trường, rửa dụng cụ: 20 m2 - Khu vực huấn luyện cây: 50 m2  Thiết bị: - Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp tiệt trùng - Cân phân tích số lẻ - Cân kỹ thuật số lẻ - Máy đo pH - Tủ lạnh - Máy lọc nước RO - Máy cất nước lần  Dụng cụ: chai nước biển 500 ml, bình tam giác, …  Hóa chất ni cấy mơ Tổng quan mơ hình giới, Việt Nam TPHCM Phong lan nói chung Hồ điệp nói riêng loài hoa ưa chuộng nước ta, loài hoa quý phái, màu sắc đa dạng, hình dáng đặc biệt Hơn nữa, nghiên cứu Hồ điệp (Phalaenopsis) cho thấy lồi hoa lâu tàn chúng khơng thụ phấn thiên nhiên (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002) Chính điều mà nhu cầu trang trí hoa lan Hồ điệp thịnh hành, tình hình sản xuất nước không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường, hàng năm phải nhập số lượng lớn hoa cắt cành hoa để chậu, đặc biệt giống từ Thái Lan Đài Loan Khó khăn nhân giống vơ tính Hồ điệp (Phalaenopsis) Hồ điệp lai (Doritaenopsis) nguồn mẫu hạn chế chúng đơn thân Việc sử dụng chồi sinh dưỡng để ni cấy lồi lan khác làm tổn thương mẹ Phương pháp nhân giống lan Hồ điệp từ mầm ngủ phát hoa áp dụng phổ biến, phương pháp không làm tổn thương mẹ mà tạo nguồn bệnh đồng mặt di truyền Phát hoa dùng làm nguồn mẫu hoa bắt đầu nở, cấy mẫu mơi trường Vacin-Went có bổ sung 20 g/l sucrose, kết hợp với cytokynin auxin (Dương Tấn Nhựt, 2006) Nhân giống trực tiếp lan Hồ điệp từ mầm ngủ phát hoa không qua mô sẹo cho kết khác vị trí chồi mầm khác mơi trường có nồng độ khống thấp có hiệu chồi cao nhất, nhiên sau thời gian nuôi cấy hệ số nhân chồi chưa thật cao, số chồi tạo thành từ 72 chồi ngủ 92 chồi, trung bình số chồi sinh 1,32 chồi/ mầm ngủ, mơi trường có bổ sung chất điều hịa tăng trưởng thực vật với hàm lượng thấp lại cho số chồi/ mầm cao (2,8 chồi/mầm ngủ) (Nguyễn Thị Pha, 2011) Ở nghiên cứu khác người ta dùng chồi ngủ sau chồi nuôi cấy 60 ngày, non đủ rộng để làm vật liệu tạo PLBs Các mẫu thu từ chồi sinh dưỡng cắt theo kích thước x mm đặt lên mơi trường MS ½ có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thực vật NAA mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l Sau 10 tuần ni cấy PLBs bắt đầu xuất chủ yếu phần gốc lá, phần khác (Nguyễn Văn Hiếu, 2008) Khơng thị trường nước mà lan Hồ điệp có giá trị kinh tế cao thị trường giới, nhiều nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồ điệp thực từ lâu Đốt phát hoa có mang mầm ngủ lan Hồ điệp nuôi cấy môi trường Vacin-Went, kết chồi hình thành sau 30 ngày, chồi tăng trưởng tốt sau 60 ngày nuôi cấy Ghi nhận kết nuôi cấy, đoạn phát hoa có mang mầm ngủ cho thấy mầm ngủ xa gốc phát hoa phát triển tạo thành phát hoa thứ cấp, mầm gần gốc phát hoa tạo thành con, phương pháp tổn thương mẹ hình thành mơ sẹo khó, có giá trị nhân giống tạo chồi nên hệ số nhân không cao (Arditti, 1993) Gần việc nhân nhanh PLBs Hồ điệp hệ thống Bioreactor áp dụng, PLBs hình thành in vitro nuôi Bioreator sau tuần nuôi cấy thu 18,000 PLBs từ 1,000 PLBs ban đầu Nhiều môi trường sử dụng Murashige-Skoog, Vacin-Went, Knudson C, Lindemann Hyponex, cuối môi trường cho tỷ lệ PLBs cao Hyponex (Park, 2002) Phương pháp nuôi cấy in vitro cuống chồi ngủ phát hoa Hồ điệp môi trường Murashige and Skoog (MS) có bổ sung 30 g/l sucrose 20 mg/l BA mg/l NAA sau 12 tuần tái tạo PLBs (So-Young, 2002), nhiên phải nuôi cấy chồi ngủ đến xuất để sử dụng làm vật liệu cảm ứng tạo PLBs thời gian thu nhận PLBs tương đối dài Phương pháp tạo PLBs cách cắt lát mỏng lóng phát hoa, sau 30 ngày ni cấy có tạo thành PLBs bề mặt biểu bì mặt cắt mơi trường Vaccin Went có bổ sung mg/l mg/l BA đặc biệt vùng gần đỉnh phát hoa cho kết tạo PLBs cao Sau đó, nghiên cứu Lin bổ sung thêm vào mơi trường 100 mg/l myo-inositol phân tích hình thái giải phẫu mẫu cấy thấy phân chia tế bào diễn sau - 11 ngày nuôi cấy, xuất PLBs sau giai đoạn phân chia khoảng 20 - 45 ngày Phát hoa sử dụng để vô mẫu giai đoạn non, dài từ – 10 cm, hàm lượng đường sử dụng 20 g/l (Chin-chi, 1987) Nghiên 10 cứu khác với nồng độ khử trùng mẫu % chlorine cộng với vài giọt Tween-20 lắc 15 phút Chồi ngủ phát hoa ni cấy đến có từ - sử dụng làm vật liệu tạo PLBs, chồi tách đỉnh sinh trưởng cấy môi trường New Dogashima (NDM) bổ sung 0,1 mg/l NAA mg/l BAP sau năm thu kết với khoảng 10.000 PLBs từ chồi (Ken, 1993) Ở Nhật Bản người ta nhân giống vơ tính thành cơng lan Hồ điệp từ sớm Phát hoa có chiều dài 20 – 50 cm, cắt phần đỉnh khoảng 15 cm khử trùng với 0,1 % chlorobenzalconium 30 phút, cồn 70o khoảng vài phút, % chlorinevới 0,05 % Tween 80 10 phút, sau tháng thu tỷ lệ 50 - 80% PLBs/ mẫu cấy (Yoshiyuki, 1985) Bên cạnh đó, người ta tạo PLBs Hồ điệp thông qua mô sẹo với thời gian từ mô sẹo đến PLBs khoảng 40 ngày nuôi cấy, nhiên điều đặc biệt lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật dùng nghiệm thức thấp Sự kết hợp cytokynin auxin nằm ngưỡng từ 0,01 – mg/l, môi trường sử dụng NDM Phương pháp có lợi việc sử dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nuôi cấy, phải thông qua việc nuôi cấy chồi ngủ để dùng làm vật liệu thí nghiệm nên thời gian nhân giống chưa thật tối ưu Theo hướng khác, nhân giống Hồ điệp thông qua gây vết thương chồi non tạo thành từ mầm ngủ phát hoa, mầm ngủ ni mơi trường Knudson C hay Murashige-Skoog có khơng bổ sung chất điều hịa tăng trưởng thực vật Tác động lên chồi non cách cắt chéo hay song song với trục thân hủy đỉnh sinh trưởng chồi non dao cấy Kết thu nhận mơ sẹo Có thể dùng mơi trường MurashigeSkoog có bổ sung auxin cytokynin để tạo số lượng lớn PLBs từ chồi non có non phát triển từ mầm ngủ, PLBs phát triển từ phần gốc chủ yếu (Yoseph, 2008) Nguồn gốc, xuất xứ mơ hình: mơ hình kết hợp thành nghiên cứu đề tài nghiên cứu cấp sở thực tế sản xuất giống lan Hồ điệp phương pháp nuôi cấy mô Trung tâm Nghiên cứu phát triển Nông nghiệp công nghệ cao Tp HCM Mơ hình ứng dụng hiệu quả, chuyển giao giống lan Hồ điệp cấy mô cho nhà vườn Thành phố Hồ Chí Minh II Quy trình kỹ thuật Chuẩn bị, xây dựng mơ hình 11 (nêu rõ bước chuẩn bị: bố trí sản xuất, giống, nguyên vật liệu, máy móc, thiết bị, cần thiết để xây dựng mơ hình) - Nguồn giống: Chọn mẹ không bị sâu bệnh, sinh trưởng phát triển khỏe, hoa đẹp, siêng hoa, phát hoa dài Phát hoa Hồ điệp chọn nụ hoa nở, cắt lấy phần phát hoa có chứa chồi ngủ, cắt khúc đốt khoảng - cm có chứa chồi ngủ Vị trí mầm ngủ phát hoa Hồ điệp đánh số thứ tự từ vị trí hoa nở đến gốc phát hoa - Nguyên vật liệu: Môi trường nuôi cấy MS với thành phần sau: Stt Thành phần Đa lượng NH4NO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KNO3 KH2PO4 Vi lượng MnSO4.4H2O H3BO3 ZnSO4.4H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Fe-EDTA Na2EDTA FeSO4.7H2O VITAMIN Glycine Pirydoxine Myo-inositol Nicotinic acid Thiamin HCl Thành phần khác Đường Nước dừa Agar Hạ Long Nồng độ (mg/l) Ghi Pha Stock 1650 440 370 1900 170 Pha Stock 22,3 6,2 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 Pha Stock 37,3 27,8 Pha Stock 0,5 100 0,5 0,1 20 100 ml/lít 5,8 -6 12 Cân Cân Máy móc, thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, cân phân tích, cân kỹ thuật, máy đo pH, máy cất nước, phịng ni Quy trình hoạt động mơ hình (kỹ thuật ni trồng, chăm sóc, phịng trừ dịch hại; vận hành mơ hình…) Qui trình nhân giống lan Hồ điệp phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Phát hoa (bắt đầu nở hoa đầu tiên) Lau sạch, cắt đốt chứa chồi ngủ Khử trùng 13-15 tháng Môi trường nuôi cấy tạo PLBs, chồi: MS + mg/l BA -3 tháng PLBs, Chồi hình thành từ chồi ngủ Tạo PLBs Tạo PLBs từ non : MS + mg/l NAA + 10 mg/l adenin + 10 mg/l BA + 25 mg/l đường tháng PLBs, chồi Nhân chồi, PLBs: MS + mg/l BA - tháng Môi trường tăng trưởng cây: g/l Hyponex 7-6-19 + % nước dừa + 30 g/l chuối + 30 g/l sắn + 20 g/l đường tháng Cây nhỏ tháng Cây lớn: cao 4-5 cm, 3-4 rễ dài cm, 3-4 13 Qui trình nhân giống lan Hồ điệp phương pháp nuôi cấy mô Giai đoạn vô mẫu (2 - tháng): Phát hoa Hồ điệp cắt khúc với chiều dài –6 cm bao gồm chồi ngủ Cho mẫu phát hoa vừa cắt vào erlen lắc với xà phịng pha lỗng 30 phút, rửa xà phòng nước Đưa mẫu vào tủ cấy vơ trùng, chuyển mẫu vào erlen có chứa cồn 70 o, lắc mẫu phút, rửa lại lần nước cất vô trùng Khử trùng mẫu theo tỷ lệ Javel: nước = 1:1 Bổ sung giọt Tween 20 nhằm nâng cao hiệu khử trùng, lắc mẫu Sau rửa mẫu nước cất vô trùng - lần, cắt bỏ hai đầu khúc cắt mẫu khoảng 0,5 cm (loại bỏ phần mẫu bị tổn thương) Cấy mẫu vào môi trường MS có bổ sung 20 g/l sucrose g/l agar Giai đoạn xử lý hóa nâu đốt phát hoa Hồ điệp acid ascorbic (2 tháng): Để ngăn chặn q trình hóa nâu mẫu ni cấy đốt phát hoa hồ điệp tiến hành sử dụng acid ascorbic chất chống oxi hóa hợp chất phenol tiết bị tổn thương, việc nuôi cấy đốt phát hoa Lan hồ điệp mơi trường thích hợp hạn chế hóa nâu tỉ lệ mẫu chết thấp hóa nâu môi trường MS bổ sung acid ascorbic 75 mg/l Hình 1: Mẫu phát hoa Hồ điệp dùng làm vật liệu nuôi cấy Giai đoạn tạo PLBs trực tiếp từ đốt phát hoa Hồ điệp (2-3 tháng): Đốt phát hoa sau xử lý hóa nâu, chọn vị trí đốt phát hoa Hồ điệp thứ đánh số thứ tự từ vị trí hoa nở đến gốc phát hoa, đốt phát hoa cắt ngang mầm ngủ 14 cách cắt ngang chồi non, sau ni cấy mơi trường MS bổ sung BA mg/l điều kiện phịng ni có nhiệt độ 27 ± oC, ánh sáng khuyếch tán từ kệ ni lân cận (6,75 µmol/m2/s), ẩm độ 60 ± 5% Sau -3 tháng nuôi cấy, PLBs tạo thành phục vụ làm nguồn vật liệu cho mục đích nhân nhanh, tái sinh chồi Hình 2: Tạo PLBs từ chồi ngủ phát hoa Hồ điệp Giai đoạn nhân nhanh PLBs, tái sinh chồi từ PLBs (2-3 tháng): PLBs nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA mg/l để tái sinh chồi Điều kiện ni cấy phịng ni có nhiệt độ 27 ± 2oC, cường độ ánh sáng 27 µmol/m2/s, ẩm độ 60 ± 5% Sau tháng nuôi cấy, chồi thu dùng làm vật liệu cho