Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật hoá học, yếu tố độc lực và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli gây bệnh sưng phù đầu(edima disease) trên lợn con tại một số tỉnh miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ TUẤN LONG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC, YẾU TỐ ðỘC LỰC VÀ TÍNH MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH SƯNG PHÙ ðẦU (EDEMA DISEASE) TRÊN LỢN CON TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ TUẤN LONG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC, YẾU TỐ ðỘC LỰC VÀ TÍNH MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH SƯNG PHÙ ðẦU (EDEMA DISEASE) TRÊN LỢN CON TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà NGÀNH : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. TÔ LONG THÀNH PGS.TS. PHẠM NGỌC THẠCH HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Tác giả luận văn ðỗ Tuấn Long Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii LỜI CÀM ƠN ðể hoàn thành Luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ của các thầy cô giáo và bạn bè ñồng nghiệp. Nhân dịp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của thầy cô giáo khoa Thú y, Ban ñào tạo sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Ngọc Thạch, PGS.TS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Thị Kim Oanh. Các thầy cô ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quí báu của Ban lãnh ñạo, các cán bộ công nhân viên Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương ñã dành nhiều thời gian và công sức giúp ñỡ tôi trong quá trình thưc hiện ñề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia ñình và bạn bè ñồng nghiệp ñã luôn giúp ñỡ, ñộng viên giúp tôi hoàn thành luận văn này Hà Nội. tháng 11 năm 2013 Tác giả luận văn ðỗ Tuấn Long Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời càm ơn iii Mục lục iv Danh mục những chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix MỞ ðẦU 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E.coli và bệnh do chúng gây ra 3 1.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E.coli trên thế giới 3 1.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E.coli ở Việt Nam 4 1.2 ðặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli 6 1.2.1 ðặc ñiểm hình thái 6 1.2.2 ðặc tính nuôi cấy 7 1.2.3 ðặc tính sinh hóa 8 1.2.4 Sức ñề kháng 8 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên 9 1.2.6 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli 10 1.2.7 Khả năng gây bệnh 14 1.2.8 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli 15 1.3 Bệnh phù ñầu ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra 16 1.3.1 Mầm bệnh 16 1.3.2 Dịch tễ học 17 1.3.3 Phương thức truyền lây của bệnh 17 1.3.4 Cơ chế gây bệnh 18 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 1.3.5 Triệu chứng 19 1.3.6 Bệnh tích 20 1.3.7 Chẩn ñoán 22 1.3.8 Các loại vacxin phòng bệnh phù ñầu 22 CHƯƠNG 2 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ðối tượng nghiên cứu 23 2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 23 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.3.1 Xác ñịnh tỷ lệ phân lập vi khuẩn E.coli gây bệnh phù ñầu ở lợn 23 2.3.2 Xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23 2.3.3 Xác ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23 2.3.4 Xác ñịnh serotype của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23 2.3.5 Xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 23 2.4 Nguyên liệu 23 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm lợn 23 2.4.2 Môi trường, nguyên liệu phân lập vi khuẩn, xác ñịnh serotype của vi khuẩn 24 2.4.3 Hóa chất, dung dịch, cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 24 2.4.4 Môi trường, nguyên liệu làm kháng sinh ñồ 24 2.4.5 Dụng cụ, máy móc 25 2.5 Phương pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 25 2.5.2 Phương pháp phân lập, xác ñịnh vi khuẩn E.coli từ mẫu bệnh phẩm 25 2.5.3 Phương pháp giám ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli 25 2.5.4 Xác ñịnh ñộc tố VT2e và kháng nguyên F18 bằng phương pháp PCR 30 2.