- ðộ c tố Verotoxin Vt2e và yếu tố bám dính F
2.5.2.Phương pháp phân lập, xác ñị nh vi khuẩn E.coli từ mẫu bệnh phẩm
Phân lập, xác ựịnh vi khuẩn E. coli theo phương pháp thường quy tại Phòng Vi trùng- Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung Ương.
2.5.3. Phương pháp giám ựịnh ựặc tắnh sinh học của vi khuẩn E. coli
2.5.3.1. Phương pháp phân lập và giám ựịnh vi khuẩn E. coli
Quy trình phân lập và giám ựịnh vi khuẩn E. coli ựược trình bày ở hình 2.1:
2.5.3.2. Giám ựịnh ựặc tắnh sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập ựược
Sau khi các giống vi khuẩn E. coli phân lập ựã thuần khiết, tiến hành giám ựịnh một số ựặc tắnh sinh vật, hóa học cơ bản như: đặc tắnh hình thái, tắnh chất nuôi cấy và các phản ứng lên men ựường theo phương pháp thường quy
- Kiểm tra tắnh chất mọc: Nuôi cấy trên các môi trường cơ bản: Nước thịt, thạch máu, thạch MacConkey quan sát tắnh chất mọc, hình thái, màu sắc khuẩn lạc.
- Kiểm tra hình thái học: Làm tiêu bản nhuộm Gram, quan sát hình thái dưới kắnh hiển vi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 26 - Kiểm tra các ựặc tắnh sinh hóa:
+ Môi trường thạch nghiêng KIA (Kligler Iron Agar): Cho phép kiểm tra khả năng lên men ựường Lactoza, ựường Glucoza, khả năng sinh hơi, sinh H2S.
+ Môi trường TSB: Cho phép kiểm tra khả năng sinh Idol của vi khuẩn nhờ thuốc thử Kowacs.
Hình 2.1. Sơựồ chẩn ựoán thường quy bệnh phù do vi khuẩn E. coli
(Nguồn: Quy trình chẩn ựoán thường quy - Phòng Vi trùng Ờ Trung tâm Chẩn ựoán Thú y Trung Ương)
+ Môi trường Mannitol: Cho phép kiểm tra khả năng lên men ựường
đặc ựiểm dịch tễ Mổ khám Kiểm tra bệnh tắch Phân lập, giám ựịnh sinh hoá Kết luận Bệnh phẩm định týp huyết thanh Kiểm tra lâm sàng Xác ựịnh yếu tốựộc lực F18 và VT2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 27 Mannitol, khả năng di ựộng.
+ Môi trường Cimon citrate: Cho phép kiểm tra khả năng sử dụng citrate. + Môi trường Ure: Cho phép kiểm tra khả năng phân hủy ure.
+ Môi trường Voges Proskauer Ờ Methyl Red (VP- MR).
2.5.3.3. Xác ựịnh khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli
Khả năng dung huyết của vi khuẩn E. coli ựược xác ựịnh bằng phản ứng gây dung huyết trên thạch máu bê 5 Ờ 7%. Vi khuẩn E. coli ựã phân lập ựược ria cấy trên môi trường thạch máu, bồi dưỡng ở 37oC/24 giờ và ựọc kết quả:
- Dung huyết hoàn toàn (β - haemolysin): Xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu to, rõ, có thể nhìn ựược qua môi trường.
- Dung huyết không hoàn toàn (α - haemolysin): Xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu nhỏ.
- Không dung huyết (γ - haemolysin): Xung quanh khuẩn lạc không có vòng tan máu.
2.5.3.4. Xác ựịnh các serotype O của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E.coli có nhiều serotype, nhưng chúng tôi chỉ tiến hành ựịnh type huyết thanh với một số serotype chủ yếu có trong bệnh sưng phù ựầu và tiêu chảy sau cai sữa ở lợn là: O138:K81, O139:K82, O141:K85ab, O141:K85ac, O147, O149, O157, O78:K80, O64:K88; O101:K28, O8:K87, O9:K35.
Serotype của vi khuẩn E. coli ựược xác ựịnh bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh.
- Vật liệu:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 28 + Kháng huyết thanh ựơn giá chuẩn của hãng Veterinary Laboratories Agency.
+ Phiến kắnh sạch. - Tiến hành:
Trên một phiến kắnh sạch, nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E. coli cần xác ựịnh serotype mọc trên thạch máu hoặc một giọt tương ựương canh khuẩn hòa tan vào giọt kháng huyết thanh, ựể yên từ 1-2 phút ở nhiệt ựộ phòng.
- đọc kết quả phản ứng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phản ứng dương tắnh khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn xuất hiện những hạt ngưng kết lấm chấm.
+ Phản ứng âm tắnh khi huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh vẫn ựục ựều không có hạt ngưng kết xuất hiện.
2.5.3.5. Xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E. coli
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các vi khuẩn E. coli ựược xác ựịnh bằng phương pháp kháng sinh ựồ khuếch tán trên thạch.
* Tiến hành:
- Chuẩn bị môi trường thạch kháng sinh Muller Hinton.
- Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn ựã ựược nuôi cấy thuần trên thạch máu, dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1ml dung dịch nước muối sinh lý, ựiều chỉnh ựể huyễn dịch ựạt ựộ ựục chuẩn Mc Farland 0,5 (tương ựương 108 vi khuẩn/ml).
- Sử dụng huyễn dịch cấy lên ựĩa thạch kháng sinh bằng cách láng 0,2ml canh khuẩn khắp bề mặt thạch hoặc dùng tăm bông vô trùng quét ựều trên bề mặt thạch, sau ựó hút phần hỗn dịch thừa ựi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 29 - đặt khoanh giấy kháng sinh: Các khoanh giấy kháng sinh ựược ựặt chắc chắn và cách ựều nhau khoảng 20mm trên mặt ựĩa thạch.
- đĩa thạch ựược ựể ở nhiệt ựộ phòng khoảng 30 phút ựể cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán ựều trong thạch. Sau ựó lật úp ựĩa thạch, ủ 37oC/18 Ờ 20 giờ.
- đọc kết quả: đường kắnh vòng vô khuẩn ựược ựo bằng thước kẹp từ phắa sau mặt ựĩa. Nếu cạnh của vòng vô khuẩn không rõ nét, phải ựo khu vực ức chế xấp xỉ 80% vi khuẩn không mọc ựược. đường kắnh vòng vô khuẩn ựược tắnh bằng mm. đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli theo tiêu chuẩn ựánh giá kết quả của Hội ựồng Quốc gia Hoa Kỳ.
Bảng 2.2. đánh giá kết quảựường kắnh vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Hội ựồng Quốc gia Hoa Kỳ
đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) TT Loại kháng sinh Lượng kháng sinh (ộộộộg) Kháng thuốc Mẫn cảm 1 Amoxicillin/ Clavulanic acid 30 ≤ 13 ≥ 14 2 Colistin 10 ≤8 ≥ 9 3 Ceftiofur 30 ≤17 ≥ 18 4 Enrofloxacin 5 ≤ 16 ≥ 17 5 Gentamycin 10 ≤ 12 ≥ 13 6 Kanamycin 30 ≤13 ≥ 14 7 Norfloxacin 10 ≤12 ≥ 13 8 Streptomycin 10 ≤11 ≥ 12 9 Tetracyclin 30 ≤ 14 ≥ 15 10 Trimethoprim/ Sulfamethroxazol 25 ≤ 15 ≥ 16
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 30