Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng phát hiện bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR

Xác định các tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn truyền thống và kỹ thuật multiplex real-time PCR, qua đó phân tích các kết quả thu nhận được.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG PHÁT HIỆN BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REAL TIME PCR Lý Khánh Vân*, Lý Văn Xuân* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Do hạn chế khó vượt qua kỹ thuật nuôi cấy truyền thống mẫu đàm nên chưa có cơng trình nghiên cứu Việt Nam xác định đầy đủ tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị Chính việc áp dụng kỹ thuật multiplex real-time PCR để tìm hiểu tác nhân vi khuẩn thật gây bệnh cần thiết Mục tiêu: Xác định tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng người lớn nhập viện thực phương pháp nuôi cấy vi khuẩn truyền thống kỹ thuật multiplex real-time PCR, qua phân tích kết thu nhận Đối tượng phương pháp: Đây nghiên cứu đa trung tâm thực đối tượng bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị Phương pháp nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống kỹ thuật multiplex real-time PCR để phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh diện mẫu đàm hay dịch rửa khí phế quản lấy từ bệnh nhân sau đánh giá mức độ tin cậy theo thang điểm Barlett Kết quả: Có tất 271 bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng đưa vào nghiên cứu Kết multiplex real-time PCR cho thấy có đến 67,5% trường hợp phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh với S pneumoniae H influenzae có tỷ lệ cao (23,6% 15,5%), K pneumoniae (5,5%), A baumannii (6,3%), E coli (4,4%) P aeruginosa (3,0%) Ngồi có tác nhân khác phát với tỷ lệ thấp Kết nuôi cấy khơng kể trường hợp nhóm S viridans tỷ lệ phát tác nhân vi khuẩn gây bệnh 44,3%, thấp phương pháp multiplex real-time PCR, cao K pneumoniae (12,2%), P aeruginosa (9,6%), A baumannii (7,7%) E coli (5,2%); khơng có trường hợp phân lập S pneumoniae, H influenzae vi khuẩn khơng điển hình Kết luận: Tỷ lệ phát vi khuẩn gây bệnh kỹ thuật multiplex real-time PCR cao phương pháp nuôi cấy truyền thống (67,5% so với 44,3%), chiếm tỷ lệ cao S pneumoniae (23,6%), H influenzae (15,5%), A baumannii (6,3%) K pneumoniae (5,5%) vi khuẩn phát phương pháp nuôi cấy truyền thống chiếm tỷ lệ cao K pneumoniae (15,8%), P aeruginosa (7,6%), A baumannii (7,6%), E coli (6,9%) khơng có trường hợp phát S pneumoniae (23.6%) H influenza Từ khóa: tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi cộng đồng; kỹ thuật multiplex real-time PCR ABSTRACT BACTERIA CAUSING HOSPITALIZED COMMUNITY ACQUIRED PNEUMONIA DETECTED BY MULTIPLEX REAL TIME PCR Ly Khanh Van, Ly Van Xuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 1- 2019: 66-74 Backgrounds: Today, due to the limitations that are difficult to overcome in the culture of the sputum, almost no study in Vietnam has shown all bacteria that causes the hospitalized community-acquired pneumonia Therefore, the use of multiplex real-time PCR is essential to help in breaking these limitations down * Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS Lý Văn Xuân ĐT: 0908588547 66 Email : xuanlyvan@yahoo.com Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Objectives: Define community-acquired pneumonia bacteria by both traditional bacterial cultures and multiplex real-time PCR methods Methods: This is a multicenter study conducted on the hospitalized patients with community-acquired pneumonia The method of the study was to use the traditional bacterial culture and multiplex real-time PCR to detect bacterial pathogens presented in the sputum or bronchial lavage fluid taken from patients immediately after delivery to the study Results: A total of 271 patients with community-acquired pneumonia (CAP) was included in the study Multiplex real-time PCR results showed that up to 67.5% of the cases were found the bacterial pathogens in which S pneumoniae and H influenzae were at the high rates (23.6% and 15.5%), followed by K pneumoniae (5.5%), A baumannii (6.3%), E coli (4.4%) and P aeruginosa (3.0%), The others were also detected with the lower rates About the culture results, regardless of the group of the S viridans, the detection rate of pathogens was 44.3%, lower than that of multiplex real-time PCR, in which the highest was K pneumoniae (12.2%), followed by P aeruginosa (9.6%), A baumannii (7.7%) and E coli (5.2%); No case of S pneumoniae, H influenzae and atypical bacteria was isolated Conclusions: The rate of bacterial pathogens detected by multiplex real time PCR is higher than that of traditional culture (67.5% compared with 44.3%), in which the highest is S pneumoniae (23.6%), followed by H influenzae (15.5%), A baumannii (6.3%) and K pneumoniae (5.5%) Keywords: bacterial pathogens causing community acquired pneumonia; multiplex real-time PCR detecting community acquired pneumonia lạc vi khuẩn gây bệnh mọc mặt thạch để ĐẶT VẤN ĐỀ phân lập; cuối bệnh phẩm không Viêm phổi mắc phải cộng đồng bệnh đánh giá độ tin cậy để loại bỏ mẫu không phổ biến xảy khắp nơi lứa tuổi phải đàm mà nhầy nhớt vùng hầu họng mà nguyên nhân thường gặp vi khuẩn trước tiến hành nuôi cấy phân lập Tuy nhiên việc xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh gặp khơng khó khăn bệnh phẩm chủ yếu để phát vi khuẩn đàm (hoặc chất có đàm) lấy từ bệnh nhân Bệnh phẩm thường bị tạp nhiễm phải qua đường hầu họng nên việc ni cấy theo phương pháp truyền thống để phát vi khuẩn gây bệnh bị hạn chế nhiều lý do(9) Đó đa số bệnh nhân sử dụng kháng sinh trước nên dù vi khuẩn sống dịch lót biểu mơ phế quản, phế nang mẫu đàm vi khuẩn gây bệnh chết Ngồi ngun nhân chủ quan phòng xét nghiệm làm cho khả cấy vi khuẩn gây bệnh giảm là: phòng xét nghiệm khơng có đủ mơi trường thích hợp để phân lập vi khuẩn gây bệnh chủ yếu lại khó ni cấy; mẫu bệnh phẩm khơng cấy để tăng hội phát vi khuẩn gây bệnh; kỹ thuật viên chưa đủ kinh nghiệm để chọn khuẩn Chun Đề Nội Khoa Để khơng gặp khó khăn, trở ngại để xác định vi khuẩn gây bệnh, kỹ thuật Multiplex real time PCR sử dụng phương pháp tối ưu có độ nhạy độ đặc hiệu cao, dựa nguyên tắc vừa nhân bản, vừa phát trình tự nucleic acid đặc hiệu vi khuẩn có mẫu bệnh phẩm, đồng thời định số lượng vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn phối hợp(10) Mục tiêu nghiên cứu Xác định tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây viêm phối mắc phải cộng đồng người lớn nhập viện Xác định tỷ lệ phối hợp tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng động Xác định tỷ lệ phù hợp tác nhân vi khuẩn gây bệnh phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật Multiplex real time PCR 67 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang đối tượng bệnh nhân người lớn nhập viện khoa hô hấp Bệnh viện Cần Thơ, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Lao bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định Bệnh viện Nguyễn Tri Phương thời gian từ tháng 06/2016 đến tháng 02/2017 Mẫu bệnh phẩm đàm lấy từ bệnh nhân đánh giá tin cậy (> điểm theo thang điểm Barlett) tiến hành nghiên cứu Multiplex real time PCR Kết phát định lượng tác nhân vi khuẩn xác định tác nhân gây bệnh số định lượng > 100.000 copies Riêng vi khuẩn khơng điển hình khơng có tiêu chuẩn nên chúng tơi cho tác nhân gây bệnh số định lượng > 5.000 copies Tác nhân vi khuẩn cho tác nhân số lượng cao tác nhân có số lượng cho tác nhân phối hợp KẾT QUẢ Qua nghiên cứu 271 mẫu bệnh phẩm đàm bệnh phẩm có chứa đàm bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng người lớn nhập viện điều trị, ghi nhận kết phát vi khuẩn gây bệnh kỹ thuật real time PCR phương pháp nuôi cấy truyền thống sau: Để có sở so sánh với kỹ thuật Multiplex real time PCR, mẫu bệnh phẩm nuôi cấy theo phương pháp truyền thống khoa vi sinh bệnh viện nêu giữ tủ đơng -180C, sau chuyển đến phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa để thực kỹ thuật Bảng 1: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh tác nhân vi khuẩn phối hợp phát kỹ thuật multiplex real-time PCR Tác nhân Chính Phối hợp N % N % N % S pneumoniae 64 23,6 29 10,7 93 34,3 H influenza 42 15,5 13 4,8 55 20,3 1,1 1,1 M catarrahlis 2,6 0,4 3,0 Streptococci nhóm A 0,4 0,4 H influenza B 68 Tổng Streptococci nhóm B 0,7 0,7 1,5 Stresptococcus faecalis 0,7 1,1 1,8 Stresptococcus faecium 1,1 1,8 3,0 Methicillin resistant Staphylococci 0,7 0,7 Methicillin resistant S aureus 0,4 2,6 3,0 Methicillin supceptible S aureus 0,4 1,1 1,5 Methicillin resistant S epidermidis 0,4 1,5 1,8 Methicillin supceptible S epidermidis 0,4 0,7 1,1 E coli 12 4,4 2,2 18 6,6 K pneumoniae 15 5,5 16 5,9 31 11,4 P aeruginosa 3,0 3,3 17 6,3 A baumannii 17 6,3 12 4,4 29 10,7 M pneumoniae 0,7 0,7 1,5 C pneumoniae 0,4 0,4 L pneumophila 0,4 0,4 0,7 Dương tính 183 67,5 118 43,5 Tổng số ca 271 Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh phát (dương tính) 67,5% chiếm tỷ lệ cao S pneumoniae (23,6%), H influenza (15,5%) Trong nhóm vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn K pneumoniae chiếm tỷ lệ cao 5,5%, E coli chiếm tỷ lệ 4,4% Nghiên cứu Y học khuẩn khơng điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,4 – 0,7% Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp 43,5%, vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao S pneumoniae với 10,7%, K pneumoniae với tỷ lệ 5,9%, H influenza 4,8%, A baumannii 4,4% Nhóm Staphylococci nhóm vi khuẩn khơng điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,7 – 2,6% Trong nhóm vi khuẩn khơng đường ruột, vi khuẩn A baumannii chiếm tỷ lệ cao 6,3%, P aeruginosa với tỷ lệ 3,0% Nhóm vi Bảng 2: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân đơn viêm phổi cộng đồng phát kỹ thuật multiplex realtime PCR Tác nhân Chính Phối hợp Tổng N % N % N % S pneumoniae 32 22,1 6,2 41 28,3 H influenza 20 13,8 4,8 27 18,6 0,7 0,7 M catarrahlis 2,8 2,8 Streptococci nhóm A 0,7 0,7 Streptococci nhóm B 0,7 0,7 1,4 Stresptococcus faecalis 1,4 2,1 3,4 3,4 3,4 H influenza B Stresptococcus faecium Methicillin resistant Staphylococci 0,7 0,7 Methicillin resistant S aureus 0,7 1,4 2,1 Methicillin supceptible S aureus 0,7 1,4 2,1 Methicillin resistant S epidermidis 0,7 2,1 2,8 Methicillin supceptible S epidermidis 0,7 0,7 1,4 E coli 4,1 3,4 11 7,6 K pneumoniae 11 7,6 10 6,9 21 14,5 P aeruginosa 2,8 2,8 5,5 A baumannii 5,5 4,8 15 10,3 M pneumoniae 1,4 0,7 2,1 C pneumoniae 0,7 0,7 0,1 L pneumophila Dương tính 97 Tổng 145 Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh phát (dương tính) 66,9% chiếm tỷ lệ cao S pneumoniae (22,1%), H influenza (13,8%) Trong nhóm vi khuẩn đường ruột K pneumoniae chiếm tỷ lệ cao 7,6%, E coli chiếm tỷ lệ 4,1% Trong nhóm vi khuẩn khơng đường ruột A baumannii chiếm tỷ lệ cao 5,5%, P aeruginosa chiếm tỷ lệ 2,8% Nhóm vi Chuyên Đề Nội Khoa 66,9 0,7 62 42,8 khuẩn chiếm tỷ lệ thấp nhóm Staphylococci nhóm vi khuẩn khơng điển hình với tỷ lệ 0,7 – 1,4% Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp 42,8%, vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao K pneumoniae với 6,9%, S pneumoniae với tỷ lệ 6,2%, H influenza 4,8% A baumannii tỷ lệ 4,8% Nhóm Staphylococci nhóm vi khuẩn khơng điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,7 – 1,4% 69 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Bảng 3: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân COPD viêm phổi cộng đồng phát kỹ thuật multiplex real-time PCR Tác nhân Chính Phối hợp Tổng N % N % N % S pneumoniae 32 25,4 20 15,9 52 41,3 H influenza 22 17,5 4,8 28 22,2 1,6 1,6 2,4 0,8 3,2 0,8 0,8 1,6 Stresptococcus Faecium 2,4 2,4 Methicillin resistant Staphylococci 0,8 H influenza B M catarrahlis Streptococci nhóm A Streptococci nhóm B Stresptococcus Faecalis 0,8 Methicillin resistant S aureus 4,0 4,0 Methicillin supceptible S aureus 0,8 0,8 Methicillin resistant S epidermidis 0,8 0,8 Methicillin supceptible S epidermidis 0,8 0,8 E coli 4,8 0,8 5,6 K pneumoniae 3,2 4,8 10 7,9 P aeruginosa 3,2 4,0 7,1 A baumannii 7,1 4,0 14 11,1 0,8 0,8 0,8 M pneumoniae C pneumoniae L pneumophila 0,8 Dương tính 86 68,2 Tổng 126 56 44,4 Tỷ lệ vi khuẩn gây bệnh phát (dương tính) 68,2% chiếm tỷ lệ cao S pneumoniae (25,4%), H influenza (17,5%) Trong nhóm vi khuẩn đường ruột, E coli chiếm tỷ lệ cao 4,8%, K pneumoniae với tỷ lệ 3,2% Trong nhóm vi khuẩn không đường ruột, vi khuẩn A baumannii chiếm tỷ lệ cao 7,1%, P.aeruginosa với tỷ lệ 3,2% Nhóm vi khuẩn khơng điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,8% Tỷ lệ vi khuẩn phát (dương tính) 56,1% Nếu khơng kể nhóm S viridans vi khuẩn thường trú hầu họng tỷ lệ dương tính 44,3% (120/271), vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao K pneumoniae (12,2%), P aeruginosa (9,6%), A baumannii (7,7%) Các vi khuẩn H influenza, vi khuẩn Gram âm khác nhóm Staphylococci chiếm tỷ lệ thấp Khơng có trường hợp phát vi khuẩn khơng điển hình (Bảng 4) Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp 44,4%, vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao S pneumoniae với tỷ lệ 15,9%, K pneumoniae H influenza tỷ lệ 4,8% Vi khuẩn E coli nhóm vi khuẩn khơng điển hình chiếm tỷ lệ thấp 0,8% Tỷ lệ vi khuẩn phát phù hợp phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật real time PCR có 23,7% (36/152) Nếu khơng kể nhóm S viridans vi khuẩn thường trú hầu họng tỷ lệ phù hợp 30% (36/120) (Bảng 5) 70 Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 4: Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng phát kỹ thuật nuôi cấy truyền thống CAP Tác nhân N CAP/COPD % H.influenza H.parainfluenza 1,4 Tổng N % N % 2,4 1,1 4,8 2,9 0,4 7,1 32 11,8 1,1 M.catarrahlis 0,7 Nhóm Streptococcus.viridans 23 15,8 Staphylococcus aureus 2,1 Staphylococcus epidermidis 0,7 0,4 E coli 10 6,9 3,2 14 5,2 K pneumoniae 23 15,8 10 7,9 33 12,2 P aeruginosa 11 7,6 15 11,9 26 9,6 A baumannii 11 7,6 10 7,9 21 7,7 E aerogenes 0,7 0,8 0,7 E cloacae 1,4 0,7 Gram negative rods khác 0,7 4,0 2,2 Dương tính 89 61,4 63 50,0 152 56,1 Tổng 145 126 271 Bảng 5: Số trường hợp tỷ lệ vi khuẩn phát phù hợp phương pháp nuôi cấy truyền thống real-time PCR lệ phát vi khuẩn gây bệnh kỹ thuật real time PCR hai nhóm bệnh nhân khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05) Phù hợp kết PCR N % 100 Kết nuôi cấy theo phương pháp truyền thống cho thấy tỷ lệ dương tính 56,1%, tỷ lệ dương tính bệnh nhân CAP 61,4% (89/145) bệnh nhân CAP/COPD 50% (63/126) Sự khác biệt tỷ lệ phát vi khuẩn gây bệnh phương pháp ni cấy truyền thống hai nhóm bệnh nhân có ý nghĩa thống kê với P0,05) Kết phát vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân CAP CAP/COPD phương pháp nuôi cấy truyền thống số tác giả nước cho thấy tỷ lệ dương tính thay đổi từ 48 – 58%(5,8,14,15) nghĩa tương đương với kết nghiên cứu Nhưng so sánh tỷ lệ dương tính nghiên cứu 71 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 kỹ thuật real time PCR (67,5%) phương pháp nuôi cấy truyền thống (44,3% không kể nhóm S viridans) cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê (P