Luận văn thạc sĩ phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn pasteurella multocidagây bệnh tụ huyết trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại vườn thú hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NễNG NGHIỆP HÀ NỘI --- ÂU XUÂN TUẤN Phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NễNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

ÂU XUÂN TUẤN

Phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại Vườn Thú Hà Nội nhằm chọn chủng chế vacxin phòng bệnh

Lêi cam ®oan

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn

Tác giả luận văn

Âu Xuân Tuấn

Lêi cờm ển

để hoàn thành luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi luôn nhận ựược sự quan tâm giúp ựỡ của nhà trường, bạn bè ựồng nghiệp

Trước tiên tôi xin chân thành cám ơn sự giúp ựỡ quý báu của các thầy cô giáo

bộ môn Bệnh lý, các thầy cô giáo khoa Thú y, Viện sau đại học- Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã dành nhiều thời gian và công sức giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ựề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

PGS TS Cù Hữu Phú PGS.TS Nguyễn Hữu Nam

đã tận tình giúp ựỡ, hướng dẫn tôi trong qua trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ựốc Viện Thú y, anh chị em Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y cùng bạn bè ựồng nghiệp và gia ựình ựã giúp ựỡ ựộng viên tôi hoàn thành chương trình học tập cao học và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

Mục lục

2.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm

2.2 Một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida 6

2.4 Triệu chứng, bệnh tích bệnh Tụ huyết trùng gia cầm 23 2.5 Tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Pasteurella

3 Đối tượng - nội dung- nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 30

4.1 Tình hình nhiễm bệnh và tỉ lệ chết của chim, gà cảnh do vi khuẩn

4.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết trùng theo lứa tuổi 47 4.3 Kết quả phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây

bệnh Tụ huyết trùng trên đàn chim, gà tại Vườn Thú Hà Nội 49 4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh: 49 4.3.2 Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn Pasteurella phân lập được 51 4.3.3 Kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh hóa của của vi khuẩn 52 4.4 Kết quả định type các chủng Pasteurella multocida phân lập

4.5 Kết quả xác định độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida

4.6 Kết quả xác định LD50 trên chuột bạch (liều gây chết 50% động

4.7 Kết quả thử kháng sinh đồ các chủng Pasteurella multocida phân

lập được trên đàn chim, gà nuôi tại Vườn thú hà nội 62 4.8 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng

4.8.1 Chế tạo thử nghiệm vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng

bệnh Tụ huyết trùng cho chim, gà cảnh tại Vườn thú Hà nội 65 4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vacxin trên động vật thí

4.8.3 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của vacxin trên gà thả vườn 68 4.7.4 Kết quả thử hiệu lực của Vacxin trên chim, gà tại vườn thú Hà

Nội bằng phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột (Passive

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t vµ ký hiÖu

P multocida: Pasteurella multocida

SDS- PAGE Nadodelcyl sulphate- polyacrylamide

gel electrophoresis DNA Deoxyribonucleic Acid

BHI Brain Heart Infusion

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

ELISA Enzyme – linked Immunosorbant assay

IHA Indirect Haemagglutination test

LPS Lypopolysaccaride

MR Methyl red

PBS Phosphat buffur solution

PCR Polymerase Chain Reaction

LD50 Lethal dosis 50 (Liều g©y chết 50%)

MLD: Minimal lethal Dosis (Liều chÝ tử tối thiểu)

NCCLS National Commitee of Clinical Laboratory Standards

Danh mục bảng

2.1 Các phản ứng sinh hoá học của Pasteurella multocida 11 2-2 Đặc điểm phân biệt các Pasteurella khác nhau 12 2.3 Kết quả định type Pasteurella multocida theo Carter (1955) -

3.1 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng một số loại

4.1 Tình hình nhiễm bệnh và tỉ lệ chết do tụ huyết trùng của chim, gà

4.2 Tỉ lệ chim, gà chết do Tụ huyết trùng theo tuổi ở Vườn Thú Hà Nội 47 4.3 Kết quả phân lập Pasteurella multocida gây bệnh từ chim, gà tại

4.4 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng

4.5 Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường của các chủng vi

khuẩn P multocida phân lập được từ Vườn Thú Hà Nội 54 4.6 So sánh các đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn gây

4.7 Kết quả định type các chủng P multocida phân lập được 57

48 Tổng hợp kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được trên chuột bạch (n= 25) 59 4.9 Kết quả xác định liều LD50 trên chuột bạch của chủng Pas.1VT

4.10 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng P.multocida phân lập được

4.11 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu của lô vacxin 66 4.12 Kết quả kiểm tra an toàn của vacxin trên chuột 67 4.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột bạch 67 4.14 Kết quả thử hiệu lực vacxin Tụ huyết trùng trên gà thả vườn 69 4.15 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin sau khi tiêm 21 ngày bằng phản

Danh mục hình

1 Bệnh tích gà cảnh nuôi tại vườn thú chết do mắc bệnh tụ huyết

2 Tỷ lệ nhiễm bệnh Tụ huyết trùng trên đàn chim, gà cảnh theo lứa

3 Hình thái vi khuẩn P multocida chụp dưới kính hiển vi (độ phóng

1 Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Vườn Thú Hà Nội là một cơ sở nuôi dưỡng và trưng bày động vật phục

vụ khách tham quan nâng cao dân trí Đây còn là cơ sở để nghiên cứu khoa học về động vật, là nơi bảo tồn và nhân nuôi, phát triển nguồn gen quý của nước ta Trong số 96 loài và phân loài động vật đang được nuôi dưỡng tại đây

có 35 loài thuộc diện quý hiếm và đặc hữu được ghi trong sách đỏ Việt Nam Trong nhiều năm qua vườn thú đu tập trung nghiên cứu bảo tồn đàn chim, thú

đặc biệt là các loài chim và gà cảnh Tuy nhiên một trong những khó khăn hiện nay là dịch bệnh còn rải rác xảy ra quanh năm và làm thế nào để phòng chống dịch bệnh có hiệu quả trong điều kiện chăn nuôi của vườn thú

Loài chim và gà cảnh được đưa vào nuôi nhốt trong một không gian chật hẹp, chúng luôn bị tác động bởi các yếu tố stress như: Thời tiết, khí hậu, thức ăn

và các hoạt động xu hội của con người làm thay đổi các tập tính tự nhiên, ảnh hưởng đến sức khoẻ, trạng thái sinh lý, dễ mắc các bệnh truyền nhiễm, dinh dưỡng, nội khoa v.v dẫn đến tử vong Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm các giải pháp và phòng trị bệnh cho các loài này trong điều kiện nuôi nhốt là cần thiết

Một trong những bệnh truyền nhiễm xảy ra với chim và gà cảnh đó là bệnh Tụ huyết trùng (Pasteurellosis) Bệnh đu gây chết chim và gà cảnh đặc biệt trên các loài quý hiếm như gà lôi lam mào trắng, gà lôi lam đuôi trắng, trĩ khoang, công, trĩ sao và đu làm ảnh hưởng lớn đến việc bảo tồn của loài này Vì vậy việc sử dụng vacxin tiêm phòng tạo miễn dịch chủ động là biện pháp quan trọng để phòng bệnh cho đàn chim, gà cảnh

ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới đu ứng dụng nhiều phương pháp chế tạo vacxin và việc chế vacxin đu có nhiều cải tiến Nhưng cho đến nay việc dùng vacxin Tụ huyết trùng gia cầm phòng bệnh cho đàn chim, gà cảnh vẫn chưa cho kết quả phòng bệnh như mong muốn Nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn Pasteurella có cấu trúc kháng nguyên phức tạp, độc lực

thay đổi theo cơ thể động vật và điều kiện môi trường Đây là đặc điểm sinh học quan trọng của mầm bệnh