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 31 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết quả thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn E.coli 32 3.2 Kết quả xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 36 3.3 Kết quả xác ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 38 3.3.1 Khả năng dung huyết 38 3.3.2 ðộc tố Verotoxin Vt2e và yếu tố bám dính F18 39 3.4 Kết quả xác ñịnh serotype của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 43 3.5 Xác ñịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 46 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 ðỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT E. coli : Escherichia coli ED : Edema disease F18 : Fimbriae 18 KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể PCR : Polymerase Chain Reaction Stx2e : Shiga toxin 2e Stx + E. coli : Chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ñộc tố Shiga toxin VT2e : Verotoxin 2e VT2e + E. coli : Chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ñộc tố Verotoxin 2e Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Trình tự nucleotide của cặp mồi xác ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E. coli 24 2.2 ðánh giá kết quả ñường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Hội ñồng Quốc gia Hoa Kỳ 29 2.3 Chu trình của phản ứng PCR 31 3.1 Kết quả thu thập mẫu và tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. Coli ở các ñịa phương 32 3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn E. coli theo tuổi lợn 34 3.3 Kết quả giám ñịnh sinh hóa của vi khuẩn E. coli phân lập ñược 36 3.4 Kết quả xác ñịnh yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E. coli 40 3.5 Kết quả xác ñịnh serotype của vi khuẩn E. coli phân lập ñược 43 3.6 Tỷ lệ các serotype của vi khuẩn E. coli phân lập ñược 44 3.7 Kết quả kháng sinh ñồ của các chủng E. coli phân lập ñược 47 3.8 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập ñược theo ñịa phương 49 3.9 Kết quả xác ñịnh tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập ñược ở lợn theo lứa tuổi 51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cơ chế gây bệnh sưng phù ñầu của vi khuẩn E.coli 18 1.2 Lợn mất thăng bằng 19 1.3 Phù ruột và hạch màng treo ruột 20 1.4 Phù tích nước dưới da vùng ñầu 20 1.5 Lợn phù ñầu, phù mí mắt, có triệu chứng thần kinh 21 1.6 Phù tích nước ở vùng mặt, mí mắt 21 1.7 Niêm mạc ruột xuất huyết (bên trái) và bình thường(bên phải) 21 1.8 Niêm mạc dạ dày xuất huyết (bên trái) và bình thường (bên phải) 21 2.1 Sơ ñồ chẩn ñoán thường quy bệnh phù do vi khuẩn E.coli 26 3.1 Tỷ lệ phân lập E.coli ở lợn theo lứa tuổi 35 3.2 Bộ sinh hóa cho vi khuẩn E.coli 37 3.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn E.coli trên thạch MacConkey (trái), thạch máu (phải) 38 3.4 Sản phẩm phản ứng PCR xác ñịnh gene VT2e và F18 41 3.5 So sánh tỷ lệ các serotype của vi khuẩn E.coli phân lập ñược 45 3.6 So sánh tỷ lệ mẫn cảm và kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập ñược 48 [...]... i khuy n cáo l i mang tính ñ c thù riêng vì chúng ñư c xây d ng t các s li u d a trên nghiên c u trong ñi u ki n nghiên c u khác nhau Hơn th n a, cho ñ n nay h u như các khuy n cáo này ñ u quá cũ và không phù h p v i tình hình phát tri n chăn nuôi, ñ c bi t là s ti n b v di truy n ñòi h i các ch ñ nuôi dư ng ph i phù h p ñ phát huy t i ña ti m năng sinh trư ng và sinh s n c a con v t nư c ta trong... ADF); R2 = 0,90; Noblet và c ng s (1994) Trong ñó St là tinh b t 2 Nhu c u năng lư ng c a l n 2.1 Nhu c u năng lư ng c a l n con Sinh trư ng c a l n con ch y u là sinh trư ng mô n c Nhu c u dinh dư ng c a l n con ñư c quy t ñ nh b i t c ñ sinh trư ng mô n c Hai y u t quan tr ng hàng ñ u nh hư ng ñ n t c ñ sinh trư ng c a l n con là năng lư ng và protein (axit amin) (Bùi Quang Tu n và ð ng Thúy Nhung, 2002)... Kcal/ngày S li u trung bình ư c tính cho MEm là 106 Kcal ME/kg BW0,75 (Whittemore 1976; Bohme và c ng s , 1980; Wenk và c ng s , 1980; ARC, 1981; Noblet và Le Dividich, 1982; Campbell và Denkin, 1983; Close và Stanier, 1984; Mc Nutt và Ewan, 1984, Gadeken và c ng s , 1985; Noblet và c ng s , 1985), s này tương ñương v i 110 Kcal DE/kg Whittemore (1983) ñưa ra mô hình có th tính chính xác hơn: MEm (Kcal/ngày)... gian ch a s ăn vào lư ng năng lư ng nhi u hơn m c c n thi t cho duy trì và nuôi dư ng bào thai, ñi u này làm cơ th m tích lũy m và protein nhi u hơn Vì năng lư ng ăn vào và kh i lư ng cơ th tăng trong th i gian ch a nên năng lư ng ăn vào và kh i lư ng cơ th khi nuôi con l i gi m (Baker và c ng s , 1969; Brook và Smith, 1980, William và c ng s , 1985) Vì v y c n h n ch năng lư ng trong giai ño n ch a ñ... con Nhu c u năng lư ng hàng ngày c a nái nuôi con bao g m nhu c u cho duy trì (MEm) và nhu c u ti t s a và cho ñi u hòa thân nhi t Cũng gi ng như ñ i v i nái ch a nhu c u năng lư ng cho duy trì hàng ngày c a nái nuôi con ñư c tính b ng 106 Kcal ME/kg BW0,75 ( hay 110 Kcal DE/kg v i BW0,75) (NRC, 1998) Nhu c u năng lư ng cho ti t s a có th ñư c ư c tính d a trên t c ñ phát ti n c a l n con ñang bú và. .. năng sinh trư ng c a l n con t 7- 28 ngày ñã cho bi t m c protein 23% và lysine 1,5 % cho kh i lư ng l n con cao nh t Theo Cole (1985) kh u ph n cho l n con cai s a t i lúc ñ t 50kg có m c lysine 0,9% và protein thô 18,5% là thích h p nh t T c ñ sinh trư ng c a l n con r t nhanh nên ñòi h i nhu c u dinh dư ng cao Lê H ng M n (2002) cho bi t nhu c u protein b sung cho l n con 10 -12 ngày tu i là 12g /con/ ngày;... ngày là 24g /con/ ngày; 30 – 45 ngày tu i là 30g /con/ ngày; 45 – 60 ngày tu i là 40g /con/ ngày Vi c xác ñ nh ñư c nhu c u dinh dư ng c a l n con là cơ s ñ tính toán cân ñ i các lo i nguyên li u ñ có ñư c kh u ph n phù h p v i các giai ño n c a l n con 1.2 Nhu c u protein, axit amin c a l n nái ch a Nhu c u protein, axit amin nái ch a ph thu c vào nhu c u cho duy trì, t ng h p protein cho cơ th m và t ng h... trong kh u ph n th c ăn tùy thu c vào t ng giai ño n nuôi dư ng c a l n nái Theo tiêu chu n Vi t Nam (1994) thì hàm lư ng protein trong th c ăn ñ i v i l n nái ch a là 14%, ñ i v i nái nuôi con là 16% Tuy nhiên vi c cung c p protein cho l n nái còn ph thu c s con ñ nuôi và th tr ng c a con m Qua nhi u nghiên c u cho th y cung c p protein có ngu n g c t ñ ng v t năng su t sinh s n c a v t nuôi cao hơn... c vào: ti m năng di truy n c a con gi ng, tính bi t (gi i), mùa v , m i quan h gi a lysine v i năng lư ng (tính theo g/Mcal DE, ME ho c NE) 2 Protein lý tư ng và t l các axit amin trong kh u ph n ăn cho l n cái h ub Nuôi dư ng nái h u b ph i cung c p ñ năng lư ng, protein, khoáng và vitamin Protein ñóng vai trò r t quan tr ng trong dinh dư ng l n nái h u b , vì l n nái h u b ñang trong giai ño n sinh. .. n Th Lương H ng và c ng s (2003) khi nghiên c u v m c năng lư ng và protein thích h p cho l n con sau cai s a cho bi t, ñàn l n con ngo i thu n giai ño n sau cai s a có t c ñ sinh trư ng cao nh t khi ăn kh u ph n có m c năng lư ng 3300 và 3400 Kcal ME/kg (14 MJ DE/kg); t c ñ sinh trư ng c a l n ñ t cao khi kh u ph n có m c năng lư ng 14 MJ DE/kg 2.2 Nhu c u năng lư ng c a l n ñang sinh trư ng Năng . NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH VẬT HÓA HỌC, YẾU TỐ ðỘC LỰC VÀ TÍNH MẪN CẢM KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI GÂY BỆNH SƯNG PHÙ ðẦU (EDEMA DISEASE) TRÊN LỢN CON TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN. (Edema disease) trên lợn con tại một số tỉnh miền Bắc Vi t Nam . MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ðỀ TÀI - Xác ñịnh ñược một số ñặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli gây bệnh sưng phù ñầu trên lợn con. . E. coli gây ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Nghiên cứu một số ñặc tính sinh vật hóa học, yếu tố ñộc lực và tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh sưng phù