phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa học và định type độc tố của vi khuẩn yếm khí clostridium perfringens trên thịt gà tại một số chợ bằng kỹ thuật multiplex - pcr

Córất nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn do: thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật, thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất, thực phẩm bị biến chất,thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đã vàđang trở thành mối quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới Nhiều nghiêncứu của các nhà khoa học đã đưa ra những cảnh báo về tình trạng mất an toàntrong thực phẩm tiêu dùng

Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng chừng 250-500 vụ ngộđộc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân, trong đó 100 - 200 ca tử vong Córất nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn do: thực phẩm

bị nhiễm vi sinh vật, thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất, thực phẩm bị biến chất,thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên…Xét về nguyên nhân do vi

sinh vật, trong số các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thì vi khuẩn C pefringens đã được nhiều tác giả nghiên cứu và xác định chúng là một trong

những tác nhân phổ biến gây ngộc độc thực phẩm [25]

Vi khuẩn Clostridium perfringens (C perfringens) là loại trực khuẩn,

bắt màu Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặcđứng song song Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉhình thành giáp mô trong cơ thể động vật Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc

tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn này ra làm 5type là A, B, C, D, E Mỗi type sản sinh ra những độc tố khác nhau và gâybệnh cho từng loại đối tượng khác nhau Type A sản sinh độc tố Alpha, type Bsản sinh các độc tố Alpha, Beta và Epsilon, type C sản sinh Alpha và Beta,

type D sản sinh Alpha và Epsilon, type E sản sinh Alpha và Iota Ngoài ra C perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kapa,

lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…[11]

Vi khuẩn C perfringens tồn tại rất phổ biến trong tự nhiên: trong đất,

nước, đặc biệt là trong đường ruột của động vật và con người [3] Do đó chúngrất dễ dàng lây nhiễm vào trong thực phẩm và gây ngộ độc cho con người.Bệnh ngộ độc thực phẩm thường do các vi khuẩn type A và C đôi khi D gây

ra Các type này có thể sản sinh độc tố enterotoxin nguồn gốc nha bào kết hợp

với các tế bào thượng bì niêm mạc của phần cuối ruột non gây tổn hại cấu trúcmàng tế bào gây đau bụng và tiêu chảy [11].

Thịt gà là một loại thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao và được

sử dụng khá phổ biến trong bữa ăn hàng ngày của mỗi gia đình Tuy nhiêncũng như các loại thực phẩm khác chúng rất dễ bị nhiễm các loại vi sinh vật

trong đó có vi khuẩn C pefringens Vì vậy, việc nghiên cứu tình trạng ô nhiễm

vi sinh vật trên thực phẩm nói chung và trên thịt gà nói riêng là rất cần thiết

Từ đó có thể kịp thời phản ánh tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm

và có những biện pháp giảm thiểu vấn đề ngộ độc thực phẩm Xuất phát từthực tế trên, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung vàBan giám đốc Viện công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha

Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “PHÂN LẬP, GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC VÀ ĐỊNH TYPE ĐỘC TỐ CỦA VI

KHUẨN YẾM KHÍ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRÊN THỊT

GÀ TẠI MỘT SỐ CHỢ TRONG ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ NHA TRANG BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR” Với mục tiêu là

xác định tình trạng ô nhiễm vi khuẩn C perfringens trên thịt gà mà chúng tôi

thu thập từ một số chợ bán lẻ trong địa bàn thành phố Nha Trang, từ đó đề ra

những khuyến cáo về tình trạng nhiễm C perfringens trên thịt gà.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nước và nước ngoài

1.1 Tình hình ngộ độc trong nước

Ngộ độc thực phẩm là do ăn phải thức ăn có chất độc, thường xảy ra mộtcách đột ngột và kết thúc nhanh chóng, khác với dịch bệnh là có thời gian tiếntriển tăng dần và trước khi kết thúc có thời gian giảm dần xuống Ngộ độc cónhững triệu chứng của một bệnh cấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, tiêuchảy…và kèm theo các triệu chứng khác tùy theo đặc điểm của từng loại ngộ

độc (trừ ngộ độc do C botulinum lại gây táo bón do bị tê liệt thần kinh) [4].

Theo thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy trong 3năm trở lại đây số người ngộ độc trong mỗi năm là rất lớn Trong đó ngộ độc

do nguyên nhân thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ lệ khá cao Ngộ độcthực phẩm không chỉ gây tổn thất lớn về sức khỏe mà còn thiệt hại rất lớn vềkinh tế của mỗi quốc gia Vì vậy, vấn đề kiểm soát ngộ độc thực phẩm củamỗi quốc gia là rất cần thiết, đặc biệt là vấn đề ngộ độc thực phẩm do vi sinhvật

Bảng 1.1 Thống kê ngộ độc thực phẩm trong 3 năm [24]:

Qua bảng thống kê ở trên cho thấy tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước

ta xảy ra nhiều và do nhiều nguyên nhân khác nhau Trong đó đáng chú ý là sốngười tử vong do ngộ độc thực phẩm còn cao Ngộ độc thực phẩm không chỉảnh hưởng đến sự an toàn và sức khỏe của cộng đồng mà còn ảnh hưởng đến

sự tăng trưởng của nền kinh tế quốc dân Đòi hỏi các đoàn thể xã hội phải hợptác chặt chẽ để hạn chế đến mức tối đa tình trạng ngộ độc thực phẩm như hiệnnay

1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nơi trên thế giới

Trong 3 thập niên trở lại đây, tình hình ngộ độc thực phẩm đã và đang làvấn đề nóng bỏng trên toàn thế giới Ngộ độc thực phẩm không chỉ diễn ra ởnhững nước đang phát triển mà cả ở những nước phát triển và gây ra nhiều tổnthất đáng lo ngại

Theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC)[12] có khoảng 76 triệu người bị các bệnh lây truyền qua thực phẩm hàng năm

ở Mỹ và gây thiệt hại khoảng 5 – 6 tỷ đô la, riêng chi phí cho bệnh lây truyền

qua thực phẩm do Salmonella chiếm khoảng 1 tỷ đô la hàng năm về những chi

phí y tế trực tiếp và gián tiếp

Tại Nhật Bản, theo thống kê của Trung tâm phòng chống dịch bệnh công

bố năm 2004 [12], số người bị ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi sinh vật lên tới

277 vụ, chiếm 45% trong số các vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước Thiệthại mỗi năm gần chục tỷ USD cho việc giải quyết những hậu quả của các vụngộ độc thực phẩm

Ở các nước phương tây, nhiễm C perfringens là nguyên nhân thứ ba về

ngộ độc thực phẩm phần lớn là do thực phẩm chưa được nấu chín

Trên đây là những con số sơ bộ về tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nướcphát triển Còn tại các nước đang phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm cũngđang diễn biến khá phức tạp và cũng gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng, trong

đó có Việt Nam

2 Nguyên nhân và một số loại ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm thường do các nguyên nhân sau [4]:

- Thức ăn bị ôi hỏng

- Bản thân thức ăn có chất độc

- Thức ăn bị nhiễm vi sinh vật

- Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thức ăn

2.1 Ngộ độc thực phẩm do thức ăn bị ôi hỏng

Trong quá trình bảo quản, nếu không đảm bảo vệ sinh hoặc không theođúng yêu cầu kĩ thuật, các cất dinh dưỡng trong thức ăn sẽ bị các tác nhânnhư: vi sinh vật, hoá học, vật lý… phân hủy thành những chất có hại Chẳnghạn như: các chất đạm bị phân hủy thành amoniac, hydrosulphua, các chấtamin độc; Các chất béo có thể bị oxy hóa thành các peroxyt, aldehyd, cetol,…;Nitrat bị chuyển thành nitrit…Các chất này không những làm cho thức ăn cómùi khó chịu mà có thể còn gây ngộ độc cho người sử dụng [4]

2.2 Ngộ độc do ăn phải thức ăn bản thân có chất độc

Một số động vật, thực vật bản thân nó có chứa trong tế bào những chấtđộc, hoặc trong điều kiện nào đó tiết ra chất độc có thể gây ra ngộ độc khi cơthể người ăn phải Ngộ độc loại này chia làm ba nhóm [4]:

- Một số thực vật có chất độc: khoai tây nảy mầm, sắn, măng, hạnh nhân Một

số loại hạt, vỏ cây, rễ cây có chứa saponin có tính chất tán huyết, phá hủyhồng cầu, tăng huyết áp, tăng sự hấp thụ và tác dụng của các alkanoid vào cơthể,…

- Một số động vật có chất độc: Loài nhuyễn thể Mytilus oedulis (chứa chất độc

mytilotoxin gây chóng mặt, nôn mửa, ỉa chảy, buồn tay chân, không kiểm soátđược cơ vận động dần dần dẫn đến tê liệt, tử vong); Loài cóc (có chứa chấtđộc bufogin, bufidin trong đó bufonin, bufotalin đều có nhân sterolic Các chấtđộc này có tính chất kích thích mạnh niêm mạc gây tê liệt); Loài cá nóc (cóchứa chất độc tetrodonin, acid tetrodonic, tetrodotoxin (trong buồng trứng) và

hepatoxin (trong gan) Ngộ độc gây tê liệt dần dần các cơ sau đó dẫn đến tửvong).

- Ngộ độc do ăn phải nấm độc: do người sử dụng chưa biết rõ nguồn gốc ăn

phải

2.3 Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thực phẩm

Có rất nhiều loại hóa chất cho vào thực phẩm với các mục đích khácnhau như các chất sát khuẩn, chất kháng sinh, chất chống oxy hóa hóa, chấtbảo quản… có thể gây ngộ độc cho người ăn Ví dụ: các chất thêm vào vớimục đích tăng tính hấp dẫn như chất làm ngọt nhân tạo, hương liệu, các phẩmmàu Hoặc các chất thêm để chế biến đặc biệt như: sử dụng các hóa chất làmtăng độ sáng bóng, độ dai, độ giòn của thực phẩm Hoặc các hóa chất lẫn vàothực phẩm trong quá trình chế biến, bảo quản, phân phối, hoặc tồn tại trongthức ăn do xử lý nông nghiệp, xử lý trong thời gian tàng trữ, bảo quản trongkho tàng hoặc những chất độc có sẵn hoặc do chuyển hóa sinh ra Tất cảnhững chất này đều có thể trở thành chất độc nếu sử dụng liều lượng vượt quácho phép với giới hạn an toàn sức khỏe của con người [4]

2.4 Ngộ độc do vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật

Thông thường các vi sinh vật khi nhiễm vào thực phẩm chúng tiết độc tốgây ngộ độc cho người sử dụng Độc tố của vi sinh vật có thể có bản chấtprotein hoặc không, được sản xuất bởi vi khuẩn nhằm tiêu diệt các tế bào vậtchủ [6] Độc tố do vi sinh vật sinh ra được chia làm hai loại:

Ngoại độc tố (exotoxin): là chất độc được sinh ra trong tế bào rồi tiết rangoài tế bào Các ngoại độc tố có tính độc cao đối với cơ thể động vật [6].Nội độc tố (endotoxin): là độc tố được tạo thành liên kết với các thànhphần của tế bào vi sinh vật, chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào chết hoặc bịphân hủy Nội độc tố có tính độc yếu hơn ngoại độc tố nhưng bền nhiệt (ởnhiệt độ sôi của nước độc tố không bị mất hoạt tính) [6]

Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn có độc tố của vi sinh vật màkhông cần có mặt các tế bào sống của chúng Ngộ độc thức ăn trong trường

hợp này là ngộ độc do độc tố vi sinh vật điển hình, thường là do ăn phải mộtlượng lớn ngoại độc tố có trong thức ăn [6].

Ngộ độc do ăn phải một lượng lớn vi sinh vật chủ yếu là do vi khuẩntrong thức ăn khi vào trong cơ thể chúng tiếp tục sinh trưởng, phát triển và sảnsinh độc tố Trong cơ thể chúng tiết độc tố hoặc khi bị chết sinh khối củachúng tự phân giải và giải phóng độc tố gây ngộ độc Ngộ độc dạng này gọi làngộ độc thức ăn có điều kiện hay là ngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn [6]

3 Một số vi sinh vật thường gây ngô độc thực phẩm

Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis và Salmonella enteritidis ngoài ra còn có các loại Salmonella thompson, Salmonella derby, Salmonella newport,…Salmonellae là loại trực

khuẩn gram âm, không sinh bào tử, lên men đường glucose sinh hơi, thườngkhông lên men đường lactose, sucrose Nhiệt độ tối thích để chúng phát triển

là 370C, khoảng pH dành cho sự phát triển là 4,1 – 9,0 Khả năng chịu nhiệt độ

và phát triển phụ thuộc vào loại thực phẩm và type huyết thanh Vi khuẩn bịtiêu diệt ở 660C ít nhất là 12 phút hoặc 600C trong 78 – 83 phút, trong sữatrứng là 81,50C trong 3 phút

Điều kiện cần thiết để ngộ độc do Salmonellae bộc phát là: (1) thực

phẩm phải chứa hoặc nhiễm vi khuẩn; (2) thực phẩm phải là môi trường tốt để

vi khuẩn phát triển, nhiệt độ thích hợp và thời gian đủ dài để sinh sôi nảy nở;(3) vi khuẩn phải được đưa vào ống tiêu hóa Vi khuẩn vào ruột rồi phát triểntại đó, theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùnghuyết Do đó trong thời kì đầu, lấy máu người bệnh cấy truyền sẽ phát hiện vikhuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột tiết ra độc tố.Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu Ngoài ra, vi khuẩn trong hệ tuầnhoàn cũng tiết ra nội độc tố Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vậnđộng của huyết quản, làm tăng độ bền của thành mao quản và giảm chức năngđiều tiết thân nhiệt của cơ thể

Triệu chứng gây bệnh: triệu chứng bộc lộ phụ thuộc vào số lượng và tỷ

lệ vi khuẩn nhiễm vào thực phẩm Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, cókhi vài giờ nhưng có khi vài ngày Triệu chứng trước tiên là nhức đầu, chán

ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy Thân nhiệt tănglên 38-400C trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát hiện bệnh và tùy theo mức độnặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày Bệnh nặng gây ra viêm dạ dày ruột [10]

E coli = E coli sinh độc tố ruột) Thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ tùy theo

dòng vi khuẩn và loại độc tố Loại độc tố ruột có thời gian gây bệnh trung bình

26 giờ, biến thiên từ 4 – 44 giờ Loại độc tố tế bào (cytotoxin) có thời gian gâybệnh trung bình 11giờ, biến thiên từ 8 – 24giờ Bệnh phát ra đột ngột, đaubụng dữ dội rất ít nôn mửa, đi phân lỏng khoảng 1 – 15 lần/ngày Nhiệt độ cơthể bình thường hoặc tăng nhẹ, bệnh kéo dài 1 – 3 ngày rồi khỏi Trường hợpnặng thì có thể sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, thời gian khỏi bệnh tươngđối dài [10]

liposaccharide tác động trực tiếp trên niêm mạc ruột Thời gian ủ bệnh từ 1 – 7ngày, trung bình dưới 4 ngày Triệu trứng thay đổi từ nặng đến nhẹ như: đauthắt bụng, ớn lạnh, tiêu chảy có máu lẫn màng niêm mạc mủ, đau đầu, ói mửa.

Ngoài ra còn nhiều loại vi khuẩn, virus gây ngộ độc thực phẩm Trong

đó đáng chú ý là vi khuẩn yếm khí C perfrigens đã được nhiều tác giả trong

và ngoài nước nghiên cứu và xác định là một trong những tác nhân quan trọnggây ngộ độc thực phẩm [10]

4 Những hiểu biết về vi khuẩn C perfringens

Lần đầu tiên Feser (1865) phát hiện C perfringens, sau đó các tác giả lần lượt nghiên cứu về vi khuẩn và bệnh do vi khuẩn này gây ra Loài C perfringens lần đầu tiên được phân lập và mô tả bởi Welch và Nuttall (1892) trong tổ chức có hơi của xác người chết và được đặt tên là Bacillus aerogens capsulatus, về sau được đổi tên là Bacillus perfringens do Veillon và Zuber (1898) và thành Bacillus welchii [13]

4.1 Đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu

C perfrigens là trực khuẩn có khả năng sinh nha bào, nha bào hơi lệch

tâm, vi khuẩn không có khả năng di động chỉ hình thành giáp mô trong cơ thểđộng vật Là trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm gram dương đứng riêng rẽhoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4)(1,3 - 19)m [13], [14]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C perfringens

4.2 Đặc điểm nuôi cấy

Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩnphát triển tốt làm đục môi trường

Trên môi trường thạch máu: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩnphát triển tạo khuẩn lạc tròn ướt có hai vòng dung huyết xung quanh [14]

Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc trònmàu đen, do vi khuẩn sinh H2S tác dụng với Fe (trong môi trường) tạo thànhFeS có màu đen [20]

Trên môi trường nước thịt gan yếm khí vi khuẩn mọc rất tốt, nhanhchóng làm đục môi trường

Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose,maltose, sucrose Không lên men manitol, không sinh indol [20]

4.4 Phân loại.

Dựa vào khả năng sinh độc tố chính (alpha, beta, epsilon, iota), người ta

chia C perfrigens thành 5 type độc tố khác nhau bao gồm các type: A, B, C,

D, E Ngoài ra vi khuẩn còn sản sinh một số các độc tố khác như: gama, delta,eta, theta, kappa, lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin Trong nhữngnăm gần đây một số tác giả còn phát hiện độc tố beta 2 [11]

Bảng 1.2 Các độc tố chính của vi khuẩn C perfringens

Alpha Beta Epsilon Iota

Beta toxin (gene mã hoá là Cpb) nằm trên plasmid của vi khuẩn, gây tổnthương các tế bào biểu mô ruột, tế bào màng trong ruột Ngoài ra, beta toxincòn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi canxi màng gây rốiloạn chức năng thần kinh bình thường Mới đây nhiều tác giả còn đề cập đếnđộc tố Beta toxin 2 (Cpb2) nhưng vai trò của nó trong gây bệnh còn chưa xácđịnh rõ, gene mã hoá của nó nằm trên plasmid Theo khảo sát của Dawn vàcộng sự (2003) [15] tại trường đại học Arizona Mỹ thì tỷ lệ lưu hành của gene

Cpb2 trong các chủng C perfringens phân lập trên bò bị bệnh tiêu chảy, bệnh

nhiễm độc huyết đường ruột và chết đột tử là 21,4%, trên bê bị bệnh do type A

là 11,8%, type C là 40% và type E là 97,3%

Epsilon toxin, gene mã hóa độc tố nằm trên plasmid Đích của độc tốnày là nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của

Độctố

Type

động vật Eukaryotic, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận Độc tố epsilonđược tiết ra như là 1 tiền độc tố và được kích hoạt bằng men proteolytic.

Iota toxin có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và

vị trí hoạt hóa enzyme (Ia) Sau khi độc tố gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bềmặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào

Enterotoxin: là độc tố được sản xuất bởi chủng vi khuẩn type A, và làđộc tố chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm Gen mã hoá độc tố là CPE, gen nàythường tìm thấy trên plasmid hoặc nằm trên nhiễm sắc thể Trong hầu hết cácchủng phân lập từ thực phẩm bị nhiễm độc, thì gen này nằm trên nhiễm sắcthể Độc tố enterotoxin là một chuỗi polypeptid gồm khoảng 319 acid amin,trọng lượng phân tử khoảng 3,5 kDa Khi bị nhiễm độc enterotoxin các triệuchứng xuất hiện bao gồm: tiêu chảy, nôn mửa, sốt kéo dài trong vòng 1 ngày.Thời gian ủ bệnh 6 – 24 giờ thường từ 10 – 12 giờ [23]

4.5 Đặc tính gây bệnh

C perfrigens là loại vi khuẩn gây bệnh rộng rãi trong tự nhiên và gây

bệnh cho nhiều loài gia súc, gia cầm cũng như con người Các type khác nhaugây bệnh khác nhau [14], [20] Trong đó:

- Type A: gây bệnh hoại thư sinh hơi, ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy ởngười Gây nhiễm độc tố máu: bò, dê, ngựa, lạc đà, một số khác Gây viêmruột ở ngựa, viêm dạ dày cấp tính ở động vật gần con người, con người vàcác loại khác Gây bệnh nhiễm độc máu gây vàng da ở cừu

- Type B: gây bệnh lị ở cừu, cừu con, gây nhiễm độc tố ở dê, cừu, bò,ngựa sơ sinh, chuột lang, cừu non

- Type C: gây nhiễm độc tố ở cừu non, lợn, cừu, bê, ngựa non, gây bệnhviêm ruột hoại tử ở gia cầm

- Type D: gây bệnh máu nhiễm độc tố ruột ở cừu, bệnh mềm thận ở cừunon

- Type E: gây bệnh máu nhiễm độc tố ruột ở bò bê, chuột lang, thỏ, gâybệnh lị ở cừu

4.6 Sức đề kháng của C perfringens

C perfringens là thành viên của họ Bacillacae, chúng có khả năng sinh

nha bào Tùy theo chủng nha bào có thể chống chịu được với nhiệt độ hoặckhông (1 – 30 phút ở 1000C) Phần lớn các chủng nhạy cảm với nhiệt độnhưng những chủng gây bệnh lại chịu được nhiệt độ cao Các nha bào sống sótrất lâu trong môi trường và chịu được điều kiện lạnh đông [7]

Về khả năng sống sót qua thời gian trữ đông kết quả nghiên cứu ở thịt

gà đông lạnh cho thấy chỉ có 4% tế bào sống sót được khi trữ ở - 17,70C sau

180 ngày trong khi tỷ lệ này ở bào tử khô là 40% sau 90 ngày và 11% sau 180ngày Về pH, nhiều chủng tăng trưởng trong khoảng 5,5 – 8,5 nhưng thườngkhông dưới 5,5 và không trên 8,5 Nồng độ Sodium chlorua 5% ức chế sự pháttriển của vi khuẩn và vài dòng thì bị ức chế ở 2,5% sodium nitrat [3]

4.7 Ngộ độc do C perfringens

Vi khuẩn C perfringens là một ví dụ điển hình về type huyết thanh gây

ngộ độc thực phẩm trong giống Clostridia, chiếm một vị trí khá đặc biệt vừa là

tác nhân gây bệnh do thực phẩm vừa gây ngộ độc thực phẩm Một mặt C.

perfringens gây bệnh khi nạn nhân ăn phải một lượng lớn tế bào vi khuẩn, mặt

khác chúng còn sinh độc tố gây ngộ độc [3]

Vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm là do C perfringens type A Triệu

chứng gây bệnh: hầu hết sự ngộ độc xảy ra khi người tiêu thụ thực phẩm

nhiễm C perfringens ở mật độ khoảng 1 triệu vi khuẩn/1gam Triệu chứng

thường biểu hiện sau 8 – 24 giờ, trung bình là 12 giờ, gồm: đau bụng, tiêuchảy và giải phóng nhiều chất khí, sốt, buồn nôn, ít khi ói mửa Trong quátrình vi khuẩn hình thành bào tử chúng giải phóng độc tố ruột, hậu quả là trongruột tích lũy một lượng lớn chất lỏng Độc tố này bị bất hoạt ở 600C trong 10phút [3]

Điều kiện và nguồn gốc giúp ngộ độc bộc phát là: (1) thực phẩm phải

có sẵn vi khuẩn hoặc bị vấy nhiễm C perfringens, (2) thực phẩm không được

trữ lạnh thích hợp, nhiệt độ thích hợp và đủ thời gian cho vi khuẩn phát triển

đủ số lượng, (3) thực phẩm không được đun nấu lại trước khi sử dụng, và (4)

vi khuẩn hình thành bào tử trong ống tiêu hóa và hình thành độc tố ruột [10]

Bào tử thường tìm thấy trong hầu hết các thực phẩm tươi sống cũngnhư trong đất, nước thải và phân gia súc Thịt gia súc các loại chiếm

4

3 các

đợt ngộ độc của C perfringens [10].

4.8 Một số nghiên cứu về C perfringens trong những năm gần đây

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về C perfringens gây

bệnh trên động vật cũng như bệnh ngộ độc thực phẩm ở người Dưới đây làmột số nghiên cứu mà chúng tôi tham khảo được

Dennis L Stevens và cộng sự (1986) đã nghiên cứu so sánh giữa đơn

và kết hợp nhiều nhân tố kháng khuẩn trong việc ngăn cản bệnh sinh hơi hoại

thư gây ra bởi C perfringens Ông đã chứng minh việc kết hợp nhiều loại

kháng sinh điều trị có hiệu quả hơn so với điều trị bởi riêng một loại khángsinh

Qiyi Wen thì tiến hành phân lập chủng C perfringens có trên các mẫu

thực phẩm bán lẻ ở Mỹ gây ngộ độc Ông đã thu được tất cả các mẫu là type

A, gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là type này do độc tố enterotoxin nằm trênnhiễm sắc thể gây ra, nha bào của những chủng này đều có khả năng chịuđược nhiệt độ cao [19]

Tại các trang trại gà ở Cario Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử, Effat và

cộng sự đã phân lập C perfringens từ các mẫu gà bị bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả những vi khuẩn phân lập được đều là C perfringens, có khuẩn

lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu cừu với hai vòng dung huyết Soi trênkính hiển vi điện tử chúng là các trực khuẩn Gram dương và không di động.Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với

4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, betha, epsilon,iota Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnhviêm ruột hoại tử ở các trang trại này [17]

5 Thịt và con đường nhiễm vi sinh vật vào thịt

Thịt gà là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, trong thịt có các thành phần:protein, lipid, các chất khoáng, vitamin, nước Do đó thịt là không chỉ là thựcphẩm tốt cho người và còn là môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển

Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không chỉ gây thiệt hại lớn về giá trị dinhdưỡng, chất lượng của thực phẩm mà còn có thể gây bệnh cho con người.Các con đường lây nhiễm vi sinh vật vào thịt [6]:

- Do bản thân gia súc, gia cầm đã bị bệnh trước khi giết mổ do đó trongthực phẩm đã có sẵn vi sinh vật

- Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài như đất, nước

và các dụng cụ không sạch nhiễm vào thực phẩm, thực phẩm bị hỏng, ôithiu, ô nhiễm chéo vào thực phẩm

- Lây nhiễm vi sinh vật do vật môi giới lây truyền: đó là ruồi, nhặng,muỗi, côn trùng… mang vi sinh vật từ phân hoặc rác thải nhiễm vào khichúng nhiễm vào thịt

Chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi được quy định theo TCVN 7046 –

2002 do bộ khoa học và công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ –

BKHCN TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C perfringens không quá 10 vi khuẩn/gam [2].

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

1 Nội Dung.

 Phân lập vi khuẩn C perfrigens trên thịt gà ở một số chợ trong TP Nha

Trang

 Định lượng vi khuẩn C perfringens có trong 1 gam thịt gà.

 Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn phân lậpđược

 Xác định type độc tố vi khuẩn bằng kỹ thuật Multiplex - PCR.

 Xác định khả năng hình thành nha bào của vi khuẩn C perfringens.

2 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu.

2.1 Đối tượng nghiên cứu.

- Vi khuẩn C perfrigens nhiễm trên thịt gà tươi được lấy từ bốn chợ trong

thành phố Nha Trang: chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ, chợ Đầm, chợ Xóm Mới

2.2 Nguyên liệu nghiên cứu

- Môi trường sử dụng (Các môi trường nuôi cấy do hãng Merk - Đức sảnxuất): Fluid Thyoglycolate, TSC aga, BHI broth, các môi trường đường, Eggyolk, Limus milk,…

- Dung dịch hoá chất cho phản ứng PCR (Chúng tôi đã sử dụng các sinhphẩm được sản xuất bởi hãng Invitrogen) gồm: dung dịch đệm Buffer, enzyme

Taq- DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, DNA mẫu, primer đặc hiệu, nước cất

2.3 Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm.

Nồi hấp, tủ ấm, tủ lạnh, tủ lạnh – 800C, tủ sấy, tủ cấy vô trùng, máy luânnhiệt PCR,…

Hộp lồng, ống nghiệm, que cấy, cối chày…

3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu.

- Địa điểm lấy mẫu: chợ Vĩnh Hải, chợ Vĩnh Thọ, chợ Đầm, chợ Xóm Mới

- Thời gian lấy mẫu: vào lúc 10 giờ trưa

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn nghiên cứu Vi trùng - Phân viện thú y miềnTrung - Nha Trang, Khánh Hoà

- Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/08/2008 đến 30/10/2008

4 Phương pháp nghiên cứu.

4.1 Phương pháp lấy mẫu.

Lấy mẫu thịt gà theo TCVN 4833 - 1 : 2002 (ISO 3100 - 2 : 1988) [1]

Mẫu sau khi lấy để riêng trong túi PE vô trùng Ký hiệu mẫu: Thời gian lấymẫu, địa điểm lấy mẫu và ký hiệu mẫu rõ ràng Sau đó cho mẫu vào thùng đá,vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm

Thời gian và số lượng mẫu được bố trí lấy như ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Thời gian và số lượng mẫu khảo sát ở mỗi địa điểm

4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn C perfringens

Chúng tôi áp dụng quy trình phân lập vi khuẩn C perfringens theo quy trình

phân lập của Bộ môn nghiên cứu Vi trùng Phân viện Thú y miền Trung

Sơ đồ phân lập

4.3 Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn có trong 1gam thịt gà

Chúng tôi áp dụng phương pháp đếm khuẩn lạc theo: Thường quy kỹ thuật

định lượng C perfringens trong thực phẩm (Ban hành kèm theo Quyết định số

3348/QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế ) [8].

- Chẩn bị mẫu, dung dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10 -1 , 10 -2 , 10 -3

Cân chính xác 25 gam mẫu thịt gà, cắt nhỏ hoặc nghiền nát trong điềukiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất Sau đó bổ sung 225 ml nướcmuối sinh lý lắc đều từ 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ 10-1.Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9mlnước muối sinh lý Lắc đều trong 2-3 phút thu được dung dịch nồng độ 10-2.Làm tương tự ta thu được các dung dịch mẫu thử nồng độ 10-3, 10-4,…

Mẫu

FluidThyoglycolate

Môi trường đặchiệu (TSC agar)

Chọn khuẩn lạc tăng sinhtrên môi trường thạch máu

Xác định các đặc tínhsinh vật hóa học

Định danh vi khuẩn

Định type vi khuẩn

- Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch

Đổ khoảng 15ml môi trường TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấunồng độ pha loãng Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút chính xác 1ml canh khuẩnnhỏ lên mặt thạch sau đó dùng pipet dàn đều mẫu trên bề mặt thạch, mỗi nồng

độ cấy trên 2 đĩa tương ứng Đợi bề mặt thạch khô, đổ tiếp 15ml môi trườngTSC rồi láng đều để môi trường phủ kín bề mặt đĩa Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa, cho đĩa vào túi yếm khí, đặt vào tủ ấm 370C, 10%CO2

Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả sơ bộ Đếm toàn bộnhững khuẩn lạc có các đặc tính tròn, lồi, bờ đều nhẵn, màu đen Số lượng vikhuẩn có trong 1 gam thịt gà được tính bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôicấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường TSC, cấy kiểm tra trên môitrường thạch máu Sau đó kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học Trên cơ sởnhững đặc tính sinh vật, hóa học đã được kiểm tra tiến hành định danh vikhuẩn

- Số lượng vi khuẩn có trong 1 gam thịt được tính bằng:

N = M * 10nTrong đó: N: là số vi khuẩn có trong 1 gam thịt

M: là số khuẩn lạc trung bình

10n: Độ pha loãng tương ứng

Ghi nhận kết quả tổng số vi khuẩn C perfringens có trong 1 gam thịt tươi so sánh với tiêu chuẩn cho phép đối với vi khuẩn C perfringens do Bộ

Khoa học và Công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ – BKHCN

TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C perfringens

không quá 10 vi khuẩn/gam

4.4 Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn C perfrigens bằng phương

pháp soi tươi.

Làm tiêu bản giọt treo: Cho một giọt canh khuẩn từ môi trường FluidThyoglycolate lên giữa kính phủ vật Xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn

quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính lõm (không để giọtcanh khuẩn lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm) Đặt tiêu bản lênkính hiển vi và quan sát ở vật kính dầu [3].

4.5 Phương pháp kiểm tra hình thái của vi khuẩn C perfringens

Để kiểm tra hình thái của vi khuẩn chúng tôi sử dụng phương phápnhuộm Gram, soi dưới kính hiển vi với với vật kính dầu [3]

Làm tiêu bản cố định phiến phết: Dùng que cấy lấy một giọt canhkhuẩn, dàn đều canh khuẩn trên một lam kính sạch Để dịch khuẩn tự khôhoàn toàn, hơ mặt dưới của lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần,tránh không để tiêu bản quá nóng [3]

Tiến hành nhuộm: Phủ dung dịch Crystal Violet lên lam kính đã được

cố định trong 1 phút, rửa Crystal violet với nước cất Phủ dung dịch Lugoltrong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch Lugol và rửa nhẹ với nước cất Cầm mộtđầu lam kính, nhỏ từ từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến phết bạc màu đi (thờigian tẩy cồn thông thường khoảng 5 – 10 giây), rửa ngay với nước để dừngcông đoạn tẩy cồn Sau đó phủ dung dịch Fuchsin lên lam kính 1 phút, đổ bỏdung dịch và rửa nhẹ qua nước

Để tiêu bản khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm để thấm khô, quan sáthình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 40X [3]

Phương pháp kiểm tra Gram bằng KOH 3%

Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên một phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩnlạc cần kiểm tra đặt vào vị trí có giọt KOH 3% Dùng que cấy làm tan khuẩnlạc trong KOH Sau đó từ từ đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo, nhầy kéo lênthì vi khuẩn cần kiểm tra là vi khuẩn Gram âm, nếu không có sợi tơ nhầy kéotheo thì vi khuẩn cần kiểm tra là Gram dương [3]

4.6 Phương pháp kiểm tra đặc tính nuôi cấy, một số đặc tính sinh vật hoá

học của vi khuẩn

- Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu: Dùng que cấy vô

trùng lấy một lượng nhỏ môi trường Fluid thioglycolate ria đều trên bề mặt

thạch máu Sau đó bỏ trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 370C, 10% CO2 nuôicấy trong vòng 24 – 28 giờ, nếu xung quanh khuẩn lạc có 2 vòng dung huyếtthì phản ứng dương tính và ngược lại.

- Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, saccarose:

Dùng que cấy vô trùng chọn lấy một khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuốngđáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 370C, 10%

CO2 Sau 24 – 28 giờ lấy ra đọc kết quả, phản ứng dương tính khi môi trườngchuyển từ màu đỏ sang vàng và ngược lại

- Kiểm tra khả năng sinh hơi: Vi khuẩn có khả năng sinh hơi nếu trên các môitrường đường, thạch bị nứt hoặc bị đẩy lên trên, và ngược lại

- Kiểm tra trên môi trường Mannitol – Motility: Dùng que cây vô trùng lấy

khuẩn lạc cần kiểm tra cấy một đường chích sâu xuống đáy ống nghiệm, để tủ

ấm 370C từ 24 – 28 giờ sau đó đọc kết quả.Vi khuẩn có khả năng lên menđường thì làm môi trường chuyển từ đỏ sang vàng với chỉ thị phenol đỏ Vikhuẩn có khả năng di động sẽ làm môi trường đục đều, vi khuẩn di động yếuchỉ làm đục môi trường xung quanh đường cấy, vi khuẩn không di động chỉmọc trên đường cấy

- Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Limus milk: Dùng que cấy vô

trùng lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Litmus milk, nuôi cấy trong tủ ấm

370C, 10% CO2 sau 24 – 28 giờ kiểm tra Phản ứng dương tính khi vi khuẩnlên men lactose, làm đông vón casein, môi trường chuyển từ màu tím sang nâusang trắng với chỉ thị pH litmus

- Kiểm tra khả năng phát triển trên môi trường Egg yorlk: Dùng que cấy vô

trùng chọn lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy ria đều trên môi trường Egg yolk Bỏđĩa vào trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 370C, 10% CO2 sau 24 – 28 giờ lấy

ra đọc kết quả Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh menlecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc

và ngược lại

4.7 Phương pháp giữ giống vi khuẩn

Dùng pipet 1000μl, hút 1000μl môi trường nuôi cấy vi khuẩn cho vàoống eppendof Tiến hành ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 4 phút Bỏnước trong, giữ lại cặn Hút 500μl glycerol, sau đó bổ sung thêm 500μl môitrường nuôi cấy vi khuẩn Voltex cho hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ lạnh ởnhiệt độ - 800C

4.8 Phương pháp định type độc tố vi khuẩn C perfringens bằng kỹ thuật

Multiplex – PCR

Để xác định type vi khuẩn, chúng tôi dựa vào việc xác định gen mã hoá cácđộc tố chính của các vi khuẩn phân lập được bằng việc sử dụng phản ứngMultiplex – PCR Từ đó kết luận type vi khuẩn phân lập được

Ở đây chúng tôi sử dụng cặp mồi cho phản ứng Multiplex – PCR do Bộ mônnghiên cứu Vi trùng Phân Viện Thú Y Miền Trung cung cấp Trình tự các mồiđược sử dụng trong phản ứng Multiplex – PCR như ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex – PCR