Vì vậy sử dụng vacxin tự chế (Autovacxin) để nâng cao hiệu lực phòng bệnh của vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng do vi khuẩn Pasteurella gây ra trên đàn chim, gà cảnh nuôi tại vườn thú Hà Nội là một trong những giải pháp tốt để bảo vệ cho đàn chim, gà nuôi tại Vườn thú Hà Nội Dựa trên các cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Phân lập, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở chim và gà cảnh nuôi tại Vườn Thú Hà Nội nhằm chọn chủng chế vacxin phòng bệnh"

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập, xác định một số đặc tính vi sinh vật học quan trọng của các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng cho chim và

gà cảnh nuôi tại Vườn thú Hà Nội

- Chọn chủng vi khuẩn Pasteurella multocida sử dụng chế vacxin phòng bệnh cho đàn chim, gà cảnh nuôi tại Vườn thú Hà Nội

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tế của đề tài

- Xác định được đặc tính vi sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng cho đàn chim và gà cảnh nuôi tại Vườn thú Hà Nội

- Xác lập cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp về bệnh Tụ huyết trùng ở loài chim, gà cảnh đặc hữu của Việt Nam góp phần trong công tác bảo tồn nguồn gen của loài này

- Đáp ứng yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết của Vườn Thú Hà Nội về phòng trị bệnh Tụ huyết trùng của đàn chim và gà cảnh

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng gia súc, gia cầm trên thế giới và trong nước

Theo De Alwis (1992)[35], người đâu tiên phát hiện mầm bệnh gây Tụ huyết trùng gà (Fowl cholera) là Louis Pasteur từ những năm 1880 Sau khi phân lập được mầm bệnh từ xác gà chết, ông đu nuôi cấy trên môi trường nước thịt rồi làm giảm độc lực để chế vacxin phòng bệnh

Năm 1886 nhà giải phẫu học người Đức Hueppe nhận thấy những nét tương đồng của một loại bệnh ở các loài động vật khác nhau được gây ra do cùng một loại vi khuẩn và Trevisan (1887) đu đề nghị đặt tên vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ công lao của Louis Pasteur

Vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc giống (Genus): Pasteurella, loài (Type species): Pasteurella multocida (Bergey’s manual of Determinative bacteriology- 1994) Trước đây vi khuẩn Pasteurella sp được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Micrococcus gallicium (1883), Octopsis cholerae gallinarrum (1885), Pasteurella cholerae gallinarum (1887), Pasteurella avicida (1889), Bacterium bipolar multicidum (1893), Bacterium avicepticus (1912) Đến năm 1939, Rosenbusch và Merchant [61] đặt tên vi khuẩn là Pasteurella multocida và được thế giới chính thức công nhận

Từ đó đến nay nhiều loại Pasteurella mới được liên tục được xác định:

P haemolytica (1932); P pneumotropica (1950); P gallinarum (1955);

P uerae (1962) nay gọi là Actinobacillus ureae và loại vi khuẩn sinh khí

P aeroganis (1974)

Bệnh Tụ huyết trùng do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra ở tất cả các loại gia cầm, các loại chim, gia cầm

và có mặt khắp thế giới Bệnh thường xảy ra ở thể nhiễm trùng máu với tỉ lệ chết cao Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế, theo đánh giá ở Mỹ chỉ riêng bệnh

Tụ huyết trùng gia cầm đu thiệt hại 200 triệu đô la vào năm 1986 (Ratafia) Bệnh còn là mối đe doạ tới sự tồn tại của các loài chim hoang du đang dần bị tiệt chủng

Từ những năm 1870, bệnh thường được gọi Avian cholera khi nó có liên quan đến chim hoang du ngoài ra bệnh còn được gọi là Avian cholera, Avian pasteurellosis, Avian hemorraghic septicemia, Pasteurella avicida và Bird cholera

Bệnh Tụ huyết trùng đu được Chabert nghiên cứu lần đầu tiên ở Pháp vào năm 1780, theo thông báo bệnh này hoành hành ở phía Đông ấn độ vào năm 1817 và xảy ra liên tục ở Pháp vào giữa những năm 1825 và 1900 Năm

1836 Maillet đu đặt tên là Fowl cholera

Năm 1932 Devolt và Davis lần đầu tiên miêu tả bệnh Tụ huyết trùng ở gà tây Theo nghiên cứu của Anonymous (1867)[17], Salmon (1899) [64] và Gray (1913)[39] tất cả các chim hoang du là những nguồn lây nhiễm cho gà nhà

ở Việt nam, theo tác giả Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958) bệnh Tụ huyết trùng trâu bò được phát hiện vào năm 1868 bởi Coudaminae ở

Bà Rịa, Long Thành

Năm 1869, Gemai đu phát hiện bệnh ở Gò Công, Yersin (1869) phát hiện bệnh ở các tỉnh Trung bộ Năm 1901 Shesin đu xác nhận có bệnh này ở Tây Ninh Những năm sau này Nguyễn Vĩnh Phước (1978)[10], Hoàng Đạo Phấn (1986) [9] đu nghiên cứu về đặc tính của Pasteurella multocida và typ huyết thanh học của chúng

Theo Nguyễn Xuân Bình (1995)[1] bệnh Tụ huyết trùng ở Long An trên

gà 30 ngày tuổi tỉ lệ mắc thấp là 0,97%; giai đoạn 31- 60 ngày tuổi mắc cao nhất 8,44%; giai đoạn trên 60 ngày tuổi mắc thấp hơn (5,08%)

Theo Lê Lập (1996) [5] tỷ lệ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida trên gia cầm ở một số tỉnh miền Trung trung bình là 12,5%

Dương Thế Long và Lê Văn Tạo,(1995)[6] nghiên cứu phân lập được các chủng P multocida M35; M36, Q16 ở Sơn La đu có kết luận M35, Q16, thuộc type A, M36 thuộc type D

Để nâng cao hiệu lực của vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng, Phan Thanh Phượng (1993)[12] đu nghiên cứu chế tạo vacxin Tụ huyết trùng gia cầm

từ chủng N41, tác giả Lê lập (1996)[5] nghiên cứu một số đặc tính sinh học và miễn dịch của vacxin N41và các chủng của Pasteurella multocida phân lập ở gia cầm ở một số tỉnh miền Trung, nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng vacxin

Bệnh tụ huyết trùng gia súc, gia cầm là những đề tài đu được nghiên cứu từ rất sớm, Phan Thanh Phượng (1989)[11] nghiên cứu về cơ sở miễn dịch

và dịch tễ điều khiển phòng chống đặc hiệu bệnh Tụ huyết trùng gia súc và gia cầm ở Việt nam, Nguyễn Ngu (1994)[7] nghiên cứu về tính kháng nguyên và

độc lực vi trùng ở khu vực miền Trung Nguyễn Thiên Thu (1996)[14] nghiên cứu về khả năng mang khuẩn tụ huyết trùng ở trâu bò miền trung Qua kết quả nghiên cứu đu đưa ra được nhiều những thành tựu mang ý nghĩa khoa học, thực tiễn Song do bản chất phức tạp về dịch tễ, cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida và độ mẫn cảm theo từng loài nên cho đến nay bệnh Tụ huyết trùng vẫn là bệnh gây thiệt hại về kinh tế cho ngành chăn nuôi

Đối với các loài gà cảnh và chim hoang việc nghiên cứu các bệnh gây hại cho các loài này ngoài thiên nhiên, cũng như nuôi nhốt trong các vườn thú còn ít hoặc không có sẵn những thông tin trên thế giới, vì loài này là một loài

đặc hữu của Việt Nam Theo Đặng Gia Tùng và cs (1998)[16], qua kết quả

điều tra từ năm 1997 đến nay thấy rằng bệnh Tụ huyết trùng xảy ra rải rác quanh năm, song tập trung vào tháng 6- 8 chiếm 52,5% so với tổng số ca mắc bệnh Tụ huyết trùng trong cả năm Hầu hết các cá thể trong loài đều rất mẫn

cảm với bệnh này Bệnh gây thiệt hại về kinh tế cũng như làm giảm số lượng cá thể loài dẫn đến nguy cơ tiệt chủng của các loài gà cảnh, chim quý hiếm

