LỜI CẢM ƠN Hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy PGS-TS Cù Hữu Phú và TS Nguyễn Ngọc Nhiên, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận Án. Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Thú y, cùng các Phòng, Bộ môn, Cơ sở Đào tạo sau đại học, đặc biệt là Bộ môn Vi trùng, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các đề tài khoa học và tiến hành các thí nghiệm liên quan đến Luận Án. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS-TS Trương Văn Dung Giám đốc dự án Jica, GS Kanameda, M., Mr. Kishima, M., Chuyên gia Dự án cũng như Mrs. Imada,I., Viện Thú y Nhật Bản, đã tạo điều kiện cho tôi đến thực tập và triển khai nghiên cứu, chẩn đoán về Mycoplasma là nội dung chính của Luận Án. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới GS-TS Phan Thanh Phượng, người thầy đã cho tôi những định hướng nghiên cứu đầu tiên của Luận Án. Tôi luôn ghi nhớ công ơn của cố PGS-TS Lê Văn Tạo, người thầy luôn quan tâm từng bước trong quá trình hoàn thành Luận Án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo cùng cán bộ, nhân viên thuộc Trung tâm Nghiên cứu gia cầm, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Quốc gia, Trạm Nghiên cứu và thử nghiệm thúc ăn gia súc Viện Chăn nuôi, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các nội dung của Luận Án. Tôi xin cảm ơn tất cả các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp, gia đình và bè bạn, đặc biệt là chồng và hai con tôi, đã luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành Luận Án. Tác giả Luận Án DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Bp CFU CRD cs GI HA HI HT IFA IP IS KHT KN MA MB MG MI MIT MM MS NDY OIE PBS PCR PPLO RFLP RA RPA RSA WB Axit deoxyribonucleic Base pair Colony Forming Unit Chronic Respiratory Disease Cộng sự Growth Inhibition Haemagglutination Haemagglutination inhibition Huyết thanh Indirect Fluorescent Antibody Immunoperoxydase Infectious Sinusitis hay IS Kháng huyết thanh Kháng nguyên Mycoplasma Agar Mycoplasma Broth Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma ioawe Metabolism Inhibiton Test Mycoplasma meleagridis Mycoplasma synoviae Nitten Dry Yeast Office International des Epizooties Photsphat Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Pleuro - Pneumo Like - Organism Restriction Flagment Length Polymorphism Rapid Agglutination Rapid Plate Agglutination Rapid Slice Agglutination Whole Blood Test MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục ảnh Danh mục bảng Phần mở đầu A. Tính cấp thiết của đề tài B. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học Ý nghĩa thực tiễn C. Những đóng góp mới của luận án Phần nội dung Chương 1. Tổng quan tài liệu 1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum(MG) 1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG 1.1.3 Đặc tính nuôi cấy của MG 1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG 1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm 1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới 1 1 2 2 3 3 4 4 4 4 10 11 11 12 14 14 1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam 1.3 Bệnh do Mycoplasma ở gà 1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh 1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng tới dịch tễ 1.3.4 Triệu chứng của bệnh 1.3.5 Bệnh tích 1.3.6 Chẩn đoán 1.3.7 Điều trị 1.3.8 Biện pháp khống chế bệnh 1.4 Đặc tính miễn dịch của cơ thể gà trong bệnh do Mycoplasma 1.4.1 Đặc điểm về sự di truyền của các globulin miễn dịch từ mẹ sang con 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch Chương 2. Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 2.1.2 Chế tạo và sử dụng kháng nguyên tự chế để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh Chronic Respiratory Disease (CRD) ở một số cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp 2.1.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae (MS) phân lập được 2.2 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 18 18 22 22 23 26 29 34 35 39 39 41 43 43 43 43 43 43 43 2.2.2 Nguyên liệu 2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy và xử lý mẫu 2.3.2 Phương pháp phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 2.3.4 Phương pháp xác định kháng nguyên 2.3.5 Phương pháp phát hiện MG bằng phản ứng nhân gen Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.3.6 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà 2.3.7 Phương pháp chế kháng nguyên MG 2.3.8 Phương pháp chế kháng huyết thanh tối miễn dịch qua thỏ 2.3.9 Các phương pháp xử lý số liệu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Kết quả phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn MG, MS 3.1.1 Xác định vi khuẩn MG, MS trên các mẫu bệnh phẩm 3.1.2 Giám định vi khuẩn MG, MS phân lập được 3.1.3 Gây nhiễm bằng MG trên gà để chọn chủng chế kháng nguyên 3.2 Chế kháng nguyên MG và đánh giá chất lượng kháng nguyên MG 3.2.1 Kết quả chế kháng nguyên 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 3.2.3 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan 44 45 45 45 45 48 49 51 54 57 59 61 62 62 62 72 84 89 89 92 93 3.2.4 Đánh giá chất lượng của kháng nguyên MG tự chế, so sánh với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan 3.2.5 Xác định tỷ lệ nhiễm MG ở một số giống gà bằng kháng nguyên tự chế 3.