trình tạo rễ a b Hình 3: PLBs (a) chồi lan Hồ điệp (b) Giai đoạn tăng trưởng (3-5 tháng): Chồi cao khoảng – 2,5 cm nuôi cấy môi trường g/l Hyponex 7-6-19 bổ sung 5% nước dừa, 30 g/l chuối; 30 g/l khoai tây, 20 g/l đường g/l agar 0,5 g/l than hoạt tính Điều kiện ni cấy phịng ni 15 có nhiệt độ 27 ± 2oC, cường độ ánh sáng 27 µmol/m2/s, ẩm độ 60 ± 5% Sau tháng nuôi cấy thu lan Hồ điệp in vitro hồn chỉnh Hình 4: Cây Hồ điệp cấy mơ hồn chỉnh Khai thác, tiêu thụ sản phẩm Tiêu chuẩn Hồ điệp cấy mô: Cây Hồ điệp cấy mơ hồn chỉnh có chiều cao trung bình từ 4-5 cm, có 3-4 rễ, 3-4 đạt tiêu chuẩn để trồng vườn ươm, phục vụ cho công tác sản xuất giống lan Hồ điệp cấy mô Hệ thống tiêu thụ, phân phối: Cây Hồ điệp cấy mô đủ tiêu chuẩn cung cấp cho nhà vườn, trang trại trồng lan Hồ điệp, bước đầu chủ động nguồn giống nước, hạn chế nhập nội III Đánh giá chất lượng sản phẩm, chất lượng cơng nghệ mơ hình - Áp dụng mơ hình nhân giống lan Hồ điệp phương pháp nuôi cấy mô tạo số lượng lớn giống, đồng nhất, bệnh, đáp ứng nhu cầu giống thị trường, có khả cạnh tranh cao - So với phương pháp nhân giống lan Hồ điệp truyền thống: ươm keki, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo số lượng lớn giống, hệ số nhân cao, chất lượng đồng nhất, bệnh so với phương pháp nhân giống truyền thống có hệ số nhân giống thấp, giống không đồng đều, không đủ giống trồng quy mô lớn IV Những thuận lợi, khó khăn lưu ý triển khai mơ hình V Hiệu đầu tư mơ hình (ước tính) Hiệu kinh tế (vốn đầu tư, chi phí, sản lượng, doanh thu, tỉ suất lợi nhuận, …) Giảm chi phí giá thành giống Hồ điệp, nâng cao chất lượng suất 16 trồng Góp phần phát triển kinh tế xã hội nông thôn Ứng dụng vào quy trình sản xuất lan Hồ Điệp phương pháp nuôi cấy mô nhằm nâng cao hiệu nhân giống, tạo nguồn giống ổn định chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ nước Hiệu xã hội (tạo việc làm, …) - Quy trình nhân giống lan Hồ điệp phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật góp phần tạo thêm cơng ăn việc làm cho nhà sản xuất ni trồng lan Hồn thiện phát triển biện pháp nhân giống để trì giống gốc nhân nhanh mặt số lượng, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen Việc phát triển mơ hình trồng lan Hồ điệp cịn góp phần làm đẹp cảnh quan mơi trường góp phần thúc đẩy ngành du lịch sinh thái phát triển - Tạo dựng mơ hình liên kết khoa học – đào tạo – sản xuất, phục vụ trực tiếp chương trình kinh tế xã hội - Đáp ứng nhu cầu giống lan Hồ điệp cho người trồng lan địa bàn thành phố Hồ Chí Minh, Lâm Đồng tỉnh lân cận - Chủ động nguồn giống phục vụ cho sản xuất hoa lan nước, giảm thiểu nhập giống từ nước - Thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội, chương trình chuyển đổi cấu kinh tế nông nghiệp, phát triển nông nghiệp đô thị thành phố nước Hiệu mơi trường Hồn thiện kỹ thuật nhân giống lan Hồ Điệp, tạo số lượng lớn giống cung cấp cho thị trường, góp phần chống việc khai thác giống mức tự nhiên Khả nhân rộng: mơ hình có khả nhân rộng phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật quy mô nước VI Địa chuyển giao, tư vấn Địa tham quan mơ hình Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao HCM Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh Địa cung cấp nguyên vật liệu, máy móc, thiết bị Địa chuyển giao, tư vấn: Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao HCM 17 Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh Đã áp dụng mơ hình để cung cấp 15.000 Hồ điệp cấy mơ cho ơng Ơng Phan Hồng Hải Địa chỉ: 435/11 Bình Quới, phường 28, quận Bình Thạnh, Tp HCM Điện thoại: 0908 247 959 KẾT LUẬN Qua q trình thực mơ hình quy trình nhân giống lan Hồ điệp phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật chúng tơi có số kết luận sau: Phát hoa Hồ điệp cắt khúc 5-6 cm có mầm ngủ khử trùng theo tỷ lệ Javel: nước = 1:1, cấy mẫu vào môi trường MS có bổ sung 20 g/l sucrose g/l agar Mơi trường thích hợp để xử lý hóa nâu nuôi cấy đốt phát hoa Hồ điệp môi trường MS có bổ sung acid ascorbic 75 mg/l Vị trí đốt phát hoa Hồ điệp thích hợp để tạo PLBs đốt phát hoa thứ 3, phương pháp cắt ngang mầm ngủ đốt phát hoa Hồ điệp môi trường thích hợp để tạo PLBs từ phát hoa Hồ điệp mơi trường MS có bổ sung BA mg/l Mơi trường thích hợp cho tái sinh chồi từ PLBs lan Hồ điệp mơi trường MS có bổ sung BA mg/l Môi trường g/l Hyponex 7-6-19 bổ sung 5% nước dừa, 30 g/l chuối; 30 g/l khoai tây, 20 g/l đường g/l agar 0,5 g/l than hoạt tính 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Hồng Hộ (1975) Hiển hoa bí tử Trung tâm sản xuất học liệu Bộ văn hóa Giáo dục Thanh niên [2] Võ Thị Bạch Mai (1996) Nhân giống vơ tính số lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học TP.HCM P:6-87 [3] Mai Trần Ngọc Tiếng (2002) Những tượng kỳ thú đời sống cảnh Nhà xuất Nông nghiệp TP.HCM [4] Dương Tấn Nhựt (2006) Ứng dụng Công nghệ Nuôi cấy mô tế bào thực vật việc nhân nhanh lan Hài lan Hồ điệp Phân viện Sinh học Đà Lạt [5] Nguyễn Thị Pha ctv (2011) Nuôi cấy mầm ngủ phát hoa lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp.) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ [6] Nguyễn Văn Hiếu (2008) Nhân giống invitro lan Hồ điệp Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM [7] Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý Thực vật Đại cương Phần II Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM [8] Bùi Trang Việt (2002) Sinh lý Thực vật Đại cương Phần I Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM [9] Arditti, J., Ernst, R (1993) Micropropagation of orchids Wiley Publishers New York [10] Park, S.Y., Murthy, H.N Paek, K.Y (2002) Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk-derived leaves In Vitro Cell Dev Biol Plant 38:168– 172 [11] So-young, P., Hosakatte, N M Kee-yoeup, P (2002) Rapid propagation of phalaenopsis from floral stalk-derived leaves In Vitro Cell Dev Biol.—Plant 38:168–172 [12] Chin-chi, L (1987) Histological observations on in vitro formation of protocorm-like bodies from flower atalk internodes of Phalaenopsis Lindleyana 2(1): 58 - 65 [13] Ken, and Masahiro, M (1993) Micropropagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis by culturing shoot tips of flower stalk buds Plant Cell Reports 13: 711 [14] Yoshiyuki, H Tadashi, A (1985) New means of Phalaenopsis propagation with internodal section of flower stalk J Japan Soc Hort Sci 54(3) : 379-387 [15] Joseph, A (2008) Micropropagation of orchids Blackwell Publishing Ltd, Vol 2, p 906-1029 19