đặc hữu của nước ta, gây ảnh trực tiếp đến công tác bảo tồn các loài này 2.2 Một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida

2.2.1 Hình thái vi khuẩn và hình dạng khuẩn lạc

Pasteurella sp là loại cầu trực khuẩn ngắn gram âm, bắt màu rõ ở hai

đầu, không di động, không hình thành nha bào Kích thước vi khuẩn từ 0,6- 2,5à x 0,2- 0,4à, vi khuẩn thường đứng riêng lẻ, đôi khi ghép đôi hoặc tạo thành chuỗi ngắn (Pasteur, 1880)[71]; (Breed và cộng sự, 1952)[23]

Kích thước và hình thái vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng (Smith,1959)[65] Theo một số tác giả khác như Carter, 1967[29]; Rhoades và Rimler, 1992 [53], Rhoades, Rimler và Sandhu, 1992 [54], hình thái vi khuẩn có xu hướng không ổn định trong quá trình nuôi cấy, nếu nuôi cấy trong điều kiện không thuận lợi, hoặc cấy truyền nhiều lần, vi khuẩn có hình sợi chỉ mặt khác, hình thái vi khuẩn còn thay đổi tuỳ theo sự hình thành giáp mô của nó Các vi khuẩn có giáp mô thường lớn hơn các vi khuẩn không

có giáp mô

Vi khuẩn Pasteurella trong các bệnh phẩm máu, các tổ chức của gia súc, gia cầm bị bệnh, các canh khuẩn mới phân lập từ gia cầm mắc bệnh hoặc chết trong các ổ dịch, được nhuộm bằng thuốc nhuộm Anilin thường bắt màu lưỡng cực rõ rệt, nhuộm gram vi khuẩn bắt màu gram âm Tính bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn là do tế bào đang trong thời kỳ sinh sản, trước khi phân chia

có sự tích tụ vật chất trong nguyên sinh chất tập trung ở 2 đầu, nên khi nhuộm bằng Giemsa hoặc các thuốc nhuộm Anilin hoà tan khác tế bào vi khuẩn sẽ bắt màu rõ ở hai đầu, còn phần giữa vi khuẩn không bắt màu

Theo Wei và Carter, 1978 [67] tính bắt màu lưỡng cực liên quan đến vị trí của thể Chromatin trong vi khuẩn P multocida

Hình thái khuẩn lạc: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch Dextrose Starch agar (DSA) ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ hình thành các khuẩn lạc hình tròn, trơn, láng, đường kình từ 1- 3mm, canh khuẩn có mùi đặc trưng (Rhoades và cộng sự, 1992)[53]

Trên môi trường có bổ xung 10% máu cừu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc to hơn, để vài ngày trong phòng vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc từ 1- 2mm

Theo Rhoades và Rimler, 1992 [53], nếu nuôi cấy lâu ngày, khuẩn lạc

sẽ to, nhớt và dính Khi cấy chuyển liên tục, giáp mô bị mất, khuẩn lạc nhỏ hơn, không mầu và trong suốt

Theo Hoàng Đạo Phấn,1986 [9] khi nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella mutocia trên môi trường thạch đĩa ngày đầu vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ dạng lồi, trơn, bóng Khi nuôi cấy lâu ngày thì khuẩn lạc trở nên trắng hơn, bám sâu vào mặt thạch, kích thước khuẩn lạc từ 1,0- 2,0 mm

Hình dạng kích thước của khuẩn lạc còn phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy Một số chủng vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc xù xì, nhưng nuôi cấy trên môi trường có thêm huyết thanh thì có thể tạo ra khuẩn lạc trơn, bóng láng và có dung quang sắc cầu vồng

Nghiên cứu khuẩn lạc P multocida, Carter, 1958 [26], Namioka và Murata, 1961 [50], Heddleston, 1975 [44] đu phân biệt ba dạng khuẩn lạc cơ bản là:

- Dạng S (Smooth): Khuẩn lạc trơn, láng, lóng lánh, có dung quang sắc cầu vồng (Iridescence)

- Dạng M (Mucoid): Khuẩn lạc nhầy, ướt có dung quang sắc cầu vồng yếu hơn

- Dạng R (Rough): Khuẩn lạc xù xì thường có dung quang màu xanh Heddleston và cộng sự, 1964 [46] cho thấy, những khuẩn lạc có dung

quang của vi khuẩn mới phân lập được, thường đồng đều phát quang, có xu hướng dính vào nhau Khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ thể bệnh mun tính thường có dung quang mầu xanh

Theo Rimler, 1992 [59] khuẩn lạc vi khuẩn P multocida chủ yếu ở 2 dạng là khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc có dung quang mầu xanh (Blue) Những khuẩn lạc có dung quang mầu xanh thường không có hoặc có ít giáp mô, không có độc lực hoặc có ít độc lực, khuẩn lạc dạng R có dung quang màu xanh lơ

Hughes (1930) nghiên cứu hình thái khuẩn lạc của 210 chủng P multocida phân lập từ gà, tác giả chia làm 3 type: Type thứ nhất có dung quang, gây bệnh cấp tính, với tỷ lệ chết cao, type thứ 2, các khuẩn lạc có ánh xanh, độc lực thấp, gây bệnh nhẹ Type thứ ba có tính chất trung gian giữa 2 type trên về dung quang và độc lực

Rosenbusch và Merchant, 1939 [62] cho biết, vi khuẩn P multocida nuôi cấy trên thạch máu hay tiêm truyền qua động vật, thấy khuẩn lạc tăng cường độ dung quang Các chủng cường độc, mới phân lập có dung quang mạnh Tác giả cho rằng hiện tượng dung quang của khuẩn lạc liên quan tới tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng có bước sóng nhất định có trong vi khuẩn Hiện tượng sắc cầu vồng có liên quan tới khả năng tạo giáp mô vi khuẩn

2.2.2 Đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn Pasteurella multocida

2.2.2.1 Đặc tính nuôi cấy và môi trường dinh dưỡng vi khuẩn

Pasteurella multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, nhưng thích hợp ở môi trường hiếu khí hơn, đặc biệt cộng thêm 5% Carbon dioxide- CO2 (Carter, 1984) [32] Vi khuẩn mọc tốt ở nhiệt độ 37- 38 0C, pH hơi kiềm từ 7,2 đến 7,4 Vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn nếu bổ xung thêm 10% huyết thanh động vật Môi trường tốt nhất để nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella

multocida là thạch Hottinger với 10% máu cừu, 10% chiết xuất ngô

Theo Hoàng Đạo Phấn, 1986 [9] vi khuẩn Pasteurella multocida mọc tốt trong môi trường nước thịt pepton, sau một ngày đêm vi khuẩn làm đục môi trường vài ngày sau nước thịt trở nên trong, đáy có cặn nhày lắc khó tan, trên mặt môi trường có một lớp màng mỏng khi lắc lớp màng này vỡ ra Tác giả còn cho thấy rằng: Vi khuẩn mới được phân lập mọc tốt trong các môi trường thông thường, nhưng khi nuôi cấy tiếp tục sẽ mọc yếu, vì vậy phải cho thêm vào môi trường nuôi cấy huyết thanh, điều này giải thích sự cần thiết của việc cấy chuyển vi khuẩn qua thạch máu khi giữ giống tươi

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường lỏng có thể dùng phương pháp sục khí để tăng cường sự phát triển của vi khuẩn Pasteurella multocida Khi so sánh phương pháp nuôi cấy tĩnh và phương pháp sục khí thấy lượng vi khuẩn tăng 20 lần ở cùng loại môi trường Người ta đu áp dụng phương pháp nuôi cấy này để tăng số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn nhằm rút ngắn thời gian nuôi cấy và giảm liều lượng tiêm vacxin trong sản xuất vacxin

2.2.2.2 Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida

Vi khuẩn thực hiện qúa trình trao đổi chất với môi trường dinh dưỡng nhờ các phản ứng sinh hoá học xảy ra trong tế bào Các sản phẩm trung gian

được tạo thành làm thay đổi độ pH của môi trường Phản ứng sinh hoá mang tính đặc trưng cho mỗi giống, loại vi khuẩn Do đó phản ứng sinh hoá được dùng để định danh vi khuẩn

Đặc tính sinh hoá học của Pasteurella multocida đu được nhiều tác giả nghiên cứu Lignieres, (1900)[70] cho biết Pasteurella multocida không làm tan chảy Gelatin, không phân giải Lactose, không sinh Indol

Rosenbusch và Merchant, 1939 [62] nghiên cứu sự lên men đường đu chia P multocida thành 3 nhóm

- Nhóm 1: gồm các chủng P multocida phân giải Arabinose và Dulcitol, không phân giải Xylose

- Nhóm 2: gồm các chủng phân giải Xylose, không phân giải Arabinose

đều sinh Indol, không di động, không dung huyết và không phân giải Urea

Dorsey, 1963 [37] nghiên cứu 409 mẫu P multocida phân lập từ gia cầm cho thấy 81,42% thuộc nhóm I; 16,87% thuộc nhóm II; 1,71% thuộc nhóm III Ngoài ra có 23 mẫu phân lập không thể xếp loại

Theo Carter, 1984 [32] Vi khuẩn Pasteurella multocida dương tính trong các phản ứng Nitrat, Indol, Oxydaza, Catalaza Âm tính trong các phản ứng dung huyết, di động, Gelatin, MacConkey, không lên men các loại đường Lactoza, Mantoza, Arbinoza, Dulcitol Khả năng lên men Saccaroza và Mannit, không lên men Lactoza là rất quan trọng để phân biệt Pasteurella multocida với Salmonella (không lên men Saccaroza) và với Ecoli, P.haemolytica (lên men Lactoza) Heddleston và cộng sự, 1972 [44] nghiên cứu 948 mẫu P multocida phân lập từ gia cầm, kết quả phản ứng sinh hoá học như bảng trang sau:

B¶ng 2.1 C¸c ph¶n øng sinh ho¸ häc cña Pasteurella multocida

Bảng 2-2 Đặc điểm phân biệt các Pasteurella khác nhau

Pasreurella Phản ứng

multocida haemolytica anatipestifer gallinarum

2.2.3 Kháng nguyên và độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida

Pasteurella là loại vi khuẩn sinh giáp mô, đó chính là yếu tố độc lực của chúng Theo Carter, 1967 [29], đa số các trường hợp vi khuẩn phân lập từ

động vật mắc bệnh cấp tính có giáp mô và có độc lực Khi nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trường thông thường, để lâu vi khuẩn sẽ mất giáp mô và mất độc lực Những vi khuẩn mất giáp mô được nuôi cấy trên môi trường có thêm máu, hoặc tiêm truyền qua động vật, có thể tái tạo lại giáp mô và biểu hiện độc lực

Carter, 1955 [25] cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trên môi

trường nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn hình thành giáp mô, sau đó mất dần đi chứng tỏ giáp mô chỉ có ở canh khuẩn mới nuôi cấy

Bain và De Alwis, 1982 [19] nhận thấy có thể phân lập cả vi khuẩn có giáp mô và không có giáp mô từ cơ thể động vật mắc bệnh Tụ huyết trùng Nếu nuôi cấy ở 370C với môi trường cơ bản có chứa 0,05% Glucose, thì giáp mô phát triển tốt Ngược lại nếu môi trường chứa nhiều Glucose và ở nhiệt độ

280C thì không hình thành giáp mô

Theo Manninger, 1919 [48] độc lực P multocida rất phức tạp và không

ổn định, tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn cũng như loài vật cảm thụ bệnh Tác giả khẳng định vi khuẩn xâm nhập vào ký chủ và phát triển trong ký chủ là nhờ có giáp mô Vi khuẩn mất khả năng tái tạo giáp mô sẽ không còn độc lực Mặt khác, tác giả nhận thấy một số chủng vi khuẩn có giáp mô nhưng độc lực yếu, vì độc lực vi khuẩn có thể còn phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp mô và kháng nguyên thân Giáp mô của P multocida là Polysaccharicde, Lipopolysaccharide và một phức hợp Protein (Rimler và Rhoades, 1989) [58]

Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên giáp mô, bằng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu, Carter, 1955 [25], Rimler và Rhoades, 1987 [57] đu phân chia P multocida thành 5 Serotype kháng nguyên giáp mô khác nhau là Serotype A, B, D, E và F

Woolcock, 1992 [68] cho rằng giáp mô của P multocida type A cấu tạo bởi Acid Hyaluronic có liên kết mật thiết với các thành phần khác như Polysaccharide, Protein và Lypit

Acid Hyaluronic không gây hoạt hóa kháng thực bào nhưng chất tiết giáp mô có thể ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân bò (Ryu và cộng sự, 1984)[63] Nếu tách Acid Hyaluronic khỏi giáp mô sẽ tăng khả năng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào động vật và tăng tính mẫn cảm của vi khuẩn đối với đại thực bào

Theo nghiên cứu của Bain, 1954 [18] thì thành phần giáp mô có chứa Acid Hyaluronic và một lớp Polysaccharide giáp mô là yếu tố bề mặt quan trọng không chỉ đối với P multocida mà còn đối với một số vi khuẩn gram âm gây độc khác Nhưng nếu chiết tách Polysaccharide tinh khiết thì không gây

độc và không bảo vệ được chuột hay thỏ

Theo Esslinger và cộng sự, 1992 [38], các chủng P multocida Serotype

A đều có tính bám dính mạnh đối với tế bào Hela, trong khi đó các Serotype B,D,E có độ bám dính thấp hơn nhiều

Theo Snipes và Hirsh, 1986 [66], giáp mô vi khuẩn P multocida có khả năng hoạt hoá bổ thể, sự hoạt hoá bổ thể không ảnh hưởng đến vai trò của các

tế bào đại thực bào đối với vi khuẩn

Để quan sát giáp mô người ta nhuộm vi khuẩn bằng mực ấn Độ, hoặc dùng phương pháp nhuộm Hiss Có thể nhận dạng giáp mô bằng quan sát dung quang khuẩn lạc, theo Rimler, 1992 [59] nếu các khuẩn lạc có dung quang sắc cầu vồng (Iridescence) thì vi khuẩn có giáp mô

Kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida và vai trò của nó trong đáp ứng miễn dịch:

Cấu trúc kháng nguyên của Pasteurella multocida phức tạp và hay thay

đổi, cho đến nay người ta đu xác định kháng nguyên của Pasteurella multocida bao gồm có hai loại chính:

- Kháng nguyên vỏ (K) (capsule)

- Kháng nguyên thân (O) (Somatic)

Để nhận biết một cách đầy đủ về kháng nguyên Pasteurella multocida cần phải khái quát đầy đủ các mặt như: Số lượng kháng nguyên, loại, tính chất Từ đó chọn lựa phương pháp chẩn đoán huyết thanh học và nghiên cứu vai trò sinh miễn dịch từng loại kháng nguyên, phương pháp chế tạo vacxin phòng bệnh

a Số lượng kháng nguyên:

Trong những công trình nghiên cứu trước đây, với phản ứng khuyếch tán trên thạch có sử dụng kháng nguyên xử lý axit toàn bộ tế bào vi khuẩn đu thấy được 12 kháng nguyên

Năm 1966 Price và Smith, [52] đu dùng phương pháp miễn dịch điện di bằng máy lắc Mikle tách được 16 kháng nguyên kí tự từ a-n Hai kháng nguyên giáp mô là α và β và một kháng nguyên thứ ba γ được coi là kháng nguyên thân Phản ứng huyết thanh chéo giữa Pasteurella và các vi khuẩn gram âm khác đu được làm sáng tỏ bởi Prince và Smith (1966) [52], theo các tác giả thì thì phản ứng chéo không chỉ do kháng nguyên, mà còn do lớp kháng nguyên nằm sâu hơn a-n Tác giả cũng cho rằng tất cả 16 kháng nguyên hoà tan của Pasteurella multocida mà nằm sâu hơn trong vi khuẩn là có liên quan đến các chủng của bò và gia cầm

b Cấu trúc kháng nguyên:

Với những phương pháp khác nhau các nhà khoa học đu xác định cấu trúc của các loại kháng nguyên: Polysaccharide (CPS), Lypopolysaccharide (LPS), kháng nguyên Protein, Acid amin

+ Lypopolysaccharides (LPS): LPS của vi khuẩn Pasteurella multocida

có tính chất về hoá học và sinh học giống như trong nhiều loài vi khuẩn gram

âm như những kháng nguyên LPS đu có liên quan đến sự tạo kháng thể bảo vệ cho động vật và cũng đu được dùng như cơ sở hoá học cho hệ thống phân loại kháng nguyên thân LPS thì đu được chiết tách từ nhiều chủng khác nhau của

vi khuẩn Pasteurella multocida, tương tự như vậy thì LPS cũng được chiết tách từ những vi khuẩn cùng họ, những phân tích về hoá học thấy thành phần LPS từ Pasteurella multocida bao gồm lipid A, 2-keto-3-deoxyoctonate (KDO), l- glycero-D-mannoheptose, glucose và glucosamine ( Rimler và cộng

sự 1987 [55])

Những loại đường khác như Galactose, Rhamnose, mannoheptose và Galactosamine cũng thường thấy trong LPS của những chủng Pasteurella khác nhau Ngoài ra còn có 4 typ đường khác đu được nhận diện bởi Erler và cộng sự (1977)

D-glycero-D-Rimler và Rhoades, (1989)[58] cho rằng: LPS tinh khiết không gây

được miễn dịch tạo kháng thể ở chuột, trâu bò và thỏ, nhưng là chất gây miễn dịch chính chống lại bệnh Tụ huyết trùng của gà tây là phức hợp kháng nguyên Protein - Lypopolysaccharide

+ Polysaccharide tinh khiết (CPS ):

CPS tinh khiết của vi khuẩn Pasteurella multocida là một kháng nguyên

và nó có thể phản ứng kích thích taọ kháng thể chống lại toàn bộ vi khuẩn Riêng một mìmh CPS tinh khiết sản sinh ra một ít hay không có hoạt động sinh miễn dịch bảo vệ cho chuột (Bainvà Knox, 1961; Reber và Heddleston 1974; Schmerr

và Rebers, 1979) hay trâu, bò chống lại những vi khuẩn đồng typ

ở gia cầm, LPS từ một vài serotyp có khả năng sản sinh ra kháng thể trong khi một số serotype khác không sản sinh kháng thể CPS tinh khiết được chiết tách từ chủng phân lập từ chim đu bảo vệ được gà chống lại thử thách với vi khuẩn đồng chủng (Rimler, 1987 [55])

Vị trí và phương pháp tiêm đóng một vai trò quan trọng cho sự sản sinh kháng thể ở gà chống lại Polysaccharide tinh khiết (Rimler, 1984; Rimler và Brown, 1982; Rimler và Phillips, 1986) việc tiêm truyền LPS vào tĩnh mạch

đu tạo được miễn dịch, trong khi đó bằng những đường khác thì không tạo

được miễn dịch, mặt khác khi dùng nguyên CPS một mình thì không thành công trong quá trình tiêm truyền mà kết hợp CPS-sensitized erythrocytes hay phức hợp CPS với methylated albumin hay Ribosomes hay protein ribosome thì đu có kết quả trong việc sản sinh kháng thể (Rimler và cộng sự, 1986 [55]) Như vậy tính chất tạo kháng thể của CPS đặc biệt có khả năng liên quan tới

thành phần hoá học cũng như cấu trúc của chúng

+ Protein màng (Outer or Inner membranes):

Màng trong hay màng ngoài của vi khuẩn Pasteurella multocida chưa

được tách lọc và những nghiên cứu về thành phần protein cho đến nay còn rất khó khăn Lugtenberg và cộng sự (1984) đu phân tích màng tế bào trên 34 chủng Pasteurella multocida từ lợn bởi Nadodelcyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) Ba mẫu protein riêng biệt đu được nhận biết trên cơ sở biến đổi của một Protein nhất định (H - protein) đu được tìm ra trong khoảng từ 28 - 40 kDa (Kilodalton) H- protein đu có tính chất tương tự như các protein đu được nghiên cứu trong vi khuẩn khác, nó không thể hoà tan

được trong dung dịch Triton X100 Mg++, và ngăn cản sự sử lý trypsin và được hoà tan trong SDS ở 370C

Truscott và Hirsh, 1990 đu tinh chế thành công một protein màng ngoài (kDa) từ vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập ở chim, tác giả cho thấy protein này ức chế khả năng thực bào của các tế bào đại thực bào ở chim Sự khác nhau giữa các protein màng ngoài của các chủng trong cùng một serotype phân lập từ bệnh Tụ huyết trùng gia cầm là ở vị trí gắn một protein ở vùng thứ 34 -38 kDa Protein này phản ứng với huyết thanh miễn dịch của gà kháng Pasteurella multocida cùng serotyp

Tuy nhiên với các kỹ thuật kháng thể đơn dòng và miễn dịch Enzyme (ELISA), Ramdani và Adler, 1992 đu nghiên cứu các kháng nguyên protein tinh khiết của Pasteurella multocida chủng M1404 (P-42; P-33; P-29) và các kháng thể đơn dòng tương ứng (DM-1; DM-2; DM- 4) cho thấy kết quả là cả 3 kháng thể đơn dòng đều không bảo vệ được chuột khi thử thách với Pasteurella multocida, gây miễn dịch chủ động bằng kháng nguyên P-42; P-33; P-29 cho chuột chỉ bảo hộ từ 30 đến 60% sau khi thử thách cường độc qua

đó tác giả kết luận rằng Protein tinh khiết chỉ đóng vai trò rất nhỏ trong đáp

ứng miễn dịch chống nhiễm khuẩn Pasteurella multocida

+ Độc tố protein (Protein toxins):

Rimler và Brogden, (1986)[56] đu chứng minh rằng độc tố Protein trong serogroup A hay D thì được tìm thấy ngay sau khi phân lập, cho dù vậy thì sản phẩm này xuất hiện trong serotype nhóm Avà D, không có sự tương quan nào

được tìm thấy giữa sự sản sinh độc tố và serotype thân, protein độc tố của vi khuẩn Pasteurella multocida đu được tìm thấy khi phân lập các chủng từ lợn, trâu, bò, cừu, thỏ, mèo, chó và gà tây (De jong và cộng sự, 1985[36]; Kielstein, 1986; Nielson và cộng sự,1986;

Nghiên cứu của Rimler và Brogden (1986) [55] đu chỉ ra rằng kháng huyết thanh đu được chế từ chủng thuộc serogroup D ở lợn đu trung hoà hiệu ứng gây chết của độc tố từ thỏ serotyp nhóm D, lợn chủng serotyp nhóm A, và

D từ vùng địa lý khác nhau Kết quả là protein độc tố của những chủng serotyp nhóm A và D tương tự nhau về mặt kháng nguyên Những protein độc

tố gây xuất huyết và hoại tử trên da chuột lang, chúng gây chết cho chuột cống, chuột lang, lợn, gà tây

2.2.4 Serotype Pasteurella multocida

Serotype Pasteurella multocida đu được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

và có những đánh giá chung Xác định Serotype P multocida dựa trên hai phương pháp chủ yếu là phương pháp miễn dịch và phi miễn dịch

Litte và Lyon, 1943 [46] dùng phản ứng ngưng kết trên phiến kính chia

P multocida là 3 type: 1; 2; 3

Hiện nay việc xác định Serotype của P multocida gồm 2 hệ thống là:

Hệ thống dựa vào kháng nguyên giáp mô (Capsule) và hệ thống dựa vào kháng nguyên thân (Somatic)

*Định type kháng nguyên giáp mô:

Roberts, 1947 [60] Dựa vào phản ứng bảo hộ trên chuột đề xuất 4 type huyết thanh P multocida gồm type I, II, III, IV Husson, 1954 [45] đề xuất thêm type V

Carter, 1952 [24] sử dụng phản ứng kết tủa, năm 1955 [25] dùng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu IHA (Indirect Haemagglutination Test) để

định type P multocida Tác giả chia P multocida thành 4 type khác nhau là:

A, B, C, D kháng huyết thanh điều chế từ thỏ, năm 1961 [27] tác giả đề xuất thêm type E, năm 1963 [28] đề nghị bỏ type C

Rimler và Rhoade, 1987 [57] đề xuất thêm type F Do đó hệ thống định type kháng nguyên giáp mô của Carter gồm 5 type A, B, D, E, F

Theo De Alwis, 1992 [35] P multocida gây bệnh Tụ huyết trùng gia cầm thuộc type A, D, F trong đó A là chủ yếu

* Định type kháng nguyên thân:

Namioka và Murata, 1961[50] dùng phương pháp kết tủa trong ống nghiệm xác định type kháng nguyên thân Kháng nguyên được xử lý bằng acid HCl, tác giả đề xuất 11 Serotype ký hiệu từ 1- 11

Bảng 2.3 Kết quả định type Pasteurella multocida

theo Carter (1955) - Namioka (1961) Type

giáp mô

1.A Viêm phổi (Bò, cừu, lợn) 3.A Viêm phổi lợn

1; 3; 5; 7; 8; 9 7.A Nhiễm trùng máu Bò

8.A Tụ huyết trùng gia cầm 9.A nt

11.B Nhiễm trùng vết thương bò 1.D Viêm phổi lợn

D 1; 2; 3; 4; 10 2.D; 10.D Viêm phổi lợn

3.D Viêm phổi mèo 4.D Viêm phổi cừu, lợn

Heddleston và cộng sự, 1972 [42] bằng kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch AGPT (Agar gel precipitin test) đu chia kháng nguyên thân P multocida thành 16 Serotype, ký hiệu từ 1- 16

Tuy nhiên các kỹ thuật định type nói trên không cho kết quả giống nhau, một mẫu vi khuẩn cho một Serotype với kỹ thuật này, nhưng có thể cho nhiều Serotype với kỹ thuật khác Vậy một chủng vi khuẩn có thể có kháng nguyên giáp mô (K) giống nhau, nhưng lại có các kháng nguyên thân (O)

khác nhau và ngược lại Theo quy định của FAO, để xác định Serotype vi khuẩn Tụ huyết trùng theo kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân có 2

hệ thống định type P multocida phổ biến là: Namioka (1961) - Carter (1955)

và Carter (1955) - Heddletson (1972)

Theo hệ thống định type này các chủng vi khuẩn gây bệnh Tụ huyết trùng gia cầm phần lớn thuộc các Serotype 5.A; 8.A; 9.A

Bảng 2.4 Kết quả định type P multocida Carter (1955)- Heddleston (1972)

1, 4, 3 A.1; A.3; A.4 Tụ huyết trùng gà

A 7- 10 A.7;A.8;A.9;A.10 Tụ huyết trùng gà

12- 15 A.12;A.13;A.15 Tụ huyết trùng gà

B 2 B.2 Tụ huyết trùng trâu, bò

2.2.4.2 Định type bằng phương pháp phi miễn dịch (huyết thanh học):

- Xác định type A bằng phản ứng khử giáp mô bởi men Hyaluronidase:

Giáp mô của P multocida Serotype Acó chứa acid Hyaluronic, làm cho khuẩn lạc to và nhầy Carter và Rundell, 1975 [31] nhận thấy các khuẩn lạc này sẽ bị nhỏ lại khi có tác dụng của men Hyaluronidase, men này do một số loài vi khuẩn tạo ra như Staphylococcus aureus, Streptococcus từ đó ông đề xuất kỹ thuật xác định Pasteurella multocida Serotype A bằng cách nuôi cấy

vi khuẩn phân lập thành đường chữ chi trên môi trường thạch máu, sau đó cấy

Staphylococcus aureus thành một đường thẳng góc với đường cấy vi khuẩn

phân lập, những khuẩn lạc Serotype A mọc gần đường phát triển của

Staphylococcus aureus bị thu nhỏ và dung quang màu xanh

- Xác định type D bằng phản ứng kết tủa bông với Acriflavine

Carter và Subronto, 1973 [30] nhận thấy canh khuẩn P multocida

Serotype D nuôi cấy 24 giờ sau khi ly tâm có phản ứng kết tủa bông thành

đám lớn với dung dịch Acriflavine 0,1% sau 5 phút, phản ứng dừng lại sau 30

phút Từ tính chất này ông đề ra kỹ thuật định type D bằng phản ứng kết tủa

bông với Acriflavine

Hiểu một cách đầy đủ cấu trúc kháng nguyên và Serotype của

P multocida có ý nghĩa quyết định đối với việc chế tạo vacxin phòng bệnh Tụ

huyết trùng Một vacxin gây miễn dịch đặc hiệu phải được chế tạo từ các

chủng kháng nguyên tương đồng với các chủng vi khuẩn P multocida phân

lập được trên thực địa

2.3 Dịch tễ học và con đường truyền bệnh

* Dịch tễ học:

Bệnh Tụ huyết trùng phân bố rộng trên thế giới và xảy ra ở hầu hết các

quốc gia chăn nuôi gia cầm trên thế giới Thông báo mang tính quốc tế gần

đây về sự phân bố bệnh Tụ huyết trùng năm 1986 đu chỉ ra rằng có dịch bệnh

ở Châu Mỹ, Châu Phi, Châu á, Châu Âu (Anoymos,1867)[17] Bệnh thường

xảy ra lẻ tẻ ở các nước đu từng có dịch bệnh trước đó, bệnh thay đổi ở các địa

phương và nổ ra từ năm này qua năm khác đặc biệt ở gia cầm như: gà, gà tây,

vịt, ngỗng Tuy nhiên bệnh cũng xảy ra ở các loài chim hoang du, chim cảnh,

chim nhốt lồng, chim cảnh họ trĩ, phần lớn các loài chim hoang du đều lây

nhiễm với vi khuẩn Pasteurella multocida (Heddleson và cộng sự, (1972)[42];

Rosen, (1971)[61]) cho rằng các loại chim hoang đều mẫn cảm với bệnh này

Mức độ mẫn cảm khác nhau giữa các loài chim và theo nhóm tuổi trong loài

Gà tây mẫn cảm hơn gà nhà Loài chim nước hoang du, bồ câu, chim sáo, và loài vẹt Anh thì mẫn cảm rất cao (Gray, 1913 [39]; Ronsen, 1971 [61]), nhưng cho đến nay có ít thông tin về khả năng mẫn cảm của các loài chim hoang du khác Những gà trưởng thành thì mẫn cảm với bệnh Tụ huyết trùng hơn gà non (Heddleston, 1972 [43])

Pritchett và Hugher (1932) thông báo rằng P multocida thường xâm nhập vào cơ thể gia cầm qua niêm mạc hầu, họng, đường hô hấp và vết thương trên da

Các tác giả Vanes, Olney, Hall đu chứng minh rằng những con sống sót sau một vụ dịch có thể chính là ổ chứa mầm bệnh Tác giả nghiên cứu 200 phôi gà từ gà mái nhiễm bệnh cho thấy P multocida không lây chuyền qua trứng Iliew (1963) cho thấy, những chủng phân lập từ bò, lợn không gây bệnh cho gia cầm Nhưng 18 chủng phân lập từ lợn ở vùng có bệnh thường xuyên thấy khả năng gây bệnh cho gia cầm rất cao Các bao bì đựng thức ăn và dụng

cụ chăn nuôi có thể là nhân tố trung gian truyền lây

2.4 Triệu chứng, bệnh tích bệnh Tụ huyết trùng gia cầm

2.4.1 Triệu chứng bệnh

Theo Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 [10] thời gian nung bệnh của Tụ huyết trùng gia cầm thường chỉ 1- 2 ngày ở gà lớn có thể từ 3- 4 ngày Cũng có trường hợp xuất hiện triệu chứng muộn đến vài tuần sau khi chịu ảnh hưởng

của tác nhân gây bệnh

Bệnh xảy ra ở 3 thể chính: quá cấp, cấp tính và mun tính

Thể quá cấp tính: Bệnh diễn biến nhanh đến nỗi không quan sát kịp triệu chứng, có thể chỉ thấy con vật đột nhiên ủ rũ cao độ sau 1- 2 giờ lăn ra chết

Thể cấp tính: Khá phổ biến, gia cầm sốt cao 42- 430C, ủ rũ, bỏ ăn, xù lông, chậm chạp, miệng mũi chảy nước nhớt sủi bọt lẫn máu màu đỏ sẫm Giữa thời kỳ bệnh gia cầm có thể ỉa chảy, phân lỏng màu socola, con vật ngày càng khó thở, mào yếm tím bầm, thường chết do ngạt thở

Thể mSn tính: thường thấy ở cuối ổ dịch, yếm sưng, thuỳ thũng, đau, con vật gầy còm , có những rối loạn cơ năng do viêm hoại tử gan mun tính, ỉa chảy phân lỏng vàng, có thể có triệu chứng thần kinh

2.4.2 Bệnh tích

- Thể quá cấp tính: Bệnh tích không điển hình

- Thể cấp tính: Biểu hiện tụ huyết, xuất huyết ở tổ chức liên kết dưới da,

ở các xoang và các cơ quan thực thể Tim sưng bao tim trương to chứa dịch thẩm xuất mầu vàng do viêm ngoại tâm mạc Phổi tụ máu, viêm mầu nâu thẫm, dịch viêm màu đỏ nhạt, gan hơi sưng, có những nốt hoại tử màu vàng nhạt to bằng mũi kim hoặc bằng đầu đinh ghim, có khi các điểm hoại tử dày

đặc liên kết lại với nhau thành đám, lách tụ máu, hơi sưng nhưng thường không to quá gấp đôi Niêm mạc tụ máu, chảy máu và viêm có đám fibrin màu đỏ thẫm phủ bên trên

- Thể mun tính: Bệnh tích chủ yếu là viêm và hoại tử mun tính đường hô hấp và gan Đôi khi viêm phúc mạc mun tính, có các lớp fibrin khô dày bao bọc các phủ tạng và túi hơi, từ phúc mạc viêm lan đến buồng trứng, ống dẫn trứng sưng màu vàng nhạt chứa đầy dịch và fibrin các khớp xương sưng to chứa nhiều dịch màu xám đục

* Sức đề kháng của vi khuẩn Pasteurella multocida với các yếu tố lý hoá:

Vi khuẩn Pasteurella multocida dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các thuốc sát trùng thông thường Vi khuẩn bị diệt sau khi đun ở

580C trong 20 phút, 80oC trong 10 phút, 100oC trong vài giây, ánh sáng mặt trời diệt vi khuẩn có trong canh khuẩn khoảng 1 ngày Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng: Axit phenic 5% trong một phút, Creolin 3%, Crezyl 3%, nước vôi 1% trong 3-5 phút Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong đất ẩm có nhiều Nitrat, và thiếu ánh sáng Trong chuồng, trên

đồng cỏ, trong đất vi khuẩn có thể sống hàng tháng, có khi hàng năm

Nghiên cứu của Das và cộng sự, 1958 [34] cho thấy P multocida tồn tại trong bông goòn tẩm máu chuột sau 118 giờ và chết sau 166 giờ (lúc này bông

đu khô máu) Trong máu phiết trên lam kính vi khuẩn tồn tại trên 24 giờ, nhưng không quá 30 giờ

Độc lực của vi khuẩn chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, và độ pH của môi trường Nobrega và Bueno qua nghiên cứu cho thấy canh trùng trong ống nghiệm đậy kín ở nhiệt độ phòng (17,50C) giữ độc lực sau 2 năm Canh trùng bảo quản ở dạng đông khô, hoặc đựng trong ống nghiệm đậy kín ở 4oC, hoặc lạnh hơn vi khuẩn có thể tồn tại và giữ nguyên độc lực lâu dài

2.5 Tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn Pasteurella multocida

Theo Mosier (1992) [49] có thể điều trị Tụ huyết trùng cho gà bằng kháng sinh và thuốc trợ lực kèm theo nuôi dưỡng tốt, cũng có thể dùng huyết thanh tối miễn dịch để điều trị, kết quả điều trị phụ thuộc vào sự phát hiện bệnh sớm hay muộn và loại kháng sinh ding điều trị

Theo Tuloziecka (1988) cho thấy Pasteurella multocida mẫn cảm với Neomycin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfathyazol

Pijper (1989) cho biết Pasteurella mẫn cảm với Oxytetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Flumequin

Stuart và các cộng tác viên nhận xét rằng Sulfamethoxypydidazin có tác dụng điều trị Tụ huyết trùng rất tốt cho gà và gà tây

Sự mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn P multocida cũng thay đổi theo từng vùng địa lý, từng quốc gia , từng thời điểm khác nhau Vì vậy việc xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn P multocida trong mỗi ổ dịch ở các địa phương khác nhau là cơ sở khoa học cho việc can thiệp bằng kháng sinh có hiệu quả

2.6 Vacxin phòng bệnh

Bệnh Tụ huyết trùng gia cầm thường xảy ra ở thể cấp tính, tỷ lệ chết cao Vì vậy việc phòng bệnh bằng vacxin là phương pháp phòng bệnh có hiệu quả

Ngay từ năm 1881, Pasteur sau khi phân lập được mầm bệnh từ gà chết

do Tụ huyết trùng ông đu làm giảm độc lực mầm bệnh và dùng chúng làm vacxin nhược độc để phòng bệnh cho gà Tiếp theo đó Heddleston và Rebers (1972) [43], Bairey, 1975 [20] nghiên cứu chế tạo vacxin chết Loại vacxin này đu đóng vai trò quan trọng trong việc khống chế bệnh Tụ huyết trùng gia cầm Nhưng hiệu lực không đồng đều, khả năng bảo hộ không ổn định ở một

số đàn đu tiêm phòng vacxin nhưng dịch vẫn xảy ra (Derieux, 1984 Vì vậy một số tác giả đu nghiên cứu chế tạo vacxin nhược độc Bierer và Derieux,

1972 [21]; Maheswaran và cộng sự 1973 [47] chế tạo vacxin giảm độc chủng

CU, PM-1 và P-9 gây miễn dịch bằng cách pha vào nước uống Rimler, 1987 [55] chế tạo vacxin bằng cách nuôi cấy P.multocida trên động vật gây miễn dịch với 5 serotype Theo Heddleston và Rebers, 1975 [43] vacxin chết Bacterin không gây được miễn dịch chéo giữa các Serotype Còn vacxin sống nhược độc gây được miễn dịch phòng hộ chéo giữa các Serotype gây bệnh Tụ huyết trùng gia cầm

Tuy nhiên việc làm giảm độc lực của mầm bệnh để chế vacxin có dẫn

đến việc P multocida nhược độc trong vacxin có thể trở lại thành cường độc

hay không, gia cầm được tiêm vacxin lại trở thành nguồn mang bệnh gây những

ổ dịch địa phương vẫn còn là vấn đề tranh cui Cho đến nay cơ chế tạo miễn dịch cũng như loại kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn tham gia vào quá trình tạo miễn dịch phòng hộ ở gà tiêm vacxin vẫn chưa được xác định rõ ràng

Rimler và Rhoades, (1987)[57] khi nghiên cứu về vi khuẩn Pasteurella multocida thấy rằng vi khuẩn có khả năng sản sinh ra protein điều chỉnh tạo sắt trong protein vật chủ, đây là yếu tố gây bệnh của Pasteurella multocida, những protein này gọi là protein màng ngoài tuỳ thuộc vào điều kiện vi khuẩn phát triển trong môi trường có thêm sắt mà có trọng lượng phân tử khoảng: 96; 84;76 KDa (Choi, 1991) Ngoài các kháng nguyên thân, kháng nguyên giáp mô, kháng nguyên OMPS đu được nghiên cứu nhiều để chế tạo vacxin nhằm nâng cao hiệu lực phòng bệnh Tụ huyết trùng cho gia cầm

Những năm gần đây nhiều nhà khoa học đu tập trung nghiên cứu các chất bổ trợ có tác dụng gây cho các chủng vi khuẩn tạo được miễn dịch cao hơn Mặt khác nghiên cứu chế tạo vacxin thế hệ mới bằng con đường công nghệ lên men sục khí và công nghệ sinh học phân tử đang được quan tâm

Về các chất bổ trợ: Raymon(1929-1930) nhận thấy khi tiêm kháng nguyên cùng với 1 chất bổ trợ cho miễn dịch cao hơn khi chỉ tiêm kháng nguyên đơn thuần

Những chất bổ trợ được ứng dụng trong sản xuất vacxin gồm các nhóm sau:

* Nhóm chất vô cơ gồm: Nhóm hydroxit (Al(OH)3), nhóm phốtphát (AlPO4), canxiclorua (CaCl2-6 H2O), nhóm kali sunphát (AlK (SO4)2.12 H2O)

* Nhóm chất hữu cơ: gồm những chất chủ yếu như : Protamin, mỡ động vật, dầu thực vật, dầu khoáng Lanolin, Saponin

Các hợp chất khác như thành tế bào vi khuẩn, các chất tổng hợp MDP (Moramyldipeptide); GMDP (Glucosamininmuramyldipeptide)

Trong các chất bổ trợ kể trên, chất bổ trợ dầu đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rui, tạo được loại vacxin hiệu lực cao và thời gian miễn dịch dài Hiện nay công nghệ lên men sục khí đang được quan tâm nghiên cứu

và ứng dụng trong sản xuất vacxin Chất lượng vacxin phụ thuộc nhiều yếu tố liên quan, các thông số kỹ thuật tối ưu về chất lượng môi trường, độ pH môi trường, lượng khí thổi, tốc độ sục khí, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy thích hợp Nhờ đậm độ vi khuẩn cao nên liều tiêm vacxin giảm, rất phù hợp trong bảo quản, vận chuyển, và sử dụng đại trà

Nhờ những phát minh mới trong sinh học phân tử, như các phương pháp tái tổ hợp DNA vào các plasmid trong vi khuẩn, các nhà nghiên cứu đu điều khiển các gen tổng hợp protein có trình tự acid amin theo ý muốn để chế tạo vacxin

Một số vacxin thế giới đang dùng hiện nay như:

- Vacxin nhũ dầu vô hoạt FC-3 do hung Mainebiolgical USA sản xuất với3 Serotype của P multocida: A.1; A.3 và A.4 Tiêm phòng gà giống, gà đẻ hai lần: lần đầu từ 12 dến 16 tuần tuổi, lần thứ hai sau 4-6 tuần, liều tiêm 0.5 ml/con

- Vacxin đậm độ cao FC- C giống như vacxin trên nhưng đậm độ vi khuẩn nhiều hơn, liều tiêm 0.3 ml/con

- Vacxin đa giá mới (Theo nghiên cứu về P multocida của tác giả Farid -AH và cộng sự tạp chí Expcrimentelle- Veterinary Medicine (1987) gà được chủng qua đường nhỏ mắt 2 lần cách nhau 2 tuần) Vacxin có chứa các dòng

P multocida 5:A; 8F:A; 9:A và 2:D đu bảo hộ được 42.9% số gà trong đàn

* Tiêu chuẩn của vacxin: Một vacxin tốt phải đảm bảo các tiêu chuẩn, vô trùng, an toàn, hiệu lực

* Sử dụng vacxin:

Sau khi tiêm vacxin một thời gian nhất định, gia cầm mới có miễn dịch,

cần lưu ý các trường hợp sau:

- Nơi có ổ dịch cũ: Cần chú ý tiêm phòng cho gia cầm ở nơi có ổ dịch

cũ, tiêm trước mùa phát bệnh

- Nơi đang phát bệnh: Tiêm phòng cho đàn gia súc, gia cầm xung quanh

ổ dịch để tạo vành đai an toàn

- Tiêm định kỳ: Phải tiêm phòng định kỳ sau thời hạn kháng thể do vacxin tạo ra hết hiệu lực (tiêm nhắc lại) để tạo miễn dịch bền vững cho gia cầm, phải tiêm phòng đúng thời gian

- Khi đưa vacxin vào cơ thể phải đúng đường, đúng liều lượng

- Gia cầm được tiêm phải khoẻ mạnh, không tiêm cho những con đang nung bệnh, Những con quá gầy yếu, quá non

- Theo dõi phản ứng khi tiêm: Gia cầm có thể có phản ứng khi tiêm do chất phụ trong vacxin, do tiêm vào cơ thể nung bệnh, tiêm sâu vào trong bắp thịt

* Bảo quản vacxin

Vacxin là một chế phẩm sinh vật dễ bị hỏng và nhiễm khuẩn cho nên phải được bảo quản tốt, giữ ở nơi khô ráo, mát, khôngcó ánh sáng mặt trời, nhiệt độ bảo quản thích hợp từ 0- 4oC còn vacxin nhược độc chế từ vi rút phải bảo quản ở nhiệt độ -15oC đến -25oC vacxin chỉ sử dụng trong một thời gian nhất định

3 Đối tượng - nội dung- nguyên liệu

và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Chim, gà cảnh nuôi tại vườn thú Hà Nội

- Vi khuẩn P.multocida gây bệnh Tụ huyết trùng cho Chim và gà cảnh nuôi tại Vườn thú Hà Nội

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trên đàn chim và gà cảnh thuộc họ trĩ (phasianidae) nuôi tại Vườn Thú Hà Nội

3.2 Xác định các đặc tính sinh vật hoá hóa của các chủng P.multocida gây bệnh phân lập được

3.3 Xác định serotype, độc lực vi khuẩn P.multocida phân lập được 3.4 Chọn chủng vi khuẩn P.multocida để chế thử vacxin

3.5 Chế tạo và thử nghiệm vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng cho đàn chim và gà tại vườn thú Hà Nội trên động vật thí nghiệm và trên gà thả vườn 3.3 Nguyên liệu

3.3.1 Địa điểm nghiên cứu

100C (Chuyển nhanh tới phòng thí nghiệm), hoặc giữ trong môi trường bảo quản bằng dung dịch Glycerin 50% trong nước sinh lý

3.3.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập, bảo quản vi khuẩn

Các loại môi trường do hung Oxoid (Anh) sản xuất Các môi trường

được chế sẵn ở dạng bột, khi cần dùng chỉ cần pha theo chỉ dẫn Môi trường ở dạng khô nên bảo quản tốt ở điều kiện khô và nhiệt độ thấp hơn 250C Các môi trường khi chế thì giữ ở nhiệt độ 2- 80C Môi trường dùng là môi trường do hung Oxoid (Anh), Merck (Pháp) sản xuất gồm:

- Môi trường nước thịt

- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)

- Môi trường thạch thường

- Môi trường thạch máu

- Môi trường MacConkey

- Môi trường Gelatin

- Môi trường các loại đường:

Pha các dung dịch đường: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Dulcitol, Galactose, Fructose thành dung dịch 10% hoặc 20%, pha xong đem lọc và hấp ở 1100C trong vòng 20- 30 phút hay hấp cách quung

1000C trong 30 phút, hấp 3 ngày liền Mỗi ống peptone cho vào một loại

đường theo tỷ lệ 0,5%