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn MG, MS phân lập được 3.3.1 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán 3.3.2 Ứng dụng kháng huyết thanh tự chế để xác định vi khuẩn MG, MS phân lập được Kết luận và đề nghị I. Kết luận II. Đề nghị Các công trình liên quan Tài liệu tham khảo Phụ lục 94 101 106 106 110 112 112 112 113 114 133 DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG SỐ 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 TÊN BẢNG Các đặc điểm phân biệt của giống Mycoplasma Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật Các loài Mycoplasma phân lập từ gia cầm Đặc điểm và tính chất của các serotype Mycoplasma ở gia cầm Tính chất sinh hoá của Mycoplasma ở gia cầm Thành phần các chất trong phản ứng PCR xác định MG, MS Điều kiện trong phản ứng PCR xác định MG, MS Gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà Quy trình gây miễn dịch trên thỏ Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng theo lứa tuổi Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng ở các cơ sở chăn nuôi Phân lập vi khuẩn MG, MS từ mẫu phổi Kiểm tra một số đặc tính sinh hoá và khả năng lên men đường của các chủng MG, MS phân lập được Giám định các chủng MG, MS phân lập bằng phương pháp phát hiện kháng thể Giám định các chủng MG, MS phân lập bằng phương pháp xác định kháng nguyên Giám định vi khuẩn phân lập được bằng phản ứng PCR Kết quả giám định serotype của các chủng MG phân lập TRANG 7 8 9 15 16 53 53 55 60 63 67 70 76 77 78 81 83 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 3.20 3.21 3.22 3.23 3.24 Ứng dụng các phương pháp chẩn đoán khác nhau sau gây nhiễm MG Đánh giá kết quả của các phương pháp sau 35 ngày gây nhiễm Kết quả giám định vi khuẩn Xác định độ thuần khiết, vô trùng của canh khuẩn chế kháng nguyên Kết quả xác định khả năng ngưng kết ở các lô KN trước và sau khi bảo quản trong tủ lạnh Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên Intervet So sánh sự ngưng kết giữa các lô KN tự chế và KN Intervet bằng phản ứng ngưng kết toàn huyết So sánh sự ngưng kết giữa KN tự chế và KN Intervet bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh nhanh Xác định nồng độ tối ưu của KN tự chế với huyết thanh dương tính Xác định hiệu giá ngưng kết của huyết thanh dương tính bằng KN tự chế và KN Intervet- Hà Lan Tỷ lệ nhiễm MG ở một số giống gà Kết quả kiểm tra tỷ lệ nhiễm CRD bằng KN tự chế và xác định vi khuẩn MG từ dịch họng bằng phương pháp PCR Kết quả xác định kháng thể trong máu của gà được tiêm vacxin Nobilis® MGINAC Thu hoạch kháng huyết thanh Kiểm tra chất lượng kháng huyết thanh bằng phản ứng ngưng kết nhanh 85 86 88 91 92 93 94 95 96 98 100 101 102 103 107 107 3.25 3.26 3.27 Xác định hiệu giá ngưng kết của kháng huyết thanh Xác định kháng huyết thanh bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch Ứng dụng KHT MG, KHT MS tự chế để xác định các chủng Mycoplasma phân lập được 108 109 110 DANH MỤC ẢNH SỐ 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 TÊN ẢNH Phản ứng Multiplex PCR xác định MG, MS trong bệnh phẩm Khuẩn lạc MS Khuẩn lạc MG Giám định MG, MS phân lập bằng phương pháp PCR Khuẩn lạc MG, MS nhuộm Immunoperoxidaza Phản ứng lên men đường Phản ứng khuếch tán trên thạch Lấy mẫu máu Huyết thanh làm phản ứng ngưng kết nhanh Phản ứng ngưng kết và ức chế ngưng kết hồng cầu Nhân truyền giống qua trứng Giết thỏ thu hoạch kháng huyết thanh Chuẩn bị cấy chuyển giống chế kháng nguyên Kiểm tra giống trên môi trường MA Kết quả phản ứng ngưng kết khi pha loãng kháng nguyên Sản phẩm kháng nguyên MG tự chế TRANG 64 75 75 82 133 134 134 135 135 135 136 136 136 137 137 137
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN THÚ Y ĐÀO THỊ HẢO PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN LUẬN ÁN TIẾ N SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VI Ệ N T H Ú Y Đ À O T H Ị H Ả O LU Ậ N ÁN TI Ế N S Ĩ NÔNG NGHI Ệ P PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN CHUYÊN NGÀNH VI SINH V Ậ T H Ọ C THÚ Y MÃ S Ố : 62 42 50 10 NG Ư Ờ I H Ư Ớ NG D Ẫ N KHOA H Ọ C: PGS- TS. CÙ H Ữ U PHÚ TS. NGU Y Ễ N NG Ọ C NHIÊ N HÀ NỘI - 2008 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy PGS-TS Cù Hữu Phú và TS Nguyễn Ngọc Nhiên, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận Án. Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Thú y, cùng các Phòng, Bộ môn, Cơ sở Đào tạo sau đại học, đặc biệt là Bộ môn Vi trùng, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các đề tài khoa học và tiến hành các thí nghiệm liên quan đến Luận Án. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS-TS Trương Văn Dung Giám đốc dự án Jica, GS Kanameda, M., Mr. Kishima, M., Chuyên gia Dự án cũng như Mrs. Imada,I., Viện Thú y Nhật Bản, đã tạo điều kiện cho tôi đến thực tập và triển khai nghiên cứu, chẩn đoán về Mycoplasma là nội dung chính của Luận Án. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới GS-TS Phan Thanh Phượng, người thầy đã cho tôi những định hướng nghiên cứu đầu tiên của Luận Án. Tôi luôn ghi nhớ công ơn của cố PGS-TS Lê Văn Tạo, người thầy luôn quan tâm từng bước trong quá trình hoàn thành Luận Án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo cùng cán bộ, nhân viên thuộc Trung tâm Nghiên cứu gia cầm, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Quốc gia, Trạm Nghiên cứu và thử nghiệm thúc ăn gia súc Viện Chăn nuôi, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các nội dung của Luận Án. Tôi xin cảm ơn tất cả các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp, gia đình và bè bạn, đặc biệt là chồng và hai con tôi, đã luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành Luận Án. Tác giả Luận Án LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu có sự hợp tác và giúp đỡ của tập thể trong và ngoài cơ quan, tôi chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu trong bản luận án này Hà Nội, ngày 04 tháng 06 năm 2008 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Bp CFU CRD cs GI HA HI HT IFA IP IS KHT KN MA MB MG MI MIT MM MS NDY OIE PBS PCR PPLO RFLP RA RPA RSA WB Axit deoxyribonucleic Base pair Colony Forming Unit Chronic Respiratory Disease Cộng sự Growth Inhibition Haemagglutination Haemagglutination inhibition Huyết thanh Indirect Fluorescent Antibody Immunoperoxydase Infectious Sinusitis hay IS Kháng huyết thanh Kháng nguyên Mycoplasma Agar Mycoplasma Broth Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma ioawe Metabolism Inhibiton Test Mycoplasma meleagridis Mycoplasma synoviae Nitten Dry Yeast Office International des Epizooties Photsphat Buffered Saline Polymerase Chain Reaction Pleuro - Pneumo Like - Organism Restriction Flagment Length Polymorphism Rapid Agglutination Rapid Plate Agglutination Rapid Slice Agglutination Whole Blood Test MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục ảnh Danh mục bảng Phần mở đầu A. Tính cấp thiết của đề tài B. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học Ý nghĩa thực tiễn C. Những đóng góp mới của luận án Phần nội dung Chương 1. Tổng quan tài liệu 1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum(MG) 1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG 1.1.3 Đặc tính nuôi cấy của MG 1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG 1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm 1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới 1 1 2 2 3 3 4 4 4 4 10 11 11 12 14 14 1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam 1.3 Bệnh do Mycoplasma ở gà 1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh 1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng tới dịch tễ 1.3.4 Triệu chứng của bệnh 1.3.5 Bệnh tích 1.3.6 Chẩn đoán 1.3.7 Điều trị 1.3.8 Biện pháp khống chế bệnh 1.4 Đặc tính miễn dịch của cơ thể gà trong bệnh do Mycoplasma 1.4.1 Đặc điểm về sự di truyền của các globulin miễn dịch từ mẹ sang con 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch Chương 2. Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 2.1.2 Chế tạo và sử dụng kháng nguyên tự chế để xác định tỷ lệ nhiễm bệnh Chronic Respiratory Disease (CRD) ở một số cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp 2.1.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae (MS) phân lập được 2.2 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 18 18 22 22 23 26 29 34 35 39 39 41 43 43 43 43 43 43 43 2.2.2 Nguyên liệu 2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy và xử lý mẫu 2.3.2 Phương pháp phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 2.3.4 Phương pháp xác định kháng nguyên 2.3.5 Phương pháp phát hiện MG bằng phản ứng nhân gen Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.3.6 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà 2.3.7 Phương pháp chế kháng nguyên MG 2.3.8 Phương pháp chế kháng huyết thanh tối miễn dịch qua thỏ 2.3.9 Các phương pháp xử lý số liệu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Kết quả phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn MG, MS 3.1.1 Xác định vi khuẩn MG, MS trên các mẫu bệnh phẩm 3.1.2 Giám định vi khuẩn MG, MS phân lập được 3.1.3 Gây nhiễm bằng MG trên gà để chọn chủng chế kháng nguyên 3.2 Chế kháng nguyên MG và đánh giá chất lượng kháng nguyên MG 3.2.1 Kết quả chế kháng nguyên 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 3.2.3 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan 44 45 45 45 45 48 49 51 54 57 59 61 62 62 62 72 84 89 89 92 93 . NGHI Ệ P PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN CHUYÊN NGÀNH VI SINH V. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN THÚ Y ĐÀO THỊ HẢO PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN,