NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REALTIME PCR đa mồi TRONG PHÁT HIỆN ROTAVIRUS và NOROVIRUS gây TIÊU CHẢY cấp ở TRẺ EM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ HẢO Nghiªn cøu ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI VŨ THỊ HẢO Nghiªn cøu øng dơng kü tht Realtime PCR ®a måi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trỴ em Chun ngành: Vi sinh Mã số : 60720115 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Với lòng người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy hướng dẫn tận tình, giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt q trình học tập nghiên cứu để thực đề tài Sự hướng dẫn tận tình kiến thức quý báu thầy đóng vai trò vơ quan trọng trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cám ơn đến tất thầy cô hội đồng thông qua đề cương hội đồng chấm khóa luận dành thời gian đọc đóng góp ý kiến quý báu để em hoàn chỉnh luận văn Em xin cám ơn toàn thể anh chị nhân viên, kỹ thuật viên khoa nghiên cứu sinh học phân tử bệnh truyền nhiễm Bệnh viện Nhi Trung ương giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện mặt q trình thu thập, xử lí bệnh phẩm, cho em lời khuyên bổ ích trình thực luận văn Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, chị kỹ thuật viên, bác sỹ nội trú vi sinh khóa 39, 40, 41 giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên em q trình học tập hồn thiện luận văn Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, phòng ban chức Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người than gia đình bạn bè ln ủng hộ em suốt q trình thực đề tài Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Vũ Thị Hảo LỜI CAM ĐOAN Tôi Vũ Thị Hảo, bác sĩ nội trú khóa 41, trường đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh Tôi xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Lê Văn Phủng TS Phùng Thị Bích Thủy Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin cam đoan điều trình bày hồn tồn trung thực xác Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2018 Vũ Thị Hảo DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) BPS Phosphate-buffered saline Ct Chu kì ngưỡng phát dsRNA Double-stranded ribonucleic acid (acid ribonucleic chuỗi kép) (+) ssRNA Positive-sense single-stranded ribonucleic acid (acid nucleic chuỗi đơn dương) DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (acid nucleic mạch bổ trợ) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (kĩ thuật miễn dịch gắn enzym) ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược) TCC Tiêu chảy cấp VP Viral protein (protein cấu trúc) NSP Non-Structure protein (protein phi cấu trúc) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình tiêu chảy cấp Rotavirus, Norovirus 1.1.1 Tình hình giới .3 1.1.2 Tình hình Việt Nam 1.2 Đặc điểm tính chất hệ gen Rotavirus, Norovirus 1.2.1 Đặc điểm Rotavirus 1.2.2 Đặc điểm Norovirus 1.3 Các kỹ thuật phát Rotavirus, Norovirus .10 1.3.1 Kỹ thuật nuôi cấy 10 1.3.2 Kỹ thuật phát kính hiển vi điện tử 11 1.3.3 Các kỹ thuật miễn dịch 13 1.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử 16 1.3.4.3 Kỹ thuật Realtime PCR đa mồi .20 1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Địa điểm nghiên cứu 22 2.2 Thời gian nghiên cứu 22 2.3 Đối tượng nghiên cứu 22 2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 22 2.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị .23 2.4.2 Hóa chất 23 2.5 Phương pháp nghiên cứu 24 2.5.1 Thiết kế nghiên cứu: 24 2.5.2 Phương pháp Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus 26 2.5.3 Phản ứng Realtime PCR xác định Norovirus Rotavirus 28 2.5.4 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng Realtime PCR đa mồi với kit thương mại có chứng IVD 30 2.6 Xử lý số liệu .30 2.7 Đạo đức nghiên cứu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 31 3.1.1 Kết xử lí bệnh phẩm tách chiết RNA 31 3.1.2 Kết phản ứng Realtime PCR 32 3.1.3 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật Realtime PCR đa mồi với kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng IVD 35 3.2 Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR đa mồi xác định tỉ lệ Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 37 3.2.1 Tỉ lệ phát TCC Rotavirus, Norovirus 37 3.2.2 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo giới tính 38 3.2.3 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo nhóm tuổi 39 3.2.4 Một số số xét nghiệm máu, phân .42 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 45 4.1 Hoàn thiện kỹ thuật Realtime PCR đa mồi phát Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 45 4.1.1 Kết xử lí bệnh phẩm tách chiết RNA 45 4.1.2 Phản ứng Realtime PCR đa mồi .47 4.2 Một số đặc điểm dịch tễ Rotavirus, Norovirus 50 4.2.1 Tỉ lệ phát tiêu chảy cấp Rotavirus, Norovirus .50 4.2.2 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo giới tính 52 4.2.3 Phân bố bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus theo tuổi .53 4.2.4 Một số số xét nghiệm máu, phân 55 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các đoạn gen Rotavirus Bảng 1.2 Cấu trúc protein Rotavirus Bảng 2.1 Trình tự Primer, Probe gen GAPDH, Rotavirus, Norovirus .24 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng 29 Bảng 3.1 Nồng độ RNA sau tiền xử lý mẫu tách chiết nucleic acid.31 Bảng 3.2 Phân bố giá trị Ct kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 32 Bảng 3.3 Kết phát Rotavirus kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 33 Bảng 3.4 Kết phát Norovirus kỹ thuật Realtime PCR đơn mồi kỹ thuật Realtime PCR đa mồi 34 Bảng 3.5 Kết giá trị Ct so sánh kỹ thuật Realtime PCR đa mồi kit thương mại FTD viral gastroenteritis có chứng IVD 35 Bảng 3.7 Kết phát Norovirus kỹ thuật Realtime PCR đa mồi kit thương mại FTD .36 Bảng 3.8 Bảng phân bố nguyên Rotavirus Norovirus gây tiêu chảy cấp trẻ em 37 Bảng 3.9 Đặc điểm giới bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus .38 Bảng 3.10 Phân bố tuổi bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus .39 Bảng 3.11.Kết soi phân bệnh nhân TCC Rotavirus, Norovirus .44 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tỉ lệ tử vong bệnh nhân tiêu chảy cấp Rotavirus Hình 1.2 Hình ảnh minh họa cấu trúc Rotavirus Hình 1.3 Hình ảnh minh họa cấu trúc Norovirus Hình 1.4 Hình ảnh Rotavirus kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.5 Hình ảnh Norovirus kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.6 Ngun lí phương pháp ELISA 14 Hình 1.7 Nguyên lí kỹ thuật sắc kí miễn dịch 15 Hình 1.8 Biểu đồ quan hệ chu kỳ tín hiệu huỳnh quang phản ứng realtime PCR 18 Hình 1.9 Cơ chế hoạt động TaqMan Probe Realtime PCR 19 Hình 2.1 Nguyên lí hoạt động hệ thống tách chiết MagNA Pure LC 2.0 27 65 Bok-Soon Min, Yoon-Ju Noh, Jin-Ho Shin et al (2006), "Assessment of the quantitative real-time polymerase chain reaction using a cDNA standard for human group A rotavirus", Journal of virological methods, 137(2), tr 280-286 66 Miren Iturriza Gómara, Cecilia Wong, Sandra Blome et al (2002), "Molecular characterization of VP6 genes of human rotavirus isolates: correlation of genogroups with subgroups and evidence of independent segregation", Journal of virology, 76(13), tr 6596-6601 67 Molly M Freeman, Tara Kerin, Jennifer Hull et al (2008), "Enhancement of detection and quantification of rotavirus in stool using a modified real‐time RT‐PCR assay", Journal of medical virology, 80(8), tr 1489-1496 68 Jan Vinjé, Harry Vennema, Leena Maunula et al (2003), "International collaborative study to compare reverse transcriptase PCR assays for detection and genotyping of noroviruses", Journal of clinical microbiology, 41(4), tr 1423-1433 69 Narayanan Jothikumar, James A Lowther, Kathleen Henshilwood et al (2005), "Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples", Applied and environmental microbiology, 71(4), tr 1870-1875 70 Xiaoli L Pang, Jutta K Preiksaitis Bonita Lee (2005), "Multiplex real time RT-PCR for the detection and quantitation of norovirus genogroups I and II in patients with acute gastroenteritis", Journal of Clinical Virology, 33(2), tr 168-171 71 Victoria Kiseleva, Evgeny Faizuloev, Elena Meskina et al., "MolecularGenetic Characterization of Human Rotavirus A Strains Circulating in Moscow, Russia (2009–2014)", Virologica Sinica, tr 1-10 72 Qassim Mahdi Mutlak, Manal Khalid Abdulridha and Laith M Abbas Al-Huseini (2018), "Updates in the Prevalence of Rotavirus Gastroenteritis in Babylon City", Al-Mustansiriyah Journal for Pharmaceutical Sciences, 18(2), tr 1-12 73 Kumari Seema, Manoj Kumar, Ashok Sharma et al (2018), "Prevalence Of Rotaviral Diarrhoea In Hospitalized Children Under Five Years In A Tertiary Care Hospital Of Eastern India", International Journal Of Scientific Research, 7(4) 74 Yongbo Kang and Yue Cai (2018), "Epidemiology and Genetic Diversity of Rotavirus in Kunming, China, in 2015", Intervirology, tr 1-5 75 Trung Vu Nguyen, Phung Le Van, Chinh Le Huy et al (2004), "Diarrhea caused by rotavirus in children less than years of age in Hanoi, Vietnam", Journal of clinical microbiology, 42(12), tr 5745-5750 76 Daniel C Payne, Jan Vinjé, Peter G Szilagyi et al (2013), "Norovirus and medically attended gastroenteritis in US children", New England journal of medicine, 368(12), tr 1121-1130 77 Bindhu Monica, Sasirekha Ramani, Indrani Banerjee et al (2007), "Human caliciviruses in symptomatic and asymptomatic infections in children in Vellore, South India", Journal of medical virology, 79(5), tr 544-551 78 Kanittapon Supadej, Pattara Khamrin, Kattareeya Kumthip et al (2018), "Distribution of norovirus and sapovirus genotypes with emergence of NoV GII P16/GII recombinant strains in Chiang Mai, Thailand", Journal of medical virology 79 Adissa Tran, Déborah Talmud, Bent Lejeune et al (2010), "Prevalence of rotavirus, adenovirus, norovirus, and astrovirus infections and coinfections among hospitalized children in northern France", Journal of clinical microbiology, 48(5), tr 1943-1946 80 Mohamed Abugalia, Luis Cuevas, Andrew Kirby et al (2011), "Clinical features and molecular epidemiology of rotavirus and norovirus infections in Libyan children", Journal of medical virology, 83(10), tr 1849-1856 81 Marlena Rytlewska, Wanda Bako, Barbara Ratajczak et al (2000), "Epidemiological and clinical characteristics of rotaviral diarrhoea in children from Gdańsk, Gdynia and Sopot", Medical Science Monitor, 6(1), tr EP117-EP122 82 Kareman J Al-Zein and Ahmed Alkafajei (2012), "Epidemiological, clinical and laboratory features of rotavirus gastroenteritis among hospitalized children less than five years old in selected hospitals in Jordan, 2007-2008", The Medical Journal of Basrah University, 30(1), tr 30-39 83 Mosab A Adam, Ji Wang, Khalid-A Enan et al (2018), "Molecular Survey of Viral and Bacterial Causes of Childhood Diarrhea in Khartoum State, Sudan", Frontiers in microbiology, 9, tr 112 84 Filemon Bucardo, Johan Nordgren, Beatrice Carlsson et al (2008), "Pediatric norovirus diarrhea in Nicaragua", Journal of clinical microbiology, 46(8), tr 2573-2580 85 Mehmedali Azemi, Majlinda Berisha, Vlora Ismaili-Jaha et al (2013), "Socio-demographic, Clinical and Laboratory Features of Rotavirus Gastroenteritis in Children Treated in Pediatric Clinic", Materia sociomedica, 25(1), tr 86 Gianvincenzo Zuccotti, Fabio Meneghin, Dario Dilillo et al (2010), "Epidemiological and clinical features of rotavirus among children younger than years of age hospitalized with acute gastroenteritis in Northern Italy", BMC infectious diseases, 10(1), tr 218 87 Nguyen Van Trang, Hau ThiBich Vu, Nhung ThiHong Le et al (2014), "Association between norovirus and rotavirus infection and histo-blood group antigen types in Vietnamese children", Journal of clinical microbiology, tr JCM 02927-13 88 Baoming Jiang, Jon R Gentsch and Roger I Glass (2002), "The role of serum antibodies in the protection against rotavirus disease: an overview", Clinical infectious diseases, 34(10), tr 1351-1361 89 Mei Zeng, Xiaohua Xu, Chaomin Zhu et al (2012), "Clinical and molecular epidemiology of norovirus infection in childhood diarrhea in China", Journal of medical virology, 84(1), tr 145-151 PHỤ LỤC I MẪU THU THẬP THÔNG TIN Họ tên bệnh nhân: Ngày sinh: Mã BN: Tuổi: Mã bệnh phẩm: Giới: Địa chỉ: Ngày vào viện: Điện thoại liên lạc: Chiều cao: Cân nặng tại: Kg Xét nghiệm máu: CRP: Hb: Hct: Bạch cầu: Bạch cầu trung tính: Bạch cầu lympho: Tiểu cầu: Na+ : K+ : Cl- : Xét nghiệm soi phân: Hồng cầu phân: Bạch cầu phân: PHỤ LỤC II Quy trình tách chiết acid nucleic máy tách chiết tự động MagNa Pure LC 2.0 - Chuẩn bị hóa chất: Protein K theo hướng dẫn, pha 6,4 ml dung dịch Protein K buffer vào lọ Protein K, lắc tan Lưu trữ 2-8°C vòng tháng, -15°C đến -20°C vòng năm Dung dịch bi từ lưu trữ nhiệt độ phòng, cần lắc trước sử dụng - Sử dụng máy tách chiết MagNa Pure LC 2.0: - Thực theo hướng dẫn vận hành máy MagNA Pure LC 2.0 - Vệ sinh máy: dùng giấy thấm cồn 70% lau khu vực bên máy - Mở nguồn máy, đăng nhập vào phần mềm - Thực việc bảo trì: bơi trơn đầu pippet - Mở hình Overview chọn Ordering, nhập thơng tin mẫu chạy máy - Vào mục Purification protocol, chọn Protocol nhập thông tin Sample volume Elution volume, chọn next - Dựa hình Workplace stage Setup, lắp đặt vật dụng tiêu hao cần thiết cho máy - Đặt khay chứa mẫu bệnh phẩm vào ấn Start - Sau máy tách chiết xong, hút mẫu tách chiết sang ống 0,5 ml có ghi rõ mã nghiên cứu nắp thân ống - Vệ sinh máy chiếu đèn UV PHỤ LỤC III Quy trình đo độ quang phổ máy Nano Drop 1000 Bước 1: Khởi động máy tính, mở phần mềm Nano Drop 1000 máy tính Bước 2: Ấn chọn mục acid nucleic Bước 3: Mở cánh tay nhận mẫu, nhỏ µl dung dịch Elution buffer dùng Kit tách chiết MagNA Pure LC Total Nucleic acid Isolation Kit vào vị trí nhận mẫu – High Performance, đóng cánh tay nhận mẫu, ấn chọn Blank Bước 4: Mở cánh tay nhận mẫu lau dung dịch vừa nhỏ bước Bước 5: Ấn chọn RNA mục type Bước 6: Nhỏ µl mẫu tách chiết RNA vào vị trí nhận mẫu, đóng cánh tay nhận mẫu, ấn chọn Measure Sau việc đo quang phổ hoàn thành, phần mềm tự động tính tốn đưa giá trị nồng độ RNA, độ tinh acid nucleic Bước 7: Vệ sinh máy đóng cánh tay nhận mẫu PHỤ LỤC IV Quy trình chạy Realtime PCR đa mồi kit thương mại viral gastroenteritis FTD Thành phần hỗn hợp phản ứng: Kí hiệu Noro PP ARA PP GASTRO PC NC IC Enzyme Buffer Thành phần Hỗn hợp mồi/probe phát Noroviruses (NoroG1 NoroG2) IC Hỗn hợp mồi/probe phát Astrovirus, Rotavirus Adenovirus Chứa chứng dương plasmid phát Noro G1/G2, Astrovirus, Rotavirus Adenovirus Negative control Internal control 25x RT-PCR Enzyme mix (Fast-track mastermix) 2x RT-PCR buffer (Fast-track mastermix) CÁC BƯỚC THỰC HIỆN Tách chiết ADN/ARN tổng số: Tách theo quy trình kit MPLC Total nucleic acid Isolation Kit-High Performance (Roche) - Hút 2µL IC (lấy từ kit FTD viral gastroenteritis) vào khay mẫu - Tiếp tục hút 200µL mẫu chứng âm vào khay mẫu - Tiến hành tách chiết theo quy trình kit MPLC Total nucleic acid Isolation Kit-High Performance (Roche) - Thể tích Elution 100 µL Thực phản ứng Realtime PCR đa mồi FTD viral gastroenteritis a Trộn hỗn hợp hóa chất Có 02 cặp hỗn hợp mồi probe (PP) sử dụng là: Noro PP, ARA PP Chuẩn bị 02 ống ly tâm vô trùng 1,5ml để trộn riêng rẽ hỗn hợp hóa chất chứa cặp mồi probe Sau hút vào ống hóa chất theo cơng thức sau: Tên hóa chất PP Mix Thể tích cho 01 phản ứng 12.5 μL - Buffer 1.5 μL Enzyme μL Tổng số 15 μL b Chia hóa chất vào plate Realtime PCR 96 giếng Thiết kế sơ đồ chạy phản ứng Realtime PCR Chọn plate Realtime PCR tương thích với hệ thống máy Realtime PCR ( ABI 7500 ABI 7500 Fast) Hút 15 µL hỗn hợp phản ứng Noro PP vào giếng theo sơ đồ Hút 15 µL hỗn hợp phản ứng ARA PP vào giếng theo sơ đồ c Nhỏ mẫu chứng Chuyển plate Realtime PCR khu vực nhỏ mẫu Hút 10 µL mẫu, chứng âm, chứng dương vào plate theo sơ đồ Phủ phim lên plate, ly tâm nhanh Đặt plate vào máy Realtime PCR d Chọn chương trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR Cài đặt vị trí mẫu máy dye huỳnh quang sau: Hỗn hợp PP Tác nhân phát Dye Bước sóng phát (nm) Noro Norovirus G2 Xanh 520 ARA - - BMV (IC) Norovirus G1 Astrovirus Rotavirus Adenovirus Vàng Đỏ Xanh Vàng Đỏ 550 670 520 550 670 Chương trình nhiệt phản ứng Realtime PCR sau: 42°C 15 phút 94°C phút 40 chu kỳ của: 94°C giây, 60°C 34 giây(đọc tín hiệu huỳnh quang sau bước này) e Điều kiện chấp nhận kết Tất chứng âm nằm chu kỳ ngưỡng Tất chứng dương có giá trị Ct