điều tra hiện trạng canh tác và xác định nguyên nhân gây bệnh vàng đầu trên cam rành tại xã đông phước, huyện châu thành, tỉnh hậu giang bằng kỹ thuật elisa và pcr

Cùng với việc tăng diện tích cây trồng, nhiều yếu tố bất lợi xuất hiện như thiếu nguồn cung cấp cây giống chất lượng và sạch bệnh, giá cả bấp bênh, sâu bệnh hại bùng phát Đ c biệt, bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

H N NG NGHI SINH HỌC NG D NG

TRẦN THỊ TH NH NH

ĐI U TR HI N TRẠNG C NH T C V

C ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY B NH

V NG ĐẦU TRÊN C S NH TẠI XÃ

Đ NG HƯỚC, HUY N CHÂU TH NH, TỈNH H U GI NG BẰNG Ỹ THU T

ELISA VÀ PCR

LU N VĂN TỐT NGHI ĐẠI HỌC

2015

C ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY B NH

V NG ĐẦU TRÊN C S NH TẠI XÃ

Đ NG HƯỚC, HUY N CHÂU TH NH, TỈNH H U GI NG BẰNG Ỹ THU T

Do sinh viên Trần Thị Th nh Nh (MSSV: 3113462) thực hiện

Kính trình hội đồng chấp nhận luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng …… năm 2015

C n bộ hướng dẫn

ThS L hướ Th nh

LỜI CẢ TẠ

Kính dâng cha mẹ người đã dạy dỗ và chăm sóc con trưởng thành trong suốt thời gian qua, giúp con vượt qua rất nhiều khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu cùng với công lao nuôi dưỡng to lớn, con xin ghi nhớ công

Tôi xin gửi lời cảm n đến thầy cố vấn học tập Nguy n Chí Cư ng cùng quý thầy cô trong Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Th - những người đã trực tiếp giảng dạy, trang b nhiều kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học đại học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám n chân thành đến anh Trần Văn Bé Năm (Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần

Th ), anh Trần Hồng Đức (Phòng Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang), anh Lâm Văn Mal (Trạm Bảo Vệ Thực Vật huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang), các bạn Hu nh Thành Đạt, Hu nh Hữu Lý, Nguy n Trọng Tuấn và các bạn trong phòng thí nghiệm C-102 (Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Th ) đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn và các bạn thuộc lớp Bảo Vệ Thực Vật khoá 37 đã nhiệt tình giúp đỡ và trao đổi những kiến thức cùng tôi trong suốt thời gian học tập

Trần Thị Th nh Nh

Năm 2004-2008: Họ t i trường Trung họ Cơ sở Bình ỹ

Năm 2008-2011: Họ t i trường Trung họ hổ thông Bình ỹ Năm 2011-2015: Họ ng nh Bảo V Thự V t, kho 37, t i trường

Đ i họ Cần Thơ

Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2015

Trần Thị Th nh Nh

LỜI C Đ N

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất k luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Trần Thị Th nh Nh

Trần Th Thanh Nhã, 2014 “Điều tra hiện trạng canh tác và xác đ nh nguyên nhân gây bệnh “vàng đầu trên cam Sành tại xã Đông Phước, huyện Châu

Thành, t nh Hậu Giang b ng k thuật ELIS và PCR Luận văn Đại học

ngành Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Th Cán bộ hướng dẫn: ThS Lê Phước Thạnh

T LƢ C

Cam Sành là một trong các loại cây ăn trái có giá tr kinh tế, dinh dưỡng cao và rất được ưa chuộng, vì thế diện tích trồng cam ngày một tăng cao Tuy nhiên, cùng với việc gia tăng diện tích cây trồng, nhiều yếu tố bất lợi xuất hiện như dinh dưỡng không cân đối, sâu hại bùng phát Đ c biệt, bệnh “vàng đầu đã và đang tăng diện tích thiệt hại trong thời gian gần đây Nh m điều tra hiện trạng canh tác và xác đ nh các yếu tố ảnh hưởng đến bệnh “vàng đầu trên các vườn cam Sành tại huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang, đề tài được thực hiện ngẫu nhiên tại 31 vườn trồng cam Sành trên đ a bàn tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang, bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng và phòng sinh học phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát triển công nghệ sinh học, t tháng 3/2014 đến 12/2014 Kết quả ghi nhận:

Về hiện trạng canh tác: Liếp trồng mới được lên liếp 2 - 5 năm (55,5%) với kiểu lên liếp thông thường (77,4%), pH m t liếp thấp < 5 (80,6%); đa phần (67,7%) nông dân sử dụng giống trôi nổi với 100% cây tháp mắt, gốc tháp được sử dụng phổ biến là chanh (41,9%); nông dân trồng dày h n khuyến cáo

1000 cây/ha (93,5%); lượng phân bón N-P-K nông dân sử dụng đa số đều cao h n so với khuyến cáo; phần lớn nông dân không bón vôi vào đất (74,2%)

Về d ch hại: Sâu v bùa (54,8%), rầy chổng cánh 29%; bệnh thối r (59,4%), bệnh gây hại chính trên cam Sành là bệnh “vàng đầu (77,4%); trong

số các mẫu đem phân tích có 100% mẫu vius gây bệnh tristeza, 77,4% mẫu có chứa vi khuẩn gây bệnh greening

Bệnh “vàng đầu có thể do tác cộng hợp hai loại bệnh tristeza và greening kết hợp với các yếu tố khác

C L C

T M LƯ C v

M C L C vi

DANH SÁCH BẢNG ix

D NH SÁCH H NH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 2

LƯ C KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Đ C ĐI M KHU VỰC ĐI U TR 2

1.2 SƠ LƯ C C Y C M QU T (C Y C M I) 2

1.2.1 Nguồn gốc, phân bố và phân loại cam quít 2

1.2.2 Một số đ c tính sinh học của cây cam quít 3

1.2.2.1 Rễ 3

1.2.2.2 Thân, cành 3

1.2.2.3 Lá 3

1.2.3 Yêu cầu sinh thái 4

1.2.3.1 Nhiệt độ 4

1.2.3.2 Ánh sáng 4

1.2.3.3 t đ i 4

1.2.4 Một số vấn đề cần lưu ý trong canh tác cam quít 4

1.2.4.1 o 4

1.2.4.2 Liếp 4

1.2.4.3 C y h n gi và y h mát 5

1.2.4.4 tr ng 5

1.2.4.5 ho ng á h tr ng 5

1.2.4.6 T o tán t ành 5

1.2.4.7 i iếp 5

1.2.4 n ph n 5

1.3 MỘT SỐ DỊCH HẠI TRÊN C M SÀNH 6

1.3.1 Côn trùng 6

1.3.1.1 Rầy hổng ánh Di phorin itri Kwayama (Psyllidae, Homoptera) 6

1.3.1.2 Rầy mềm (Aphididae, Homoptera) 7

1.3.1.3 Cá s u h i há 7

1.3.2 Bệnh hại 8

1.3.2.1 Vàng lá th i rễ 8

1.3.2.2 ệnh th i g , h y mủ 8

1.3.2.3 ệnh vàng á gr ning (Hu ng ong in) 9

1.3.2.4 ệnh tristeza 13

1.3.2.5 Cá ệnh h i há 14

1.4 K THUẬT ELIS 14

1.4.1 Đ nh ngh a k thuật ELIS 14

1.4.2 Các k thuật ELIS 14

1.5 K THUẬT ELIS 16

CHƯƠNG 2 17

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 PHƯƠNG TIỆN 17

2.2.1 Thời gian và đ a điểm 17

2.2.2 Dụng cụ 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP 17

2.2.1 Điều tra nông hộ 17

2.2.1.1 iều tr 17

2.2.1.2 Xá định sâu ệnh h i trên vư n 19

2.2.2 Phân tích trong phòng thí nghiệm 19

2.2.2.1 o pH 19

2.2.2.2 Trích DN lá và thực hiện PCR để xác đ nh sự hiện diện vi khuẩn gây bệnh greening trên các vườn cam Sành 19

2.2.3 Kiểm tra bệnh Tristeza 21

2.2.4 Phân tích kết quả điều tra 22

CHƯƠNG 3 23

K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 T NH H NH CHUNG V KHU VỰC ĐI U TR 23

3.2 HIỆN TRẠNG C NH TÁC C M SÀNH 24

3.2.1 Đất trồng 24

3.2.1.1 Liếp tr ng 24

3.2.1.2 i u ên iếp 24

3.2.1.3 ương 25

3.2.1.4 Chiều rộng iếp 25

3.2.1.5 o 26

3.2.1.6 pH đ t 26

3.2.2 Giống trồng 27

3.2.2.1 Cá h nh n gi ng 27

3.2.2.2 Ngu n g y gi ng 28

3.2.2.3 Tuổi y 28

3.2.2.4 t độ tr ng 29

3.2.3 K thuật canh tác 30

3.2.3.1 u n nư 30

3.2.3.2 i iếp 31

3.2.3.3 h n n 31

3.2.3.4 C n tr ng 38

3.2.3.5 ệnh h i 39

3.1 K T QUẢ KI M TR BỆNH VÀNG ĐẦU B NG K THUẬT ELIS VÀ PCR 42

CHƯƠNG 4 46

K T LUẬN VÀ Đ NGHỊ 46

4.1 K T LUẬN 46

4.1.1 Hiện trạng canh tác 46

4.1.2 D ch hại 46

4.1 Đ NGHỊ 46

TÀI LIỆU TH M KHẢO

PH CHƯƠNG

D NH S CH BẢNG

Bảng 1.1: Số liệu diện tích cam Sành, bưởi và chanh không hạt tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang t năm 2005 - 2013 2

Bảng 1.2: Lượng phân bón cho cam ở các lứa tuổi khác nhau 6

Bảng 1.3: Công thức phân bón theo khuyến cáo Trường Đại học Cần Th 6Bảng 1.4: Kinh nghiệm quản lý bệnh HLB tại Nam Phi, có kết hợp xử lý thuốc hóa học để hạn chế mật số rầy 12Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng PCR 20Bảng 3.1: Một số thông tin chung về các hộ trồng cam Sành tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, Hậu Giang 23

Bảng 3.2: T lệ côn trùng gây hại và không gây hại, số hộ phun thuốc và

không phun thuốc tr sâu, số lần phun thuốc trên các vườn 39Bảng 3.3: Mức độ gây hại của các bệnh hại chính trên các vườn cam Sành tại

xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 41Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra bệnh trên mẫu lá cam Sành b ng ELISA và PCR 42

D NH S CH H NH

Hình 1.1: Một số triệu chứng vàng lá greening trên lá và trái 10

Hình 1.2: Nguyên tắc kiểm tra mẫu bệnh b ng que thử 15

Hình 2.1: Đ a điểm các hộ điều tra tại hai ấp Đông Lợi và Đông Lợi B, xã Đông Phước, huyện Châu Thành, Hậu Giang 19Hình 2.2: Các kết quả có thể có khi kiểm tra mẫu bệnh Tristeza trên lá cam Sành b ng que thử nhanh 22

Hình 3.1: T lệ (%) các tuổi liếp trồng cam Sành tại xã Đông Phước, huyện

Châu Thành, t nh Hậu Giang 24

Hình 3.2: T lệ (%) các kiểu lên liếp trồng cam Sành tại xã Đông Phước,

huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 24

Hình 3.3: T lệ (%) kích thước mư ng trồng cam Sành tại xã Đông Phước,

huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 25

Hình 3.4: T lệ (%)kích thước liếp vườn trồng cam Sành tại xã Đông Phước,

huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 25

Hình 3.5: T lệ (%) các hộ có thiết kế bờ bao xung quanh vườn trồng cam

Sành tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 26

Hình 3.6: T lệ (%) giá tr pH đất trên vườn trồng cam Sành tại xã Đông

Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 27

Hình 3.7: T lệ (%) các gốc gh p được sử dụng trên các vườn cam quít tại xã

Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 27

Hình 3.8: T lệ (%) nguồn cây giống được trồng tại xã Đông Phước, huyện

Châu Thành, t nh Hậu Giang 28

Hình 3.9: T lệ (%) tuổi cây cam Sành được trồng tại xã Đông Phước, huyện

Châu Thành, t nh Hậu Giang 29

Hình 3.10: T lệ (%) mật độ trồng cam tại xã Đông Phước, huyện Châu

Thành, t nh Hậu Giang 30

Hình 3.11: T lệ (%) các vườn giữ mực nước cách m t liếp cam Sành tại xã

Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 31Hình 3.12: T lệ (%) hộ có số lần bồi liếp khác nhau trong vườn cam Sành tại

xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 31

Hình 3.13: Phần trăm hộ có chiều dày bồi liếp khác nhau trong vườn cam

Sành xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 32

Hình 3.14: T lệ (%) lượng phân đạm được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 1 - 3 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 33

Hình 3.15: T lệ (%) lượng phân đạm được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 4 - 6 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 33

Hình 3.16: T lệ (%) lượng phân đạm được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 7 - 10 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 34

Hình 3.17: P T lệ (%) lượng phân lân được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 1 - 3 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 35

Hình 3.18: T lệ (%) lượng phân lân được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 4 - 6 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 35

Hình 3.19: T lệ (%) lượng phân lân được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 7 - 10 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 36

Hình 3.20: T lệ (%) lượng phân kali được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 1 - 3 năm tuổi xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 36

Hình 3.21: T lệ (%) lượng phân kali được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 4 - 6 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 37

Hình 3.22: T lệ (%) lượng phân kali được sử dụng trên vườn cam Sành giai

đoạn cây 7 - 10 năm tuổi tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 37

Hình 3.23: Thành phần và t lệ (%) côn trùng gây hại trên vườn cam Sành tại

tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 39

Hình 3.24: Phần trăm vườn có bệnh trong đất khác nhau xã Đông Phước,

huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 40

Hình 3.25: Phần trăm các bệnh gây hại trên các vườn cam Sành tại xã Đông

Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 41

Hình 3.26: Sử dụng c p mồi OI1 (mồi xuôi)/OI2c (mồi ngược) (thiết kế t

đoạn DN tổng hợp RN ribosome đ n v 16S) trong PCR để kiểm tra bệnh greening (HLB, Huanglongbin) trên cam Sành tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 43Hình 3.27: Kết quả kiểm tra bệnh tristeza trên các mẫu lá cam Sành b bệnh vàng đầu được thu xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 43Hình 3.28: Hình thể hiện triệu chứng bênh “vàng đầu và greening trên cùng một cây trong vườn xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang 44

Ở ĐẦU

Cam quít (Citrus spp.) là một trong các loại cây ăn trái có giá tr kinh tế

và dinh dưỡng cao (cung cấp nhiều vitamin C, khoáng chất ), rất được ưa

chuộng trên thế giới và tại Việt Nam (Hu nh Trí Đức và ctv., 2006) Tại Việt

Nam, bưởi, cam và quít là một trong 12 loại cây ăn trái đ c sản được chính phủ qui hoạch đến 2020 tại Việt Nam với diện tích 60.000 ha (trong tổng số 257.000 ha cây ăn trái của cả nước), cao nhất so với trong các loại cây ăn trái khác (Viện Khoa học K thuật Nông nghiệp miền Nam, 2013)

Việc canh tác cây cam quít thường g p nhiều trở ngại do các yếu tố đất

đai, dinh dưỡng và đ c biệt là sâu bệnh hại (Hu nh Trí Đức và ctv., 2006) Các

bệnh quan trọng trên cam quít, như greening (huanglongbin), thối r và tristeza, đã và đang phá hủy hàng trăm triệu cây cam quít trên thế giới và Việt

Nam (Timmer et al., 2003; Nguy n Th Ngọc Trúc và Nguy n Bảo Vệ, 2005;

Hu nh Trí Đức và ctv., 2006; Bové, 2006; Nguy n Văn Hòa và ctv., 2012)

Kết quả điều tra của Nguy n Th Ngọc Trúc và Nguy n Bảo Vệ (2005) cho thấy bệnh greening gây thiệt hại khoảng 50% vườn trồng cam quít tại Cần

Th Bên cạnh đó, bệnh vàng lá thối r do nấm Fusarium solani đã và đang là

d ch hại quan trọng trên nhiều vườn trồng cam quít tại vùng đồng b ng sông Cửu Long (Phạm Văn Kim, 2005)

Huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang có diện tích trồng cam Sành khoảng 4.711 ha (năm 2013), chiếm 69,1% diện tích trồng cam quít (cam Sành, bưởi, chanh không hạt, quít ) của huyện, tăng 12 lần so với năm 2005 (Phòng Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn huyện Châu Thành, Hậu Giang, 2014) Cùng với việc tăng diện tích cây trồng, nhiều yếu tố bất lợi xuất hiện như thiếu nguồn cung cấp cây giống chất lượng và sạch bệnh, giá cả bấp bênh, sâu bệnh hại bùng phát Đ c biệt, bệnh “vàng đầu hay “vàng lá ngọn trên nhánh đã

và đang tăng diện tích b thiệt hại trên các vườn cam Sành tại huyện trong thời gian gần đây Triệu chứng bệnh xuất hiện trên ngọn một vài nhánh của cây với các lá trên cùng chuyển vàng, các lá già bên dưới vẫn giữ màu xanh Các nguyên nhân gây bệnh (có thể do giống, dinh dưỡng, k thuật canh tác ) hiện đang được nghiên cứu và chưa có c sở để kết luận rõ ràng

Vì vậy, đề tài Đi u tr hi n tr ng nh t v x ịnh nguy n nh n

b nh v ng ầu tr n m S nh t i x Đông hướ , huy n Ch u Th nh, tỉnh H u Gi ng bằng kỹ thu t ELIS v CR được thực hiện nh m mục

tiêu xác đ nh các trở ngại chính trong canh tác và bước đầu sử dụng k thuật ELISA và PCR để xác đ nh nguyên nhân gây bệnh “vàng đầu trên cam Sành tại xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang

CHƯƠNG 1

LƯ C HẢ T I LI U

1.1 Đặ iểm khu vự i u tr

Huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang có diện tích tự nhiên khoảng 13.906

ha, trong đó đất nông nghiệp chiếm khoảng 10.000 ha (72%) Qua quá trình chuyển đổi c cấu cây trồng, hiện nay (2014), trên 90% đất nông nghiệp ở huyện được sử dụng để trồng cây ăn trái Cây cam quít (cam Sành, bưởi và chanh không hạt) chiếm t lệ lớn nhất (6.736 ha) và diện tích ngày càng tăng Cây cam Sành được trồng ở nhiều xã trong huyện và nhiều nhất ở xã Đông Phước (1.580 ha trong năm 2013) (Bảng 1.1) (Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn huyện Châu Thành, Hậu Giang, 2014)

Bảng 1.1: Số liệu diện tích cam Sành, bưởi và chanh không hạt tại xã Đông Phước và huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang t năm 2005 - 2013 (Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn huyện Châu Thành, Hậu Giang, 2014)

Năm

Huy n Ch u Th nh Đông hướ

(Cam Sành) (ha)

Cam Sành (ha)

Bưởi (ha)

(*) : Tính hung diện tí h ho m Sành và ưởi

1.2 Sơ lượ y cam quít (cây có múi)

Cam Sành có tên khoa học Citrus nobilis var typica Hassk còn được gọi

là quít vua (king mandarin), có nguồn gốc ở Việt Nam và được trồng ở hầu hết vùng trồng cây có múi như: Tam Bình, Trà Ôn (V nh Long); Cái Bè, Châu

Thành, Chợ Gạo (Tiền Giang); M Khánh, Ô Môn (Cần Th ) (Đường Hồng

Dật, 2000) Theo FAO (2004), cam Sành là giống lai giữa cam Mật (Citrus sinensis L Osbeck) và quít (Citrus reticulata Blanco)

1.2.2 ột số ặ tính sinh họ ủ y m quít

1.2.2.1 Rễ

R cam quít phát triển và phân bố tùy thuộc vào giống trồng (gốc tháp), tuổi cây, loại đất, chế độ thoát nước của đất và mùa vụ (Morgan, 2007; Noling, 2011) R cam quít thuộc loại r nấm Sự phát triển của r thường xen

k với sự phát triển của thân cành trên m t đất, ngh a là khi cây ra đọt non và hoa thì r s ra hạn chế và ngược lại R thường mọc cạn, đa số r hút dinh dưỡng phân bố gần lớp đất m t (lớp đất 0 - 30 cm), do đó việc giữ lớp đất m t

tư i xốp giúp cây hút được dinh dưỡng tốt h n (Nguy n Bảo Vệ và Lê Thanh Phong, 2004; Morgan, 2007; Noling, 2011)

Theo Trần Thế Tục và ctv (1998) r mọc ra t hột thường khỏe, mọc sâu

nếu đất t i xốp, thoát nước tốt và có đủ oxy r có thể mọc sâu trên 4 m Do đó,

ở đồng b ng sông Cửu Long (ĐBSCL), trên những vùng đất thấp, việc trồng cam quít b ng hột hay gốc tháp thường b ảnh hưởng bởi mực thủy cấp Khi liếp trồng b ngập thường xuyên hay thoát nước k m, r cam quít có khuynh hướng mọc ở tầng đất m t, không ăn xuống sâu, 75% r tập trung ở tầng 0 - 30

cm (Noling, 2011)

1.2.2.2 Thân, cành

Cây có múi thuộc dạng thân gỗ, loại hình bán bụi Cây trưởng thành có

t 4 - 6 cành (Trần Thế Tục và ctv., 1998) Cành có thể có gai, nhất là khi

trồng b ng hột, phát triển theo lối hợp trục, cành mọc dài đến một khoảng nhất

đ nh thì d ng lại, các mầm bên dưới đ nh sinh trưởng của ngọn cành s mọc

ra, các cành thứ cấp này cũng mọc dài đến một khoảng nhất đ nh thì ng ng và các mầm bên dưới đ nh sinh trưởng lại tiếp tục phát triển (Nguy n Bảo Vệ và

Lê Thanh Phong, 2004) Trong một năm cây có thể cho 3 - 4 đợt cành, tùy theo chức năng của cành trên cây, chúng ta có thể gọi như sau: cành cho trái,

cành mẹ, cành dinh dưỡng và cành vượt (Trần Thượng Tuấn và tv., 1994) 1.2.2.3 Lá

Nguy n Văn Kế (2003) lá cây có múi gồm một phiến lá hình elip với cuống lá có một eo lá hay còn gọi là cánh lá Phiến lá dày, có tuyến tinh dầu

đ c trưng cho mỗi loài, m t dưới lá có khoảng 500 khí khổng/mm2

Theo Nguy n Bảo Vệ và Lê Thanh Phong (2011), một cây có múi khỏe mạnh có 150.000 - 200.000 lá Để nuôi trái tốt, bưởi cần khoảng 60 lá/trái, chanh khoảng 20 lá/trái, cam, quít khoảng 50 lá/trái Do đó, việc duy trì bộ tán khỏe, nhiều lá s giúp trái đậu tốt

1.2.3 Y u ầu sinh th i

1.2.3.1 Nhiệt độ

Theo Nguy n Bảo Vệ và Lê Thanh Phong (2011), cam quít có thể sống

và phát triển trong khoảng nhiệt độ 13 - 38 oC, thích hợp nhất 23 - 29 oC Nhiệt độ cao, trái chín sớm, ít x và ngọt, nhưng khả năng bảo quản k m và màu sắc trái chín không đẹp

1.2.3.2 Ánh sáng

Cây có múi không thích ánh sáng trực xạ, ánh sáng lúc 8 giờ sáng ho c 4

- 5 giờ chiều là thích hợp Cường độ ánh sáng cao d làm nám trái, mất nước nhiều, sinh trưởng k m dẫn đến tuổi thọ ngắn Do đó, việc trồng xen tạo bóng râm s giúp cây có múi sinh trưởng tốt h n Bố trí liếp trồng theo hướng Đông Tây để bớt ánh sáng trực xạ (Nguy n Bảo Vệ và Lê Thanh Phong, 2004)

1.2.3.3 t đ i

Cam quít thích hợp trồng trên đất có tầng canh tác dầy, độ dày ít nhất 0,5

m, thoát thủy tốt vì cam quít có bộ r ăn cạn gần lớp đất m t và yếu Tốt nhất

là đất th t pha, thông thoáng, thoát nước tốt, màu mỡ Độ pH thích hợp cho cây có múi là 5,5 - 6,5 (Nguy n Bảo Vệ và Lê Thanh Phong, 2004) Nếu pH thấp h n 5 s gây ra tình trạng thiếu hụt canxi (Ca), lân (P) và manhê (Mg), r cây có thể b ngộ độc nhôm (Al) và mangan (Mn) (Chang and Bay - Petersen, 2003)

1.2.4 ột số vấn ần lưu ý trong nh t m quít

1.2.4.1 o

Ở ĐBSCL hàng năm thường có lũ bắt đầu t tháng 9 - 11 dư ng l ch nên

vườn cần xây dựng đê bao bảo vệ cây trồng Theo Trần Thượng Tuấn và tv

(1994), đê bao là n i xây dựng cống đầu mối để điều tiết nước, trồng các hàng cây chắn gió, hạn chế chiều cao của liếp Do đó yêu cầu m t đê phải rộng và

chắc

1.2.4.2 Liếp

Theo Trần Thượng Tuấn và ctv (1994), do đ c tính ở ĐBSCL thấp, đồng

thời h ng năm có lũ về vào tháng 8 - 11 dư ng l ch, nước t thượng nguồn đổ

về, vì vậy cần phải đào mư ng Nguy n Th Ngọc Ẩn (1998) cho r ng liếp trồng cam quít nếu là liếp đôi rộng 6 - 8 m, liếp đ n rộng 3 - 4 m, cách m t nước 30 - 50 cm

1.2.4.3 C y h n gi và y h mát

Theo Nguy n Danh Vàn (2006), cam quít thích hợp ánh sáng tán xạ, do

đó phải trồng một số cây cao, có tán lá thưa, thoáng như so đũa, cóc, mãng cầu, tràm dọc theo m p mư ng ho c giữa các hàng cam, quít Trồng cây

chắn gió quanh vườn hạn chế thiệt hại do mưa bão và giảm bớt sự xâm nhập của côn trùng, nấm bệnh t n i khác vào vườn, đ c biệt là những loài rầy mang mầm bệnh như rầy chổng cánh, rầy mềm

1.2.4.4 tr ng

Theo Lê Th Thu Hồng (2002) mô trồng cần phải chuẩn b trước ít nhất hai tuần Đất làm mô thường là đất m t ruộng ho c đất bãi bồi ven sông Mô cao 0,3 - 0,4 m, rộng 0,8 - 1 m, giữa mô đào một hố nhỏ, trộn 2 - 4 kg phân

chuồng, 1 kg phân lân và 0,5 kg vôi với đất

1.2.4.5 ho ng á h tr ng

Theo Trần Thế Tục và ctv (1998), tùy theo giống, đất đai, khí hậu

khoảng cách trồng có thể là 6 x 5 m, 6 x 4 m hay 5 x 4 m Nguy n Bảo Vệ và

Lê Thanh Phong (2011) cho r ng khoảng cách thích hợp cho cam Sành là 3 x

3 m Theo Nguy n Danh Vàn (2006), tùy theo tình hình đất đai tốt hay xấu mà trồng với khoảng cách 3 x 3 m ho c 3 x 4 m đối với cam Sành

1.2.4.6 T o tán t ành

Theo Nguy n Danh Vàn (2006) tạo tán là việc làm cần thiết nh m tạo cho cây có bộ khung c bản, vững chắc t đó phát triền các cành thứ cấp

H ng năm, sau khi thu hoạch cần t a bỏ bớt các cành già bên trong tán không

có khả năng cho trái, cành vượt, cành b sâu bệnh, cành mọc t gốc gh p, cành

và tv., 1998) và Bảng 1.3 (Trường Đại học Cần Th ; trích dẫn Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2006) Bón phân hóa học cân đối kết hợp với phân hữu c hoai mục mới cung cấp đủ các chất dinh dưỡng cho cây Bón phân không cân đối, không bón phân hữu c , ch bón phân đạm, bón ít ho c không bón phân kali

và lân, dẫn tới mất cân đối về dinh dưỡng và thiếu dinh dưỡng vi lượng làm khả năng đề kháng đối với sâu bệnh của cây giảm, nhiều bệnh hại xuất hiện (Phạm Văn Lầm, 2004)

Bảng 1.2: Lượng phân bón cho cam ở các lứa tuổi khác nhau (Trần Thế Tục

và ctv., 1998)

Tuổi y

(năm)

h n huồng (kg/cây)

1.3.1.1 Rầy hổng ánh Diaphorina citri Kwayama (Psyllidae, Homoptera)

Phân bố rộng, t bờ tây fghanistan đến Pakistan, Ấn Độ, Nepal, Bhutan, miền Đông Nam châu Á, miền Nam Trung Quốc, Đài Loan và Nhật Bản (Waterhouse, 1998) Rầy chổng cánh là tác nhân (vector) truyền vi khuẩn gây bệnh greening (huanglongbin) (Bové, 2006) Tuy nhiên, ch có thành trùng và ấu trùng tuổi 4 và 5 của rầy chổng cánh là có khả năng truyền bệnh (Bové, 2006; National Research Council, 2010)

Đ c điểm sinh học: Trứng màu vàng, hình quả lê, dài khoảng 0,3 mm, thường được đẻ thành t ng chùm ở nách lá ho c trên các chồi non Ấu trùng rất nhỏ, hình bầu dục dẹp, mới nở thường có màu vàng tư i, có màu lục ở tuổi

2, tuổi 3, màu nâu vàng ở tuổi 4, tuổi 5 Thành trùng có kích thước rất nhỏ, thân dài t 2,5 - 3,0 mm, nâu xám Khi đậu, phần bụng của thành trùng nhổng cao một gốc 30o

với bề m t n i đậu nên được gọi là rầy chổng cánh Cả ấu trùng lẫn thành trùng đều chích hút các đọt non, nhất là các loại cam, quít, chanh, cây nguyệt quới (Nguy n Th Thu Cúc, 2000)

Theo Nguy n Th Thu Cúc (2000), một số biện pháp có thể được áp dụng để phòng tr rầy chổng cánh như:

- Trồng cây sạch bệnh; loại bỏ những cây b bệnh ra khỏi vườn; t a cành

và bón phân thích hợp để điều khiển đọt non ra tập trung; trồng cây chắn gió

xung quanh vườn, không nên trồng các loại cây như Cần Thăng, Nguyệt Quới,

Kim Quít trong vườn; nuôi kiến vàng Oecophylla smaragdina

- Hạn chế sử dụng thuốc tr sâu nh m phát huy vai trò của thiên đ ch Sử dụng thuốc tr sâu có tính lưu dẫn ho c dầu khoáng ở nồng độ 0,5% để diệt rầy

- Dùng ong ký sinh Tetrasitrus radiatus lên rầy chổng cánh Diaphorina citri (Aubert and Quilici, 1984) ho c dùng nấm ký sinh Beauveria và Cephalosporium lacanii (Xie et al., 1988)

1.3.1.2 Rầy mềm (Aphididae, Homoptera)

Có bốn loài rầy mềm gây hại trên cây ăn trái có múi: Toxoptera citricida Kirkaldy, T aurantii Boyer de Fonscolombe, Aphis gossypii và A spiraecola

Theo Nguy n Th Thu Cúc (2000), rầy mềm có kích thước rất nhỏ, c thể thường rất mềm nên được gọi là rầy mềm, hình trái lê, màu nâu đen ho c nâu đỏ bóng Trên phần lưng của phía đuôi có mang một đôi ống bụng Ở ĐBSCL, ch ghi nhận chủ yếu con cái Rầy con có hình dạng rất giống trưởng thành Rầy mềm gây hại b ng cánh chích hút chồi non, tập trung chủ yếu ở

m t dưới lá, làm chồi biến dạng, lá cong queo, còi cọc Ngoài ra, rầy còn tiết

ra mật ngọt làm bồ hóng phát triển, ảnh hưởng đến sự quang hợp của cây Rầy mềm gây hại trên các vườn cam, chanh, quít còn t , là tác nhân truyền bệnh tristeza trên cam quít

Trong điều kiện tự nhiên, thành phần thiên đ ch của rầy mềm rất phong

phú, bao gồm rất nhiều loài ăn mồi như bọ rùa, ruồi, các loài Chrysops và ong

ký sinh khác nhau, các loài này khống chế đến 95% mật số rầy mềm Khi sử dụng thuốc để tr rầy không nên phun tràn lan trên vườn, ch phun trên cây và chủ yếu trên các chồi b nhi m (Nguy n Th Thu Cúc, 2000)

Cúc, 2000; Nguy n Th Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh, 2002)

1.3.2 B nh h i

1.3.2.1 Vàng á th i rễ

Bệnh do nấm Fusarium solani gây ra Bệnh vàng lá thối r là một trong

những bệnh quan trọng trên cây cam quít, nhất là trên cam Sành và quít Hồng tại vùng ĐBSCL Bệnh thường gây hại n ng trong mùa mưa lũ ho c sau khi siết

nước, gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngã màu vàng xanh và sau đó rụng đi, nhất là sau các c n gió lớn Bệnh thường biểu hiện trên lá già, triệu chứng bệnh trên lá rất giống với triệu chứng thiếu đạm (N) Lúc đầu ch có một vài cành b bệnh và biểu hiện sự rụng lá, sau đó toàn cây b rụng Phần r non tư ng ứng với các nhánh có lá vàng b thối, lõi r có màu nâu ho c đen (Nguy n Th Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh, 2002)

Điều kiện phát triển bệnh: Nấm F solani trực tiếp gây thối r cam quít,

nhưng ch tấn công khi r cam quít b tổn thư ng Một số yếu tố và điều kiện làm r cam quít b tổn thư ng như: đất b n n d , đất b oi nước lâu dài, đất canh tác b chua (pH < 5), tuyến trùng và rệp sáp tấn công r Kể t khi bắt đầu xâm nhập cho đến khi triệu chứng bệnh thể hiện cần có thời gian ủ bệnh vài tháng (Phạm Văn Kim, 2002)

Theo một số biện pháp được áp dụng để quản lý bệnh thối r trên cam quít như (Phạm Văn Kim, 2002; Nguy n Th Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh, 2002):

- Có hệ thống tưới và tiêu nước hoàn ch nh khi canh tác cây cam quít

- Sử dụng cây giống sạch bệnh, lên liếp cao, có rãnh thoát nước tốt

- Bổ sung hữu c hàng năm cho đất (có tưới bổ sung vi sinh vật đối

kháng như nấm Trichoderma spp., xạ khuẩn )

- Rải vôi bột hàng năm để giảm độ chua của đất

- Giữ cỏ trong vườn để đất không b n n dẻ

- Rải thuốc tr tuyến trùng và rệp sáp xung quanh r

1.3.2.2 ệnh th i g , h y mủ

Bệnh do nấm Phytophthora spp gây ra Bệnh phát sinh ở môi trường ẩm,

nhiệt độ cao, trồng dày, sự chống ch u của gốc gh p k m Vết bệnh lúc đầu sũng nước, sau đó khô, nứt bong ra dọc theo thân, thân b thối nâu, chảy nhựa Bệnh phát triển quanh thân chính và r cái, có thể lan lên các phần thân hay nhánh phía trên Bệnh cũng làm thối trái, vùng thối h i tròn, màu nâu tối lan rộng ra khắp trái (Nguy n Th Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh, 2002)

Theo Cục Bảo Vệ Thực Vật (2006), việc phòng tr bệnh gồm các biện pháp sau:

- Dùng gốc gh p kháng bệnh như cam chua, cam 3 lá

- Đất trồng phải thoát thủy tốt; không nên phủ cỏ sát gốc vào mùa mưa

- Dùng thuốc tr nấm phết vào vết bệnh 2 lần/năm vào đầu và cuối mùa mưa

1.3.2.3 ệnh vàng lá greening (Huanglongbin)

Bệnh do vi khuẩn Candidatus Liberibacter spp sống ký sinh bắt buộc

trong mạch libe của cây gây ra Đây được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên các vùng trồng cam quít trên thế giới Bệnh lúc đầu có nhiều tên gọi

khác nhau, tên greening xuất phát t châu Phi do cây cam quít b nhi m bệnh

có trái chín bất thường Thông thường, trái cam quít trên cây khỏe chín (vỏ quả chuyển màu) bắt đầu t đít trái, sau đó đến cuống trái; nhưng đối với cây

b nhi m bệnh greening có quá trình chín khác hẳn, cuống trái chuyển màu (chín) trước, trong khi đít trái vẫn còn giữ màu xanh (nên được gọi là greening) Hiện nay tên chính thức của vàng lá greening là huanglongbing (HLB, bệnh vàng chồi; huang: vàng (yellow), long: chồi (shoot; không phải con rồng (dragon) như một số tài liệu đề cập), bing: bệnh (disease)) (Bové, 2006; National Research Council, 2010) Tuy nhiên tên gọi bệnh vàng lá greening vẫn còn được sử dụng rộng rãi trên thế giới (National Research Council, 2010)

Có ba loài (dạng) vi khuẩn gây bệnh vàng lá greening trên các cây cam

quít gồm Candidatus Liberibacter asiaticus (hiện diện chủ yếu ở các vùng trồng cam quít ở Châu Á và t lệ thấp h n ở M và Brazil) và Candidatus

Liberibacter americanus (ở Brazil) (hai loài này được truyền bởi vật mang

(vector) là rầy D citri); Candidatus Liberibacter africanus (ở Châu Phi, được truyền bởi rầy Trioza erytreae) (Bové, 2006)

Bệnh được lan truyền chủ yếu qua hai loài rầy D citri và T erytreae; qua

nhân giống b ng chiết và tháp Bệnh chưa được ghi nhận lây lan một cách rõ ràng qua dụng cụ cắt t a và qua hạt (National Research Council, 2010) Thường lây lan qua rầy chủ yếu ở khoảng cách ngắn (giữa các cây, giữa các vườn kế cận nhau ) và bệnh lây lan ở khoảng cách xa chủ yếu qua con đường vận chuyển giống t vùng/quốc gia/khu vực này tới vùng/quốc gia/khu vực khác (Bové, 2006; National Research Council, 2010)

Cây trồng sau khi nhi m bệnh thường có thời gian ủ bệnh t 6 tháng đến khoảng 2,5 năm (Bov , 2006; Quarles, 2013) Nếu cây nhỏ, triệu chứng bệnh

có thể biểu hiện sớm h n (Quarles, 2013) Trong thời gian ủ bệnh, cây trồng không có bất k triệu chứng nào thể hiện ra ngoài Do đó gây rất nhiều khó khăn trong công tác phòng tr bệnh hại (Bové, 2006) Triệu chứng bệnh thường biểu hiện rõ nhất sau 3 - 5 năm trồng Bệnh làm rụng trái, dẫn đến thất thu năng suất t 30 - 100% (Quarles, 2013) Kết quả nghiên cứu của Nguy n Th Ngọc Trúc và Nguy n Bảo Vệ (2005) cho thấy, một số yếu

tố có ảnh hưởng quan trọng đến sự bộc phát bệnh vàng lá greening trên cam quít tại đồng b ng sông Cửu Long như: Phư ng pháp nhân giống (chiết, tháp), nguồn gốc cây giống (cây sạch/không sạch bệnh), quản lý rầy chổng cánh, loại bỏ mầm bệnh, bón phân (chứa Zn và Mn) và sự hiểu biết về bệnh hại của người trồng

* Chẩn o n b nh h i

Triệu chứng bệnh thay đổi tùy theo tuổi cây, giống cây, tình trạng dinh dưỡng của cây và mức độ bệnh Đồng thời triệu chứng bệnh có thể giống với một số bệnh hại khác ho c do cây b thiếu dinh dưỡng (Bové, 2006; National

Research Council, 2010)

 Quan sát các tri u hứng

Một số triệu chứng (Bové, 2006; National Research Council, 2010; The Citrus Greening FAO TCP Project, 2012) có thể được sử dụng để phân biệt đối với các bệnh khác như :

- Trên cây: Xuất hiện ở bìa vườn hay rải rác một vài cây trong vườn; trên cây thường có một vài chồi (nhánh) ho c cả tán lá (nếu b n ng) b vàng, chết nhánh, trái rụng, cây b lùn

- Trên lá: Có các đốm vàng loang lỗ, bất cân xứng qua gân chính trên các già ho c lá non trên các nhánh (đây là triệu chứng điển hình nhất của bệnh vàng lá greening) (Hình 1.1); lá có thể giảm kích thước, mọc thẳng đứng, có triệu chứng giống thiếu k m (th t lá vàng, gân lá xanh); một số trường hợp có thể g p là gân chính của lá b sưng ho c chuyển vàng trong khi th t lá vẫn còn xanh

- Trên trái: Bên ngoài: Phát triển không đều, trái nhỏ, chín t cuống trái trước, có thể rụng trái; Bên trong: lệch tâm, hạt b thui (Hình 1.1), th t quả có

v đắng, có thể xuất hiện các đốm vàng bên dưới cuống trái

Hình 1.1: Một số triệu chứng vàng lá greening trên lá và trái (National Research Council, 2010)

 iểm tra bằng dung dị h iodine

Các lá cam quít nhi m bệnh vàng lá greening thường tích lũy tinh bột nhiều h n 6 lần so với các lá khỏe Đó là c sở để sử dụng dung d ch iodine 2% để kiểm tra các lá có b nhi m bệnh vàng lá greening hay không Tuy nhiên, phư ng pháp này có độ chính xác không cao Phư ng pháp có thể b ảnh hưởng bởi một số yếu tố như: Một số giống cam quít có khả năng tích lũy tinh bột cao h n các giống khác, cây trồng ngoài nắng có khả năng tích lũy tinh bột khác cây trồng ngoài trảng, thời gian trong ngày để lấy mẫu, tình trạng bệnh của cây Do đó muốn kiểm tra bệnh vàng lá greening, đ c biệt ở giai đoạn ủ bệnh, cần sử dụng phư ng pháp PCR để kiểm tra (National Research Council, 2010)

 iểm tra bằng phương pháp PCR (Polymerase chain reaction,

phản ứng huỗi trùng hợp)

Đây được xem là phư ng pháp chính xác nhất hiện nay để kiểm tra các cây trồng có nhi m bệnh vàng lá greening hay không Theo Bové (2006), sử dụng hai hệ thống PCR giúp phân biệt hai loài vi khuẩn gây bệnh vàng lá

greening (hoanglongbing) là Candidatus Liberibacter asiaticus (Châu Á) và Candidatus Liberibacter africanus (Châu Phi)

Hệ thống PCR thứ nhất dựa vào đoạn khuếch đại 1.160 bp (base pair, c p baz ) của 16S rRN (đoạn gene quy đ nh tổng hợp 16S RNA ribosome, S: hệ

số lắng Svedberg) b ng c p mồi IO1 (mồi xuôi) và IO2c (mồi ngược) ở vi

khuẩn Sản phẩm sau khi PCR xong s được cắt b ng enzyme cắt giới hạn Xba1 Đoạn DN của loài vi khuẩn t châu Á s b phân cắt ra hai đoạn có

kích thước lần lượt là 520 bp và 640 bp Trong khi đó đoạn DN t loài vi khuẩn t châu Phi s cho ra ba đoạn tư ng ứng là 520 bp, 506 bp và 130 bp

Hệ thống PCR thứ hai dựa vào trình tự khác của operon rpoBC ở hai loài Sử dụng c p mồi f-rpl 2 (mồi xuôi) và r-rplJ5 (mồi ngược), một đoạn DN 703 bp s được nhân lên ở loài Candidatus Liberibacter asiaticus và một đoạn DN 669 bp s được nhân lên ở loài Candidatus

rplKAJL-Liberibacter africanus

* Quản lý b nh h i

Bệnh hiện tại chưa có thuốc đ c tr hay giống kháng bệnh nên biện pháp quản lý bệnh hại chủ yếu là kiểm d ch, loại bỏ sớm các cây nhi m bệnh trên vườn, phòng tr rầy truyền bệnh và sử dụng giống sạch bệnh (Bové, 2006; National Research Council, 2010)

- Kiểm d ch: Ch áp dụng ở những khu vực chưa b nhi m bệnh Cần có biện pháp kiểm d ch ch t ch , nhanh chóng và chính xác Phư ng pháp PCR

có thể được sử dụng để thực hiện công việc này

- Loại bỏ các cây nhi m bệnh: Thăm vườn thường xuyên, loại bỏ các nhánh ho c cây bệnh Có thể tham khảo kinh nghiệm quản lý bệnh HLB ở Nam Phi (Bảng 1.4)

Bảng 1.4: Kinh nghiệm quản lý bệnh HLB tại Nam Phi, có kết hợp xử lý thuốc

hóa học để hạn chế mật số rầy (Davis et al., 2005)

- Quản lý rầy truyền bệnh: Có thể sử dụng thuốc hóa học ho c thiên đ ch

- Trồng cây sạch bệnh: Cây được nuôi cấy mô ho c nhân vô tính t nguồn cây sạch bệnh

- Bổ sung dinh dưỡng: Kết quả Một số nghiên cứu của Nguy n Minh Châu và Nguy n Bảo Vệ (2005) cho thấy bổ sung dinh dưỡng qua lá dưới dạng hỗn hợp dung d ch 2/3 ZnSO4 + 1/3MnSO4 ở nồng độ 5.000 ppm làm chậm sự xuất hiện triệu chứng bệnh reening trên lá non, nhưng triệu chứng bệnh cũng xuất hiện sau đó Kết quả tư ng tại Florida (M ) cho thấy việc bổ sung dinh dưỡng qua lá và bón vào đất có thể giúp cây b nhi m bệnh greening nhẹ cho năng suất ở mức chấp nhận (National Research Council, 2010) Tại Trung Quốc, việc phun qua lá, tiêm vào than và bón vào đất các dưỡng chất ZnSO4, CuSO4, H3BO3, CaSO4, FeSO4 và KH2PO4 đã không làm giảm bệnh

vàng lá greening so với đối chứng (Chen, 1943, trích dẫn của Xia et al., 2011)

Điều đó chứng tỏ việc bổ sung một số chất dinh dưỡng qua lá hay bón vào đất

có thể giúp cho cây duy trì được khả năng sản xuất ở một mức nào đó, tuy nhiên dinh dưỡng không giúp cây giảm mật số vi khuẩn gây bệnh Đồng thời, việc bổ sung dinh dưỡng có thể làm cho triệu chứng bệnh greening biểu hiện không rõ ràng khi quan sát ngoài đồng

1.3.2.3 ệnh tristeza

Bệnh do Citrus tristeza virus (CTV) gây ra và được lan truyền qua rầy mềm Toxoptera citricida, T aurantii citricidus, Aphis gossypii, A spiraecola

Rầy mềm T citricida được xem là loài truyền CTV hiệu quả cao nhất so với các loài còn lại, gấp khoảng 25 lần so với loài A gossypii (Atta et al., 2012)

CTV có nguồn gốc ở châu Á và lây lan đến nhiều nước trồng cam quít trên thế giới qua nguồn giống nhi m bệnh, sau đó lây lan bởi vector rầy mềm và gây

ra d ch bệnh trong thế k 20 Bệnh làm giảm năng suất và chất lượng cam quít

(Bar-Joseph et al., 1989; Garnsey et al., 1998; Lee and Bar-Joseph, 2000) Phần

lớn các cây có múi đều nhi m tristeza, giống cam ba lá và các dòng lai với cam

ba lá tư ng đối kháng với bệnh này (Sutic et al., 1999) Bệnh không truyền qua

c giới và hột nhưng truyền qua mắt gh p (Cambra et al., 2000)

Triệu chứng bệnh trên cây cam quít do CTV gây ra có thể khác nhau tùy dòng virus, giống cây và sự kết hợp giữa mắt tháp và gốc tháp Các dòng virus gây ra ba triệu chứng gồm: chết nhanh (quick decline hay tristeza); lõm thân (stem pitting); vàng cây con Cây trồng có thể b nhi m một dòng virus riêng

lẻ hay đồng thời nhiều dòng virus CTV ( tta et al., 2012)

- Bệnh chết nhanh: Bệnh thường xảy ra khi tháp cam ngọt (sweet orange), quít (mandarin, giống Satsuma và Ponkan), bưởi chùm (grapefruit) trên gốc tháp cam chua (sweet orange), bưởi (pummel) ho c chanh (lemon) Cây cam quít có thể b nhi m cả virus gây chết nhanh và virus gây bệnh vàng

lá cây con Virus gây bệnh chết nhanh thường phá hủy mạch libe chỗ tiếp giao giữa mắt tháp và gốc tháp, ho c ở gốc tháp, làm cho sản phẩm quang hợp không thể vận chuyển xuống gốc tháp Cây b suy kiệt rất nhanh và làm cho

cây chết rất nhanh ch sau vài năm trồng (Atta et al., 2012)

- Bệnh vàng cây con: Cây con nhi m bệnh trở nên vàng, chết nhanh, lùn

và đôi khi có thể làm cho cây chết đột ngột ( tta et al., 2012)

- Bệnh lõm thân: Dòng virus phá hủy hệ thống tổng hợp cellulose của cây, làm cho phần thân (dưới vỏ) b lõm vào Cây trồng có thể b nhi m cùng lúc với các dòng virus gây bệnh chết nhanh và vàng cây con

Một số biện pháp quản lý được đưa ra: Kiểm d ch cây trồng; trồng ho c dùng gốc gh p ch u được bệnh (cam 3 lá, Cleopatra ); dùng mắt gh p sạch bệnh; diệt các loài rầy mềm truyền bệnh, có thể phun ng a các đọt ra lá, chồi

non (Nguy n Th Ngọc Ẩn, 1998; Yokomi, 2009; Atta et al., 2012)

1.3.2.4 Cá ệnh h i há

Một số bệnh hại khác thường xuất hiện và gây hại trên các vườn cây cam

quít như: Bệnh lo t (do vi khuẩn Xanthomonas anoxopodis pv citri), bệnh ghẻ nhám/ghẻ lồi (do nấm Elsinoe fawcettii), bệnh đốm mỡ (do nấm Cercospora citri-grisea) (Nguy n Th Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh, 2002)

1.4 Kỹ thu t ELISA

1.4.1 Định nghĩ kỹ thu t ELISA

Phư ng pháp ELIS (Enzyme Linked Immunosorbent ssay - Xét nghiệm hấp thụ mi n d ch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đ c điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đ c hiệu giữa kháng nguyên (antigen, mầm bệnh) và kháng thể (antibody), trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm c chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme s thủy phân c chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đ c hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu (xem b ng mắt hay đọc b ng quang phổ kế) mà biết

được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện (Lima et al., 2012).

1.4.2 C kỹ thu t ELIS

K thuật ELIS khá nhạy và đ n giản, cho ph p ta xác đ nh kháng nguyên ho c kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Một số k thuật ELIS được sử dụng như: K thuật ELIS trực tiếp (còn gọi là k thuật ELIS hai lớp, Double ntibody Sandwich ELIS (D S-ELISA)); K thuật ELIS gián tiếp (còn gọi là k thuật ELIS có kháng nguyên gắn đ a, Plate-

Trapped Antigen ELISA (PTA-ELIS )) (Lima et al., 2012)

* iểm tr bằng que thử nh nh (l ter l flow te hnique/immunostrip)

Phư ng pháp này rất thuận tiện để kiểm tra nhanh mầm bệnh ngoài đồng

mà không cần các trang thiết b phức tạp, sau vài phút s có kết quả Que thử thường là một màng nitrocellulose được bao phủ bởi một đầu là vùng phóng thích kháng thể (release pad), một đầu là vùng hấp phụ (absorbent pad), xen giữa hai vùng này là vùng bắt kháng thể/kháng nguyên và hiện màu thông qua hai vạch đối chứng (control line) và vạch mẫu b nhi m bệnh (test line) (nếu có) (Dickinson, 2003)

 C bướ thự hi n (Hình 1.2)

Vùng phóng thích kháng thể của que thử được nhúng ngập trong dung

d ch mẫu thử đồng nhất Dung d ch mẫu thử s thấm lên màng nitrocellulose trên que, làm cho chất lỏng đi qua khu vực chứa kháng thể đ c trưng (kháng thể 1) cho mầm bệnh (kháng nguyên) đang được thử nghiệm Nếu đó là mầm bệnh hiện diện trong mẫu thì nó s liên kết với các kháng thể đ c trưng (kháng thể 1) đó, tạo thành phức hợp kháng thể 1 - mầm bệnh và tiếp tục di chuyển theo dòng chảy của chất lỏng lên vùng bắt kháng thể/kháng nguyên phía trên của que thử (Dickinson, 2003)

Trên vùng bắt kháng thể/kháng nguyên có hai khu vực là khu vực kiểm tra mẫu b nhi m bệnh (test line) n m phía dưới và khu vực đối chứng (control line) n m phía trên Test line cũng chứa các kháng thể đ c trưng (kháng thể 2) cho mầm bệnh đang được thử nghiệm Khi các phức hợp kháng thể 1 - mầm bệnh đi qua khu vực test line, các kháng thể (kháng thể 2) trên test line s liên

kết với phức hợp này tạo thành một phức hợp mới: kháng thể 1 - mầm bệnh - kháng thể 2; t đó dẫn đến hình thành một vạch ngang có thể nhìn thấy trên que thử, chứng tỏ r ng mầm bệnh hiện diện trong mẫu Những kháng thể (kháng thể 1) ở vùng phóng thích kháng thể không liên kết với mầm bệnh cũng trôi theo dòng chảy lên phía trên que thử Khi qua test line, do không có liên kết với mầm bệnh nên nó không b kháng thể 2 giữ lại Vì vậy nó s tiếp tục di chuyển lên control line nhờ dòng chảy của dung d ch mẫu Ở control line có chứa những kháng thể cố đ nh (kháng thể 3) được những kháng thể tự

do (kháng thể 1) trôi theo dòng chảy t vùng phóng thích kháng Như vậy những kháng thể 1 (ở vùng phóng thích kháng thể) s b giữ lại ở control line,

nó tạo ra một vạch ngang có thể nhìn thấy thứ hai và đảm bảo r ng các kháng thể trong dòng chảy đã đi qua cả ba điểm kiểm tra Mẫu được coi là dư ng tính khi que thử hiện lên hai vạch test line và control line Mẫu được coi là âm tính khi que thử hiện lên một vạch control line Trường hợp không có cả hai vạch ho c ch có một vạch test line ch ra r ng các thử nghiệm là không hợp lệ

và phải được l p đi l p lại (Dickinson, 2003)

Hình 1.2: Nguyên tắc kiểm tra mẫu bệnh b ng que thử (Dickinson, 2003)

1.5 ỹ thu t CR

PCR (Polymerase Chain Reaction, Phản ứng chuỗi trùng hợp/Phản ứng khuếch đại gene) là k thuật nhân bản một đoạn DN trong ống nghiệm dựa vào các chu k nhiệt (Phạm Hùng Vân, 2009)

* Nguy n tắ ủ PCR

K thuật PCR được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung d ch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng t 10 µl đến 50 µl với các thành phần chủ yếu là: (1) enzyme polymerase ch u nhiệt, thường được gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền được với nhiệt độ; (2) 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, và Cytosine (d TP, dTTP, dGTP, và dCTP); (3) DN chứa các đoạn DN đích s được nhân bản trong ống phản ứng; (4) các đoạn mồi (primer) xuôi (forward) và ngược (reverse) là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đ c hiệu với trình tự của 2 đầu đoạn

DN s được nhân bản; (5) ion Mg2+ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp, (6) dung d ch đệm Tris - KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu k nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler, máy PCR), chư ng trình nhiệt độ trong máy s làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu k , nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DN s xảy ra (Phạm Hùng Vân, 2009)

Về m t nguyên tắc, một chu k nhiệt độ s bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: (1) Đầu tiên nhiệt độ s được đưa lên 94 oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DN s b mất đi, nhờ vậy DN đích b biến tính thành các mạch đ n; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính (denaturation); (2) Kế đó nhiệt độ s được hạ đến 55 oC – 65 oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt c p bổ sung vào hai đầu của đoạn DN đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt c p (annealing); (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72 oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của

enzyme Taq polymerase để k o các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt

c p trên đầu 5’ của sợi DN đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung (extension/elongation) Như vậy, qua một chu k nhiệt, một DN đích

đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu k này được l p đi l p lại liên tục 30 đến 40 lần thì t một DN đích đã nhân bản được thành 230đến 240bản sao, tức là đến hàng t bản sao (Phạm Hùng Vân, 2009)

CHƯƠNG 2 HƯƠNG TI N V HƯƠNG H

2.1 hương ti n

2.1.1 Thời gi n v ị iểm

- Thời gian thực hiện: T tháng 4/2014 đến tháng 12/2014

- Đ a điểm điều tra: các vườn cam Sành của xã Đông Phước, huyện Châu Thành, t nh Hậu Giang

- Trích DN và chạy PCR kiểm tra bệnh Greening tại phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Th

- Kiểm tra bệnh Tristeza và đo pH đất tại phòng C - 102, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần

- Micropipet, microtube, máy ly tâm, máy hút chân không

- Dung d ch EB + SOµ SDS 10%, isopropanol, alcohol 70o, TE 1x, TE 0.1x, dung d ch CTAB, chlorofrom

- Xã Đông Phước (có diện tích trồng cam Sành tập trung lớn nhất huyện) được chọn để tiến hành điều tra

- Công việc điều tra được thực hiện ngẫu nhiên trên 31 hộ có diện tích trồng cam Sành ít nhất 1.500 m2

tại hai ấp Đông Lợi và Đông Lợi B (Hình 2.1)

- Tiến hành phỏng vấn chủ hộ theo phiếu điều tra soạn sẵn (Phụ chư ng)

và thu mẫu tại vườn

Hình 2.1: Đ a điểm các hộ điều tra tại hai ấp Đông Lợi và Đông Lợi B, xã Đông Phước, huyện Châu Thành, Hậu Giang (Ảnh được tạo t Google Earth, phiên bản 7.1.2.2041 (10/7/2013)).

Ấp Đông Lợi

Ấp Đông Lợi B

2.2.1.2 Xá định sâu ệnh h i trên vư n

* iểm tr s u, b nh h i vùng rễ

Dùng len đào kiểm tra vùng r trên các vườn cam quít (5 cây/vườn, 2 v trí/cây, cách mép tán vào trong thân cây 10 cm): ghi nhận t lệ r thối và sự hiện diện của rệp sáp (nếu có)

- Kiểm tra nhanh bệnh Greening trên lá b ng dung d ch iodine 2% và quan sát sự thay đổi hình dạng bên ngoài và bên trong trái (nếu có)

* Thu mẫu

- ẫu l : Thu 5 nhánh lá có biểu hiện bệnh “vàng đầu trên mỗi vườn,

trữ ở 4 oC Sau đó được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn greening và virus tristeza trong phòng thí nghiệm

- ẫu ất: Mẫu đất tại vùng r cây được lấy (tại v trí t m p tán vào

trong thân cây 10 cm): dùng len gạt bỏ 5 cm lớp đất m t, lấy một phần lớp đất

ở độ sâu t 5 - 20 cm (mẫu đất mỗi vườn là hỗn hợp của 10 mẫu đất được lấy

2.2.2.2 Trí h ADN á và thự hiện CR đ xá định sự hiện diện vi huẩn g y ệnh gr ning trên á vư n m Sành

* Ly trí h DN từ mẫu l

Thực hiện theo quy trình CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần

Th để xác đ nh t lệ greening trên các mẫu thu được Các bước ly trích ADN:

- Nghiền lá: Cắt lấy phần gân lá (2 lá); chia làm hai phần cho vào hai microtube 2,2 ml; sau đó một viên bi b ng inox vào mỗi microtube; ngâm mẫu trong nit lỏng 5 phút; tiến hành nghiền mẫu b ng máy nghiền Restch (Đức)

- Sau khi nghiền cho vào mỗi 1 ml dung d ch ly trích (EB, extract buffer) + 50 µl SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate)

- Ngâm ủ 65oC trong 30 phút

- Ly tâm mẫu ở 13.000 vòng/10 phút

- Lấy phần dung d ch phía trên (800 µl) sang microtube mới

- Cho tiếp 800 µl dung d ch isopropanol vào

- Ủ mẫu ở - 20 oC trong 2 giờ ho c h n

- Ly tâm mẫu sau khi ủ ở 12.000 vòng/10 phút, đổ bỏ nước, lấy phần c n

- Thêm 400 µl TE 1X (Tris EDTA) vào

- Thêm tiếp 400 µl CTAB, sau đó ủ hỗn hợp ở 65oC trong 15 phút

- Cho 800 µl chlorofrom vào hỗn hợp sau khi ủ, lắc nhẹ

- Ly tâm 13.000 vòng/10 phút

- Lấy phần trên (800 µl) sang microtube mới

- Cho 1,4 ml cồn 95o, lắc nhẹ, để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút

- Ly tâm 13.000 vòng/10 phút bỏ nước

- Cho 700 µl cồn 70º, lắc nhẹ, ly tâm 13.000 vòng/10 phút (l p lại 2 lần)

- Hút chân không mẫu 10 phút ở nhiệt độ 45oC

- Cho 200 µl TE 0.1X vào mẫu đã hút chân không, trữ ở -20oC

* Thự hi n PCR

 Hỗn hợp phản ứng CR

PCR được áp dụng theo quy trình của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Th với c p mồi IO1/IO2c để kiểm tra sản phẩm khuếch đại 1.160 bp (Bové, 2006) Các thành phần tham gia phản ứng gồm có (Bảng 2.1):

Mẫu cam Sành đối chứng dư ng (b bệnh) được cung cấp t Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Th ; mẫu cam Sành đối chứng âm (sạch bệnh) được thu t nhà lưới của Viện Nghiên cứu Cây ăn quả miền Nam

di được kiểm tra dưới đèn cực tím để kiểm tra băng sản phẩm, tư ng ứng với các mẫu lá cam Sành có b nhi m bệnh hay không

2.2.3 iểm tr b nh Tristeza

Kiểm tra bệnh Tristeza (Citrus tristeza virus, CTV) b ng bộ kit STX

78900 (do công ty gdia, M sản xuất) theo quy trình:

- Chọn bốn lá cam Sành có biểu hiện bệnh, lau sạch m t ngoài lá b ng dung d ch cồn 70o

- Cân 0,15 g mẫu lá t bốn lá v a được lau cồn 70o

- Dùng kẹp cho 0,15 g mẫu lá vào túi nghiền chứa sẵn 3 ml dung d ch đệm SBE1 (t lệ 1:20 theo trọng lượng mẫu: thể tích dung d ch đệm)

- Dùng cán kéo chà mạnh bên ngoài túi chứa mẫu cho đến khi mẫu lá được nghiền hoàn toàn và hòa tan vào dung d ch đệm

- Nhúng đầu que thử t v trí có ghi chữ “sample (“mẫu ) vào túi chứa

d ch trích (không nhúng đầu que thử sâu quá 0,5 cm vào dung d ch d ch trích)

Để yên que thử trong túi tối đa 30 phút ho c khi thấy vạch đối chứng và vạch

b bệnh CTV xuất hiện

- Đọc kết quả (Hình 2.2):

+ Nếu mẫu dư ng tính với CTV, vạch bệnh s xuất hiện Vạch bệnh s

có màu t đỏ đến hồng như vạch đối chứng Độ đậm nhạt về màu sắc ở vạch