Đề Tài : Nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây ô đầu (aconitum carmichaeli debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang (Full Text )

Tên luận án: “ Nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang ” Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62.72.04.06 Họ và tên nghiên cứu sinh: Vũ Đức Lợi Khóa: 2011 - 2016 Họ và tên cán bộ hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững 2. PGS.TS. Nguyễn Thượng Dong Tên cơ sở đào tạo: Viện Dược liệu Tóm tắt những kết luận mới của luận án: * Về thực vật: - Đã áp dụng phương pháp giải trình tự gen AND để xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx. * Về hóa học: - Đã áp dụng phương pháp ICP-MS xác định được hàm lượng 12 kim loại nặng (Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As) trong Ô đầu, Phụ tử - Đã chiết xuất phân lập được 5 alcaloid, 4 flavonoid, 2 sitosterol và 5 chất nhóm acid béo, este. Trong đó có 2 chất mới là: 5,7,3 '''' -trimethoxyquercetin 3-O-β-Dfructofuranosid và (Z)-3-hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat. Các chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic, acid 3-chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-hydroxypropane-1,2-diyl dihenicosanoat, 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→6)-β-Dglucopyranosid], quercetin 3-O--L-rhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-Dgalactopyranosid. * Về độc tính cấp và tác dụng sinh học: - Đã xác định được LD50 của 2 phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid là: 991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg) - Đã xác định ở liều tối đa chuột có thể uống 12 g phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid/kg và 15 g phân đoạn chứa polysaccharid/kg thể trọng chuột mà không có chuột nào chết. - Phân đoạn alcaloid (PĐ E) chiết xuất từ Phụ tử với liều 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày uống trong 3 ngày liên tục, thấy có tác dụng giảm đau thông qua kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ, làm tăng khoảng cách gây phản xạ đau và làm giảm số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng. - Phân đoạn polysaccharid (PĐ I) chiết xuất từ Phụ tử với liều 100 mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột, thấy có tác dụng kích thích miễn dịch thông qua mẫu thử làm tăng phục hồi số lượng bạch cầu, tăng nồng độ cytokine IL-2, nồng độ globulin miễn dịch và hạn chế một phần tổn thương trên giải phẫu vi thể tổ chức lympho. - Phân đoạn flavonoid (PĐ C) chiết từ lá với liều 30mg/kg thể trọng chuột thấy có tác dụng chống viêm gan cấp và chống oxy hóa thông qua làm giảm hoạt độ enzym ALT (39.23 %), AST (32.21 % ) và làm giảm hàm lượng MDA trong gan (15.96 %) so với lô chứng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC

TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN DƯỢC LIỆU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC

TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 62 72 04 06

HÀ NỘI, NĂM 2014

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

Chương 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1.Về thực vật……… 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Aconitum L……… 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L……… 3

1.1.3 Số lượng và sự phân bố các loài thuộc chi Aconitum L……… 4

1.1.4 Xác định tên khoa học của loài thuộc chi Aconitum L bằng giải trình tự ADN……… ………

5 1.2.Thành phần hóa học một số loài thuộc chi Aconitum L……….…… 7

1.2.1.Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Aconitum trên thế giới……… 8

1.2.1.1 Alcaloid……… 8

1.2.1.2 Flavonoid……… 14

1.2.1.3 Polysaccharid……… 18

1.2.1.4 Các nhóm chất khác……… 19

1.2.2.Thành phần hóa học của cây Ô đầu trồng ở Việt Nam……… 20

1.3.Tác dụng sinh học, độc tính và công dụng một số loài thuộc chi Aconitum L… 21 1.3.1 Tác dụng sinh học và độc tính một số loài thuộc chi Aconitum L… 21

1.3.1.1 Tác dụng giảm đau……… 21

1.3.1.2 Tác dụng tăng cường miễn dịch……… 21

1.3.1.3 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan……… 22

1.3.1.4 Tác dụng gây hạ đường huyết……… 22

1.3.1.5 Tác dụng chống tăng sinh tế bào, chống ung thư……… 23

1.3.1.6 Tác dụng trên tim mạch……… 23

1.3.1.7 Tác dụng trên huyết áp……… 24

1.3.1.8 Tác dụng chống viêm……… 24

1.3.1.9 Một số tác dụng khác……… 24

1.3.1.10 Độc tính……… 26

1.3.2 Công dụng……… 28

1.3.2.1 Ô đầu……… 28

1.3.2.2 Phụ tử ……… 28

1.3.3 Một số sản phẩm sản xuất từ một số loài thuộc chi Aconitum L………… 29

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 30

2.1.Nguyên liệu……… 30

2.2.Động vật thí nghiệm……… 30

2.3.Trang thiết bị và hóa chất……… 30

2.3.1 Trang thiết bị……… 30

2.3.2 Hóa chất……… 31

2.4.Phương pháp nghiên cứu……… 32

2.4.1.Nghiên cứu về thực vật……… 32

2.4.2.Nghiên cứu thành phần hoá học……… 34

2.4.3.Nghiên cứu tác dụng sinh học……… 35

2.4.3.1 Thử độc tính cấp……… 35

2.4.3.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau……… 36

2.4.3.3 Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch……… 38

2.4.3.4 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan……… 41

2.4.4.Phương pháp xử lý số liệu……… 42

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 43

3.1.Kết quả nghiên cứu về thực vật cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang 43

3.1.1.Đặc điểm hình thái thực vật……… 43

3.1.2.Xác định tên khoa học……… 46

3.2.Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học……… 48

3.2.1.Xác định thành phần hóa học trong cây Ô đầu……… 48

3.2.1.1.Định tính các nhóm chất hữu cơ……… 48

3.2.1.2 Định lượng một số nhóm chất hữu cơ………

49 3.2.1.3 Định lượng các kim loại nặng………

51 3.2.2.Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ Ô đầu, Phụ tử……… 51

3.2.2.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Phụ tử ……….………… 51

3.2.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ Ô đầu ……… 53

3.2.2.3 Chiết xuất polysaccharid từ Phụ tử và Ô đầu……… 55

3.2.3.Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu……… 57

3.2.4 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất……… 59

3.2.4.1 Nhận dạng các hợp chất phân lập được từ Ô đầu, Phụ tử……… 59

3.2.4.2 Nhận dạng các hợp chất phân lập được từ lá cây Ô đầu……… 74

3.3 Kết quả nghiên cứu về độc tính và tác dụng sinh học……… 86

3.3.1 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp……… 86

3.3.1.1 Độc tính cấp của phân đoạn chứa alcaloid chiết từ Phụ tử……… 86

3.3.1.2 Độc tính cấp của phân đoạn chứa flavonoid chiết xuất từ lá cây Ô đầu………

88 3.3.1.3 Độc tính cấp của phân đoạn chứa polysaccharid chiết từ Phụ tử…… 89

3.3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học……… 90

3.3.2.1 Tác dụng giảm đau của phân đoạn chứa alcaloid từ Phụ tử………… 90

3.3.2.2 Tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn chứa polysaccharid chiết từ Phụ tử……… 93

3.3.2.3 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn chứa flavonoid 97

Chương 4 BÀN LUẬN……… 100

4.1 Về thực vật……… 100

4.2 Về thành phần hóa học……… 102

4.3 Về độc tính cấp và tác dụng sinh học……… 116

4.3.1 Về độc tính cấp……… 116

4.3.2 Về tác dụng sinh học……… 117

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 123

Kết luận……… 123

Kiến nghị……… 124

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có nguồn thực vật rất phong phú

và đa dạng Trong đó, nhiều cây được dùng làm thuốc và cũng có những cây có độc tính như cà độc dược, mã tiền, ô đầu khi dùng, phải sử dụng đúng liều lượng, nếu không dùng đúng, chúng có thể gây ngộ độc cho người bệnh [2], [3], [6], [9], [11], [27]

Phụ tử, Ô đầu chứa những thành phần có độc tính cao nhưng vẫn được cho là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ biến trong Y Dược học cổ truyền phương Đông nhất là ở Trung Quốc Vị thuốc Ô đầu là củ mẹ và Phụ tử là củ con của một số

loài thuộc chi Aconitum [2], [6], [11], [29] Hiện nay trên thế giới, đang có những nghiên cứu về chi Aconitum nhằm phát triển các sản phẩm theo hướng hiện đại, nâng

cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc chi này trong phòng và điều trị bệnh

Ở Việt Nam, cây Ô đầu đã được đưa vào trồng ở Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu

từ những năm 70 thế kỷ trước [3], [11] Theo một số tài liệu [6], [9], [11], [22], [27]

cây Ô đầu ở Việt Nam được ghi nhận bởi 2 tên là: A fortunei Hemsl và A carmichaeli

Debx Theo đề tài nghiên cứu của tác giả Bùi Hồng Cường (năm 2007) với mục tiêu xây dựng phương pháp chế biến Phụ tử, bào chế cao Phụ tử cho sản phẩm có tác dụng cường tim, độc tính thấp và xác định một số thành phần hóa học của Phụ tử sống và

các sản phẩm, đã xác định được cây Ô đầu trồng ở Sa Pa – Lào Cai thuộc loài A

carmichaeli Debx và tập trung nghiên cứu theo hướng chế biến cổ truyền [11] Hiện

nay, cây Ô đầu được trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng Văn, tỉnh Hà Giang và được người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm làm thuốc chữa bệnh đau nhức xương khớp hoặc nấu cháo ăn để tăng cường sức khoẻ Tuy nhiên, hàng năm nước ta có nhiều

vụ ngộ độc do chất lượng dược liệu không bảo đảm, sử dụng nhầm lẫn, đầu độc bằng dược liệu, chế phẩm có nguồn gốc từ cây Ô đầu Do đó cần có nghiên cứu về thành phần hóa học, xác định các chất chính trong dược liệu để kiểm soát tốt chất lượng và

sử dụng an toàn hiệu quả Năm 2013, Thủ Tướng Chính phủ đã phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030, theo đó cây

Ô đầu được quy hoạch trồng tại tỉnh Hà Giang [35] Để phát triển vùng trồng cây Ô đầu một cách bền vững, cần có nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học

2

của cây Ô đầu Hà Giang theo hướng ứng dụng trong Y Dược học hiện đại, góp phần phát triển sản phẩm từ cây Ô đầu nhằm tạo đầu ra cho cây Ô đầu Hà Giang Qua tham khảo, đến nay chưa thấy có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang Để đóng góp về mặt khoa học, thực tiễn và

góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài “Nghiên cứu thành

phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli

Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang” được thực hiện nhằm 3 mục tiêu sau:

1 Xác định được tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang

2 Nghiên cứu được thành phần hóa học: định tính, định lượng nhóm chất, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập được

3 Đánh giá được độc tính cấp và thử một số tác dụng sinh học của một số phân đoạn dịch chiết từ cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang để gợi mở hướng sử dụng dược liệu này

Để đạt được 3 mục tiêu trên, luận án tập trung vào các nội dung nghiên cứu sau:

+ Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang bằng phương pháp so sánh đặc điểm hình thái và phương pháp so sánh trình tự ADN

+ Định tính, định lượng, chiết xuất, phân lập nhóm chất alcaloid, polysacharid từ Ô đầu, Phụ tử sống và nhóm chất flavonoid từ lá cây Ô đầu

+ Thử độc tính cấp của các phân đoạn dịch chiết alcaloid, flavonoid, polysaccharid + Thử tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn dịch chiết chứa polysaccharid, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid, tác dụng giảm đau của phân đoạn chứa alcaloid và có độc tính thấp

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Về thực vật

1.1.1.Vị trí phân loại chi Aconitum L

Theo các tài liệu [2], [3], [6], [22], [27], [89] cây Ô đầu thuộc chi Aconitum L., vị trí của chi Aconitum L trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau:

Ngành Mộc lan (Magnoliophyta)

Lớp Mộc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Bộ Hoàng liên (Ranunculales)

Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)

Chi Aconitum L

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L

Theo tài liệu [40], [89], [105], [115], [135], các loài thuộc chi Aconitum có

những đặc điểm chính như sau: Thân thảo, sống một năm hoặc nhiều năm Lá của các

loài thuộc chi Aconitum có màu xanh đậm và không có lá kèm Lá hình bàn tay chia

thùy hoặc thùy sâu với 5-7 phần Mỗi phần lại chia thành 3 thùy với hình răng cưa Lá sắp xếp xoắn ốc, lá ở dưới có cuống dài Hoa mọc thẳng đứng, có thể có các màu: xanh đậm, tím, trắng, vàng, hồng với nhiều nhị hoa Hoa được phân biệt bởi có một trong năm đài hoa, hoa có hình mũ Hoa có 2-10 cánh hoa Hai cánh hoa trên to và đặt dưới các đài thân dài Hoa có túi rỗng ở đỉnh chứa mật hoa Những cánh hoa khác nhỏ hoặc không hình thành, có 3-5 lá noãn được hợp nhất một phần Quả là một tổ hợp các nang, mỗi nang chứa nhiều hạt

Hiện nay, chi Aconitum L được thành 3 phân chi (subgenera) [89] với các đặc điểm

chính như sau:

- Phân chi Aconitum L: Cây thảo, sống 2 năm, giả 1 năm, có rễ củ Đài hoa

không hoặc gần như không có móc, lá đài trên hình mũ, hình thuyền hoặc cong hình lưỡi liềm, hiếm khi hình trụ Phiến cánh hoa có mô tiết ở đỉnh hoặc rìa, môi rõ hoặc không, cựa ngắn hoặc dài, hiếm khi vắng mặt, lá noãn 3-5

- Phân chi Lycotonum petermann: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ đài hoa

không có móc, lá đài trên hình trụ hoặc hình mũ cao hiếm khi hình thuyền

4

Phiến cánh hoa có mô tiết ở đỉnh có cựa hình túi hoặc uốn cong, môi thường thẳng hoặc rất ngắn Lá noãn 3- (8)

- Phân chi Gymnaconitum Rapaics: Cây thảo, sống một năm Lá chia 3 phần hình

chân vịt Đài hoa có móc, lá đài trên hình thuyền Cánh hoa không có cựa, môi rộng, hình quạt, rìa có răng Lá noãn 6-13

1.1.3 Số lƣợng và sự phân bố các loài thuộc chi Aconitum L

Trên thế giới:

Theo Neelofar Jabeen, Mohammad I Kozgar, trên thế giới có khoảng trên 300

loài thuộc chi Aconitum, phân bố ở khu vực phía bắc ôn đới, khu vực lạnh ở bán cầu

bắc [104], [105] Phân bố chủ yếu ở vùng núi Đông Á, Đông Nam Á, Trung Âu, một

số cũng thấy ở phía tây bắc Mỹ và phía tây nước Mỹ Khu vực dãy núi Himalaya có

các loài thuộc chi Aconitum như ở: Pakistan, Ấn Độ, Nepal, Bhutan, bắc Tây Tạng

Đến nay 33 loài đã được tìm thấy ở khu vực Himalaya Theo Eti Sharma và A K Gaur [55]: Ở Ấn Độ có khoảng 24 loài được phân bố chủ yếu trên núi cao thuộc dãy Himalaya ở độ cao khoảng 3000-4200 m Các loài ở Ấn Độ được phân thành hai loại

chính là loài có độc và loài không độc Loài không độc như: A heterophyllum Wall.,

A laeve Royle và A routndifolium Kar et Kir Loài có độc như: A chasmanthum Stapf ex Holmes, A ferox Hardy Perennial , A deinorrhizum, A falconeri Stapf., A balfourii (Bruhl) Muk., A moschatum (Bruhl) Stapf , A violaceum Jacquem ex Stapf, A spicatum Stapf., A bisma (Buch Ham.) Rapaics và

A laciniatum (Bruhl) Stapf Ở Nepal có 38 loài, trong đó 16 loài được sử dụng làm

thuốc, phân bố chủ yếu ở phía đông Nepal, khu vực ẩm, có độ cao 1800-4200 m [116]

Ở Buthan có 19 loài thuộc chi Aconitum [105] Ở Rumani có 10 loài Ở Uckraina phát hiện có 12 loài thuộc chi Aconitum, phân thành 3 phân chi là: Aconitum, Lycoctonum

và Anthora đã được mô tả về củ và hoa Trong đó phân chi Aconitum nhiều nhất với 2

phân nhánh là: Aconitum, Cammarum DC với 10 loài Hai phân chi còn lại chỉ mới tìm thấy 1 loài [40]

Theo Wei Wang, Yang Liu, Sheng-Xiang Yu, Tian-Gang Gao & Zhi-Duan

Chen, họ Ranunculaceae với 59 chi và khoảng 2500 loài, chi Aconitum với hơn 300 loài được phân thành 3 phân chi là: A subg Lycoctonum (DC.) Peterm., A subg

Số loài thuộc chi Aconitum đã được ghi nhận đến nay trên thế giới là 948 loài

tuy nhiên do có sự trùng lặp về cách đặt tên các loài tại các quốc gia, các vùng khác nhau nên thực chất chỉ có 331 loài được chấp nhận [105], [153]

Tại Việt Nam:

Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam hiện nay có nguồn gốc nhập nội từ 2 nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành Y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc, được trồng đầu tiên ở Sa Pa- Lào Cai từ đầu những năm 70 của thế kỷ trước, sau đó được trồng ở Bắc

Hà - Lào Cai và Sìn Hồ - Lai Châu Nguồn thứ 2 do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ và Đồng Văn - Hà Giang tự động nhập giống cây Ô đầu từ bên kia biên giới

về trồng ở vườn nhà và nương rẫy Có tài liệu cho rằng, cây Ô đầu Việt Nam mọc hoang ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [3], [6], [11], [22], [27],

[29] Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam, được ghi nhận bởi 2 tên là: A fortunei Hemsl và A

carmichaeli Debx [3], [6], [27], [29] Theo đề tài nghiên cứu của tác giả Bùi Hồng

Cường thì tên khoa học cây Ô đầu trồng ở Sa Pa - Lào Cai là A carmichaeli Debx

[11] Đến nay chưa có công bố nào về tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang Do đó, cần có nghiên cứu xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang

1.1.4 Xác định tên khoa học của loài thuộc chi Aconitum L bằng giải trình tự

ADN

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được chứa đựng trong phân tử có tên là ADN, đó là chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch đơn được tạo thành từ 4 loại nucleotid gồm A (adenin), C (cytosin), G (guanin), T (thymin) Các nucleotid này nối tiếp nhau theo một trình tự xác định và khác nhau ở từng loài, thậm chí từng cá thể Giải trình tự ADN là kỹ thuật giúp xác định sự sắp xếp của 4 loại nucleotid A, C, G, T trên phân tử ADN, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử

Phương pháp giải trình tự ADN:

6

+ Phương pháp Sanger:

Phương pháp enzym được Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977 và ngày nay ngày càng được hoàn thiện, dễ dàng thực hiện tại các phòng thí nghiệm Các đoạn ADN cần xác định trình tự phải được tạo dòng vào vector để nhân thành nhiều bản sao trong tế bào vi khuẩn, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do Lượng ADN sau khi được tách chiết sẽ được phân vào 4 ống nghiệm khác nhau để thực hiện phản ứng giải trình tự Mỗi phản ứng bao gồm: vector có gắn chèn đoạn ADN cần xác định trình tự, đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình

tự của vector tại vị trí đoạn chèn ADN, enzym ADN polymerase, bốn loại dNTP và 1% mỗi loại ddNTP (ddNTP là dideoxynucleotid triphosphat có cấu trúc hóa học mất gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose làm cho dNTP kế tiếp không thể gắn vào Do đó sẽ kết thúc phản ứng kéo dài chuỗi Kết quả sẽ tạo những mạch ADN

có chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotid trên đoạn ADN gốc Các ddNTP sẽ được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32

P hay 35S Sau khi điện di trên gel polyacrylamid, các vạch điện di này được hiển thị bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ các vạch này có thể xác định được trình tự ADN

Hình 1.1 Trình tự ADN xác định bằng phương pháp Sanger + Phương pháp giải trình tự bằng máy tự động:

Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và

7

xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotid A, T, C, G

Hình 1.2 Hệ thống giải trình tự ADN bằng máy tự động

- Ứng dụng của phương pháp giải trình tự gen ADN là: định danh, xác định kiểu gen, nghiên cứu đột biến

+ Ứng dụng định danh các loài thuộc chi Aconitum:

Theo nghiên cứu của tác giả Jun He và cộng sự năm 2010, cho thấy bằng phương pháp giải trình tự gen ADN và so sánh với bộ gen chuẩn trong ngân hàng gen,

tác giả đã xác định được trình tự gen cũng như tên khoa học của các loài thuộc chi

Aconitum tại Trung Quốc là: A carmichaeli, A alboviolaceum, A brachypodum, A contortum, A coreanum, A gymnandrum, A hemsleyanum, A kusnezoffii, A nagarum, A scaposum, A tanguticum, A vilmorinianum, A racemulosum, A chrysotrichum, A crassiflorum, A finetianum, A gigas, A scaposum [83]

1.2 Thành phần hóa học một số loài thuộc chi Aconitum L

Thành phần hóa học các loài thuộc chi Aconitum thường có 3 nhóm chất đó là

alcaloid, polysaccharid, flavonoid, trong đó alcaloid là thành phần chính Ngoài ra còn

có acid hữu cơ, đường tự do, acid amin, sterol, carotenoid Sự phân bố các nhóm chất này, khác nhau trong các bộ phận: củ, lá, hoa, quả, hạt, thân cây [6], [11], [27]

- Khung C18- diterpenoid alcaloid

- Khung C19- diterpenoid alcaloid

- Khung C20- diterpenoid alcaloid

- Nhóm Bisditerpenoid

- Nhóm alcaloid khác

Dựa vào số liên kết ester với khung diterpenoid, các nhóm chính này được chia thành 3 nhóm: alcaloid diester (aconitin, mesaconitin ), alcaloid monoester (benzoylaconin, benzoylmesaconin), alcaloid alkamin [11], [117]

* Alcaloid C 18 -diterpenoid

Các C18-diterpen alcaloid có nguồn gốc từ các C19- diterpen alcaloid, khung carbon

có chứa 18C do mất đi C18 Trong các hợp chất này, C4 được thay thế bởi 1 nguyên tử hydrogen, hoặc một nhóm ester hoặc nhóm 3,4-epoxid Đến nay có hàng trăm alcaloid

đã được phân lập từ các loài thuộc chi Aconitum như: lappaconitin, ranaconitin,

sepaconitin, aconosin, acoseptrin, dolaconin, finaconitin, puberanin, kirimin…[50], [52], [68], [80], [81], [116], [118], [142] Các alcaloid này được chia thành 2 nhóm là: lappaconitin và ranaconitin [125], [139] Nhóm lappaconitin có cấu trúc đặc trưng bởi

sự hiện diện của 1 nguyên tử carbon ở vị trí C-4 Nhóm ranaconitin cấu trúc đặc trưng bởi một nguyên tử oxy ở vị trí C-7

Khung cấu trúc của nhóm alcaloid C18-diterpenoid và của lappaconitin, ranaconitin được trình bày ở hình 1.3

12

13 14

15 17

18

Hình 1.3 Cấu trúc alcaloid C18-diterpenoid

* Alcaloid C 19 -diterpenoid

Khung cấu trúc của nhóm alcaloid C19-diterpenoid được trình bày ở hình 1.4

N R

1 2 3

7 8 9 10

12 1314

15 16

11 17

18 19

Hình 1.4 Cấu trúc khung C19-diterpenoid alcaloid

C19-diterpenoid alcaloid hình thành dựa trên khung hexacyclic carbon Những hợp chất này thường chứa nhiều nguyên tử oxy, có ít nhất 5 nguyên tử oxy hoạt động,

1 hoặc 2 trong số đó có thể bị ester hóa bởi acid thơm hoặc acid acetic Những alcaloid này được coi như dẫn xuất của aconitin Các alcaloid C19-diterpenoid được

tìm thấy trong nhiều loài Aconitum spp., đã có trên 250 hợp chất được công bố như:

aconitin, mesaconitin, hypaconitin, delcosin, karacolin, hokbusin A, fuzilin, neolin…[81], [116], [124], [141] Những hợp chất này chia làm 6 nhóm chính [52] là: + Nhóm aconitin: Hợp chất aconitin lần đầu tiên phân lập được từ loài A napellus vào năm 1821 bởi Peschier, tuy nhiên đến 1959 mới xác định được cấu trúc của nó Cấu trúc của nhóm này không có nguyên tử oxy ở vị trí C-7, có 1 nhóm α-OH ở vị trí C-6 Dựa vào nguyên tử nitơ có thể phân thành 4 nhóm nhỏ là: amin, imin, hỗn hợp acetal

10

N-O, amid Chất đại diện cho nhóm như: aconitin, mesaconitin, hypaconitin… phân

lập từ một số loài như: A carmichaeli, A napellus, A jaluense, A kusnezoffii…

+ Nhóm lycoctonin: Cấu trúc đặc trưng bởi sự có mặt nguyên tử oxy ở vị trí C-7 Chất

đại diện như lycaconitin, lycoctonin phân lập từ A lycoctonum

+ Nhóm pyrodelphinin: cấu trúc so sánh với nhóm aconitin thì không có nhóm thế ợ vị

trí C-8 chất đại diện như: pyrodelphynin, flaconitin phân lập từ A tuberosum,

Aconitum falconeri Stapf

+ Nhóm lacton: trong cấu trúc có 1 vòng δ-lacton, chất đại diện như heterophyllidin,

heterophyllisin, heterophyllin phân lập từ A heterophyllum

+ Nhóm có nguồn gốc sinh tổng hợp từ nhóm aconitin và thường có nguyên tử nitơ nối

với C-17 Chất đại diện secokaraconitin phân lập từ A karacolincum

+ Nhóm cấu trúc đặc trưng bởi cầu nối bất thường giữa C-8 với C-17, C-8 với C-10,

C-7 với C-17 Chất đại diện vilmoraconitin phân lập từ A vilmorinianum

Cấu trúc một số alcaloid thuộc nhóm C19-diterpenoid được trình bày ở hình 1.5

Hình 1.5 Một số alcaloid thuộc nhóm C19-diterpenoid alcaloid

8

9 10 11

12 1314

15

16 17

18 19

20

Hình 1.6 Khung C20-diterpenoid alcaloid

C20-diterpen alcaloid không chứa nhiều nguyên tử oxy, thường có 2–5 nguyên

tử oxy hoạt động như monoester của acid benzoic hoặc acid acetic Trong hầu hết các trường hợp không chứa nhóm methoxy, có 1 nhóm methylen ngoài vòng, nhiều trường hợp chứa nhóm chức hydroxy vị trí allylic Hàng trăm chất thuộc nhóm này đã phân

lập từ ác loài thuộc chi Aconitum với các chất điển hình như: napellin, acetylnapellin,

atisin, kobusin, aconicarmin, acorin [50], [51], [60], [71], [74], [78], [81], [82] Khi

so sánh với C19-diterpen alcaloid, C20- diterpen alcaloid đa dạng về cấu trúc hơn Hiện nay các C20-diterpen alcaloid được chia thành 9 nhóm [52], [81], [116], [140], [146], [147] là:

+ Nhóm atisin: cấu trúc nhóm hình thành dựa trên khung pentacyclic, trong cấu trúc

12

+ Nhóm kuneszolin: khung cấu trúc lúc đầu được chuyển hóa từ nhóm hetisin, sau được tìm thấy trong tự nhiên, chất đại diện là guan-fu-base K

+ Nhóm racemulosin: cấu trúc đặc trưng của alcaloid C-20 và có nguồn gốc từ nhóm

denudatin, chất đại diện là racemulosin phân lập từ A racemulosum

+ Nhóm arcutin: cấu trúc có cầu nối bất thường ở C-5 với C-20 và C-10 với C-20 Cấu trúc một số chất thuộc nhóm C20- diterpen alcaloid được trình bày ở hình 1.7

Hình 1.7 Cấu trúc một số alcaloid thuộc nhóm C20-diterpen alcaloid

* Alcaloid bisditerpenoid

Khung cấu trúc của nhóm alcaloid bisditerpenoid được trình bày ở hình 1.8

Bảng 1.1 Một số alcaloid thuộc nhóm khác phân lập từ chi Aconitum

[116]

14

1.2.1.2 Flavonoid

Những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới còn quan tâm tới nhóm chất

flavonoid trong chi Aconitum Nhiều flavonoid đã được phân lập và thử tác dụng sinh học [76], [91], [100], [122] Các flavonoid này được chia thành 2 nhóm chính là: dẫn

chất quercetin và dẫn chất kaempferol Trong các flavonoid đã phân lập được từ chi

Aconitum, có đặc điểm chung là phần nhóm thế, thường thế vào vị trí số 3 hoặc số 7

hoặc thế vào cả vị trí số 3 và số 7 trong nhân quercetin hoặc kaempferol Trong các phân tử đường thế vào nhân quercetin hoặc kaempferol thường gặp đó là: rhamnose, glucose, galactose Cấu trúc chung của 2 nhóm dẫn chất quercetin và kaempferol được trình bày ở hình 1.9

Hình 1.9.Khung cấu trúc chung của 2 nhóm dẫn chất quercetin và kaempferol

Ghi chú: R1, R2 là nhóm thế hoặc phân tử đường thế vào khung quercetin, kaempferol

Một số flavonoid phân lập từ chi Aconitum được trình bày ở bảng 1.2 và bảng 1.3

* Nhóm dẫn chất quercetin

Bảng 1.2 Flavonoid thuộc nhóm dẫn chất quercetin phân lập từ chi Aconitum

Quercetin - 3-O-α-L-rhamno pyranosyl

17

Bảng 1.3 Flavonoid thuộc nhóm dẫn chất kaempferol phân lập từ chi Aconitum

Năm 1986, Tomoda và cộng sự đã phân lập được polysaccharid là aconitan A

từ Phụ tử sống thuộc loài A carmichaeli, thử thấy có tác dụng hạ đường huyết [101]

Tuy nhiên từ năm 2006 khi Zhao và cộng sự phân lập được một polysaccharid đặt tên

là FPS-1 có tác dụng tăng cường miễn dịch [46], nhiều nhà khoa học bắt đầu quan tâm

đến nhóm chất này trong các loài thuộc chi Aconitum Đến nay có ít nhất 8 công bố về thành phần polysaccharid từ chi Aconitum được trình bày ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số chất và phân đoạn polysaccharid chiết xuất từ chi Aconitum

2

Aconitan A, α-(1→6)-D-glucopyranosid, (8700

A.zaravschanicum

5 Phân đoạn polysaccharid (dịch chiết nước) A kusnezoffii Rchb [38]

6 Phân đoạn polysaccharid (dịch chiết nước)

A coreanum

Ngoài 3 nhóm chất chính nêu trên, trong chi Aconitum các nhà khoa học còn

phân lập được một số chất thuộc các nhóm: acid béo, sterol, đường… được trình bảy ở bảng 1.5

Bảng 1.5 Một số chất thuộc nhóm chất khác phân lập từ chi Aconitum

10 Daucosterol

A coreanum (H.Lév.)

Rapaics

[44]

15 D-mannitol

A coreanum (H.Lév.)

20

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Ô đầu trồng ở Việt Nam

Theo một số tài liệu [11], [22], [23], [27] về cây Ô đầu trồng ở Việt Nam: cây trồng ở Sa Pa có hàm lượng alcaloid toàn phần ở củ mẹ 0.36-0.8 %, củ con 0.78-1.17

% Trong thành phần alcaloid có aconitin và hypaconitin, ngoài ra còn 8 vết hiện màu với thuốc thử Dragendorff trên sắc ký lớp mỏng Aconitin dễ bị thủy phân thành acid acetic và benzoylaconin Độ độc benzoylaconin chỉ bằng 1/400-1/500 aconitin Thủy phân tiếp benzoylaconin cho một phân tử acid acetic và aconin, độ độc của aconin bằng 1/10 benzoylaconin

Với cây Ô đầu trồng ở Sa pa - Lào Cai [11]: Trong các bộ phận của cây như: thân cây, củ, lá, hoa, quả và hạt đều có các hợp chất alcaloid, acid hữu cơ, đường tự

do, acid amin Từ Phụ tử phân lập các chất là: karacolin, neolin, benzoylmesaconitin

(nhóm alcaloid), acid benzoic, ß-sitosterol Hàm lượng alcaloid toàn phần trong Phụ tử

là: 0.91-1.1 %

Nhận xét: Thành phần hóa học của chi Aconitum phong phú, đa dạng với nhiều nhóm

chất khác nhau Giữa các loài khác nhau cũng có những chất giống nhau Tuy nhiên trong cùng một loài nhưng tại các nước, các vùng khác nhau lại có những hợp chất khác nhau Đặc biệt tại Ấn Độ theo Eti Sharma và A K Gaur cho thấy có loài không

có độc như: A heterophyllum, A laeve và A routndifolium Những nghiên cứu này rất quan trọng trong việc sử dụng các loài thuộc chi Aconitum để phòng chữa bệnh sao

cho an toàn hiệu quả Vì vậy đến nay có nhiều công trình công bố về nghiên cứu thành

phần hóa học chi Aconitum, nhưng những năm gần đây, các nhà khoa học vẫn tiếp tục

nghiên cứu hóa thực vật đối với chi này và cũng đã tìm thêm được nhiều hợp chất mới Với loài Ô đầu trồng ở Việt Nam cho đến nay mới phân lập được 5 alcaloid là: aconitin, hypaconitin, karacolin, neolin, benzoylmesaconin và hai thành phần khác là:

acid benzoic, ß-sitosterol Như vậy vẫn còn rất nhiều hợp chất chưa được biết đến

trong cây Ô đầu Việt Nam, cần được nghiên cứu tiếp Nghiên cứu thành phần hóa học

sẽ giúp tìm ra chất đối chiếu, dấu vân tay trong việc tiêu chuẩn hóa dược liệu, minh chứng cho cách sử dụng Ô đầu, Phụ tử, đồng thời góp phần phát triển các dạng thuốc hiện đại, sử dụng trong chăm sóc sức khỏe Tại Trung Quốc, khi các nhà khoa học tìm

21

ra hợp chất lappaconitin - một alcaloid có tác dụng giảm đau mạnh và không gây nghiện nên đã bào chế thành các dạng thuốc tiêm, viên, bột dùng trong điều trị chấn thương, các bệnh viêm xương khớp, giảm đau đối với bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối

1.3 Tác dụng sinh học, độc tính và công dụng một số loài thuộc chi Aconitum L 1.3.1 Tác dụng sinh học và độc tính một số loài thuộc chi Aconitum L

1.3.1.1 Tác dụng giảm đau

Tác dụng giảm đau của chi Aconitum đã được biết đến từ lâu và có nhiều

nghiên cứu về tác dụng này Theo Dacheng Hao [50], tác dụng giảm đau chủ yếu do tác động của nhóm alcaloid, có sự liên quan giữa cấu trúc và tác dụng giảm đau Yếu

tố quyết định đến tác dụng giảm đau trong cấu trúc của alcaloid diterpenoid là: nhóm aroyl/nhóm aroyloxy ở vị trí C-4 hoặc C-14, nhóm amin trong vòng A, một acetoxyl hoặc một nhóm ethoxyl tại C-8, một ester thơm tại C-14 hoặc trạng thái bão hòa của vòng D Alcaloid diterpen có tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương bởi kích thích các thụ thể μ-opioid và ức chế hấp thu noradrenalin [51] Một số dịch chiết hoặc

alcaloid tinh khiết phân lập từ một số loài thuộc chi Aconitum thấy có tác dụng giảm

đau theo cơ chế trung ương được nghiên cứu trên mô hình mâm nóng và máy tail-flick [51], [52], một số có tác dụng giảm đau theo cơ chế ngoại vi [136], [142] được nghiên cứu trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic

1.3.1.2 Tác dụng tăng cường miễn dịch

Qua các thử nghiệm cho thấy, chi Aconitum có tác dụng tăng cường miễn dịch

thông qua tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể (tăng nồng độ IgG…), tăng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (tăng nồng độ IL-2…) và tác dụng này chủ yếu được thử nghiệm đối với thành phần polysaccharid Cụ thể thông qua các nghiên cứu sau: Theo

Tiantian Liu và cs, các sản phẩm chế biến từ Phụ tử (A carmichaeli Debeaux) là: Yanfuzi, Danfupian, Baifupian đã làm tăng số lượng tế bào lympho lách với IC50 của

Phụ tử là 18 mg/ml, Yanfuzi là 32 mg/ml, giá trị EC50 của Baifupian là 25mg/ml và

Danfupian là 28mg/ml [129] Theo Li H và cs, phân đoạn chứa polysaccharid ACP-I

chiết từ củ (A.coreanum Rapaics), được đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch thông qua thúc đẩy sự tiết cytokin ở chuột thí nghiệm, làm tăng số lượng IL-2, TNF-α và

22

IFN- γ [88] Phân đoạn dịch chiết polysaccharid từ Phụ tử (A.kusnezoffii Reichb.) thử

nghiệm với các liều 50, 100, 200 mg/kg trên chuột cho thấy tăng số lượng tế bào lympho, đại thực bào so với nhóm chứng [130] Polysaccharid FPS- 1 phân lập từ củ

(A.carmichaeli Debx.), có tác dụng kích thích miễn dịch trên chuột nhắt trắng, làm tăng cả tế bào lympho B và T in vivo và in vitro [46]

1.3.1.3 Tác dụng chống oxy hóa

Đến nay, các nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa của chi Aconitum mới chỉ

thấy có nghiên cứu trên in vitro, với các thử nghiệm quét gốc tự do như: DPPH,

hydroxy, anion peroxyd, H2O2, ion sắt, sản phẩm của quá trình tự oxy hóa phentriol Tác dụng chống oxy hóa này chủ yếu được thử nghiệm đối với thành phần

1,2,3-flavonoid và polysaccharid chiết xuất từ chi Aconitum Kết quả nghiên cứu của đối với cao chiết ethanol của lá A.carmichaeli Debx [137], thành phần flavonoid chiết xuất từ

lá A.napellus Lusitanicum [98], dẫn chất của quercetin chiết từ lá A.anthora L [49], phân đoạn chứa flavonoid chiết từ lá một số loài Aconitum [110], dịch chiết polysaccharid từ củ (A kusnezoffii Reichb.) [130], phân đoạn chứa polysaccharid ACPS-2 và ACPS-3 chiết từ củ (A coreanum Rapaics) [44], polysaccharid có cấu trúc là: α -(1→3),(1→4)-D-glucan (AKP) phân lập từ củ (A kusnezoffii Reichb.) [131] đều

thấy có tác dụng chống oxy hóa trên in vivo

1.3.1.4 Tác dụng gây hạ đường huyết

Các nghiên cứu về tác dụng gây hạ đường huyết của chi Aconitum, được thực hiện trên mô hình gây hạ dường huyết bằng alloxan hoặc streptozotocin với các mức

liều khác nhau của cao chiết, phân đoạn dịch chiết, chất tinh khiết Cụ thể như sau :

cao chiết ethanol từ củ (A napellus L.) có tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây

đái tháo đường bởi alloxan với các liều 100, 200, 400 mg/kg bằng đường uống, glibenclamid (2.5 mg/kg) được dùng làm chất đối chiếu [53] Chế phẩm Hei-Shug-

Pian bào chế từ củ (A.carmichaeli Debx.), trên mô hình gây đái tháo đường bởi

streptozotocin, mức liều chế phẩm 12.5 đến 50 mg/kg thấy có tác dụng hạ đường huyết

[93] Hikino H đã thử chất aconitan A phân lập từ A.carmichaeli Debx thấy có tác

dụng hạ đường huyết trên mô hình gây đái tháo đường gây bởi streptozotocin [101]

23

1.3.1.5 Tác dụng chống tăng sinh tế bào, chống ung thư

Một số nghiên cứu về tác dụng chống tăng sinh tế bào, chống ung thư của chi

Aconitum được thực hiện đối với thành phần alcaloid, trên một số dòng tế bào ung thư

cho thấy tác dụng gây ức chế sự tăng sinh, xâm lấn, di căn của tế bào ung thư Theo

Dacheng Hao và cs cao chiết ethanol từ củ A vaginatum E Pritz, có tác dụng ức chế

sự tăng sinh, xâm lấn và di căn của dòng tế bào ung thư phổi A549 Alcaloid amid từ

A taipeicum cho thấy hoạt động kháng u do ức chế các tế bào K562 [50] Cao chiết

ethanol từ củ một số loài Aconitum có tác dụng gây độc tế bào phụ thuộc vào liều, trên

ba dòng tế bào ung thư: HepG2, Hela, sP2/0 [137] Hợp chất bis

[O-(14-benzoylaconine -8-yl)] suberat được tổng hợp từ aconitin, thử nghiệm thấy có tác dụng trên các dòng tế bào ung thư: SK - MEL -5 và SK - MEL -28, COLO -205 và HT - 29

(ung thư trực tràng) và MDA – MB - 468 (ung thư vú) [47] Alcaloid benzoylaconin phân lập từ A.karacolicum Rapaics, có tác dụng chống tăng sinh tế bào

8-O-azeloyl-14-ung thư trên 3 dòng tế bào ở người [107] Theo Hazawa HeLa, Raji và cs, dẫn xuất của

alcaloid norditerpenoid có khung C-20 và C-19 từ chi Aconitum có tác dụng chống ung

thư trên hai dòng tế bào A172, A549 [86]

1.3.1.6 Tác dụng trên tim mạch

Một số nghiên cứu về tác dụng trên tim mạch của chi Aconitum được thử

nghiệm đối với thành các alcaloid, cho thấy các alcaloid này có tác động trên cơ tim, trên động mạch chủ làm ảnh hưởng tới nhịp tim, lực co bóp cơ tim và cung lượng tim Higenamin là một benzylisoquinolin alcaloid làm tăng sức co bóp cơ tim, làm giãn động mạch chủ, ức chế epinephrine, ADP hoặc chống kết tập tiểu cầu, làm hạ huyết áp [50] Mesaconin, hypaconin và beiwutinin cho thấy tác động trên tim mạnh, làm tăng khả năng tưới máu, cải thiện hiệu lực co bóp và chức năng thất trái nhưng không ảnh

hưởng nhịp tim [94] Alcaloid phân lập từ A coreanum L có tác dụng chống loạn nhịp

tim [139] Theo Dezso Csupor và cộng sự, 111 alcaloid diterpen chia thành 2 nhóm: gây loạn nhịp tim (Các alcaloid này có khung cấu trúc chung của nhóm aconitan Khả

năng gây loạn nhịp tim phụ thuộc vào nhóm thế như: β-OH trên 13, α-aroyl trên

C-14, β-acetat trên C-8 và một nguyên tử nitơ trong phân tử) và chống loạn nhịp tim

sau tăng huyết áp [137] Nước sắc Ô đầu, Phụ tử có tác dụng hạ huyết áp khi tiêm tĩnh

mạch chó và mèo đã gây mê Tác dụng này nhanh và ngắn, thông qua cơ chế giãn mạch [48] Aconitin và những chất tương tự tiêm tĩnh mạch mèo ở liều 0.01 mg/kg và chuột cống trắng ở liều 0.05 mg/kg, ban đầu có tác dụng hạ huyết áp [107] Lappaconitin và N- desacetylappaconitin tiêm tĩnh mạch chó ở liều 0.15 mg/kg gây hạ huyết áp động mạch và giảm tần số tim [86]

- Tác dụng chống tiêu chảy: Dịch chiết A heterophyllum Wall đã được nghiên cứu

tác dụng chống tiêu chảy, làm se niêm mạc và làm thuốc bổ Nó là thành phần chính

25

trong thuốc chống tiêu chảy Diarex Vet, có tác dụng mạnh khi thử trên chuột ở liều 750mg/kg [107]

- Tác dụng kháng khuẩn: Theo Nidhi Srivastava và cộng sự (2011) nghiên cứu dịch

chiết methanol của Aconitum heterophyllum Wall thấy có sự ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis [108] Demethylenedelcorin, lepenin phân lập từ A sinomontanum có tác dụng ức chế hoạt động của nấm và vi khuẩn Cao chiết methanol 90% của A chasmanthum Stapf có tác dụng ức chế một số vi khuẩn gram âm Dịch chiết A tanguticum ức chế mạnh các loại

vi khuẩn Fusarium semitectum và Staphylococcus aureus nhưng có tác dụng yếu với

Escherichia coli Condelphin hydroclorid có tác dụng ức chế E coli, Strept haemolyticus, Staph albus, Staph aureus ở nồng độ 0.125 – 0.33 mg/ml [11]

- Tác dụng kháng nấm: Các phân đoạn dịch chiết có tác dụng mạnh trên nấm Trichophyton mentagrophyte, đặc biệt phân đoạn etheyl acetat có tác dụng với hầu

hết các loại nấm [11]

- Tác dụng kháng vi rút: Cao chiết Phụ tử, benzoylmesaconin, benzoylaconin,

benzoylhypaconin, 14- anisoyaconin, neolin, ignavin, mesaconin, benzoylaconin, 16-

pyromesaconin, pyraconin, 15 – α – hydroxyneolin, ajaconin hoặc benzoylmesaconin

kết hợp với interleukin 12 (IL - 12) [107] đều có tác dụng chống nhiễm vi rút herpes simplex typ 1 và tăng tỉ lệ sống ở chuột nhắt trắng bị tổn thưởng bởi nhiệt Benzoylmesaconin còn làm tăng tỉ lệ sống ở chuột nhắt trắng nhiễm vi rút gây suy giảm miễn dịch đồng thời nhiễm vi rút herpes simplex typ 1 hoặc ở chuột bị tổn

thương bởi nhiệt và nhiễm Cytomegalo vi rút [108]

- Tác dụng với ký sinh trùng: Atisinium clorid, alcaloid chính phân lập từ A orochryseum, có tác dụng ức chế hoạt động của TM4 và K1 của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum [107]

- Tác dụng ức chế emzym [108]: Thuốc ức chế enzym trên lâm sàng rất hữu ích Chất

ức chế tyrosinase, điều trị rối loạn sắc tố melanin, rất quan trọng trong mỹ phẩm làm trắng sau khi da bị cháy nắng Một nghiên cứu tác dụng ức chế tyrosinase của 5 alcaloid cho thấy chỉ có lappaconitin và puberanin ức chế yếu enzyme tyrosinase với

IC50 = 93.33 và 205.21 mg/kg Hai alcaloid heterophyllin A và heterophyllin B phân

26

lập từ A heterophyllum và nhận thấy chúng ức chế hiệp đồng enzym

acetylcholineatrase và butyrylcholinestrase, giúp điều trị bệnh alzheimer

- Tác dụng an thần: Phụ tử sống A carmichaeli Debx và A japonicum Thunb có tác

dụng an thần trên chuột nhắt trắng Phụ tử chế không có tác dụng này [11] Một số thành phần có tác dụng an thần, giảm hoạt động tự nhiên, kéo dài thời gian ngủ do hexobarbital, làm hạ thân nhiệt ở chuột nhắt trắng như: aconitin, hypaconitin, mesaconitin, songoramin, benzoylhypaconin, benzoylaconin, benzoylmesaconin [27]

- Hạ sốt: Phụ tử sống với liều uống 1 g/kg gây hạ nhiệt độ trực tràng chuột cống trắng

1-1.5 oC trong hơn 3 giờ Hypaconitin tiêm dưới da 0.3 mg/kg hoặc aconitin, mesaconitin 0.06 mg/kg gây hạ nhiệt độ trực tràng 1- 3 oC Benzoylaconin cũng có tác

dụng này nhưng ở liều 30 mg/kg [11] Một số dẫn chất như 15-O-actyl-14-O- chlorobenzoylmesaconin và 15-O-acetyl-14-O-p-chlorobenzoyl-aconin cũng có tác

dụng hạ sốt

- Tác dụng lên cơ trơn: Phụ tử sống và các alcaloid như aconitin gây tăng co bóp cơ

trơn hồi tràng chuột cống trắng cô lập nhưng sau khi chế biến thì không có tác dụng

này Tuy nhiên, alcaloid toàn phần của Bắc Ô đầu (A kusnezoffii Reichb.) lại có tác

dụng đối kháng với co thắt cơ trơn hồi tràng chuột lang cô lập do histamin, acetylcholin, albumin gây nên [11], [107]

1.3.1.10 Độc tính

Theo nghiên cứu của Sajan L Shyaula [116], ngộ độc do dùng củ của các loài

thuộc chi Aconitum thường xảy ra do dùng sai liều, không chế biến dược liệu Các

triệu chứng xảy ra nhanh chóng trong vòng 10 đến 20 phút Ban đầu là ngứa ran, nóng rát ở ngón tay, ngón chân, tiếp theo là đổ mồ hôi, ớn lạnh, khô miệng, mất cảm giác, nôn mửa, đau bụng dữ dội, tê liệt cơ xương, rối loạn nhịp tim Nguyên nhân chính gây

tử vong là trụy tim mạch, loạn nhịp thất Tám giai đoạn khi bị ngộ độc được mô tả bởi Bhaisajya Ratnawali Qua phân tích nước tiểu của bệnh nhân bị ngộ độc thấy rằng các

trường hợp bị ngộ độc khi dùng các loài thuộc chi Aconitum ở Nepal trong nước tiểu

thường có các alcaloid: bikhaaconitin, pseudoaconitin, indaconitin và yunaconitin Xử

lý ngộ độc các alcaloid trên cần thực hiện ngay và giám sát chặt chẽ nhịp tim, huyết

áp Nguyên nhân gây ra ngộ độc chủ yếu là các alcaloid diterpenoid có khung cấu trúc

27

C-19 và C-20 Các alcaloid chính có độc tính cao là: aconitin, mesaconitin, hypaconitin Các alcaloid này có thể bị chuyển hóa thành dạng ít độc hoặc không còn độc tính (aconitin→ benzoylaconin → aconin; mesaconitin→ benzoylmesaconin → mesaconin; hypaconitin→ benzoylhypaconin→ hypaconin) [56], [128] Theo dõi 10

ca ngộ độc do sử dụng các loài thuộc chi Aconitum chủ yếu là A kusnezoffii trong y

học cổ truyền để chữa bệnh đau nhức xương khớp Kiểm tra thấy trong các trường hợp đều phát hiện có alcaloid yunaconitin [73]

Giá trị LD50 của một số alcaloid được trình bày ở bảng 1.6

Bảng 1.6 LD50 của một số alcaloid của chi Aconitum L [11]

Nhận xét: Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây về tác dụng của chi Aconitum,

cho thấy các loài thuộc chi này có nhiều tác dụng sinh học có thể ứng dụng trên lâm sàng Đặc biệt là tác dụng chống viêm giảm đau, tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan

và tác dụng tăng cường miễn dịch đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu

để ứng dụng trên lâm sàng Hiện nay cây Ô đầu trồng ở Việt Nam mới được nghiên cứu về tác dụng chống viêm, giảm đau của dịch chiết nước, chiết từ phụ tử chế.Mặt khác, trên thế giới Ô đầu, Phụ tử không chỉ sử dụng trong y học cổ truyền mà còn sử dụng dưới các dạng bào chế hiện đại như dạng thuốc tiêm, viên, ống nước Chính vì vậy, đề tài luận án định hướng tập trung nghiên cứu các tác dụng: tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa bảo vệ gan, giảm đau trên phân đoạn dịch chiết có độc tính thấp, được chiết từ Ô đầu, Phụ tử sống Điều này phù hợp với xu hướng sử dụng dược liệu trong y học hiện đại, cũng như điều kiện nghiên cứu phát triển sản phẩm từ dược liệu tại Việt Nam

1.3.2 Công dụng

1.3.2.1 Ô đầu [3], [6], [27]

- Công năng: Khu phong, trừ thấp tý, ôn kinh chỉ thống

- Chủ trị: Dùng trị đau khớp, tê mỏi cơ

- Cách dùng: Dùng ngoài xoa bóp dưới dạng thuốc ngâm rượu, không được uống

1.3.2.2 Phụ tử [3], [6], [27]

- Công năng: hồi dương cứu nghịch, bổ hoả trợ dương, tán hàn, chỉ thống

- Chủ trị: chứng vong dương, thoát dương, chân tay lạnh, đau nhức xương khớp, lưng gối đau lạnh, chân tay phù nề

29

- Cách dùng, liều lượng: ngày dùng 4-12 g dược liệu đã bào chế đạt tiêu chuẩn giới hạn aconitin, dạng thuốc sắc

1.3.3 Một số sản phẩm sản xuất từ một số loài thuộc chi Aconitum L

Trên thị trường có nhiều sản phẩm sản xuất từ cây Ô đầu [11], [152] như :

+ Bát vị quế phụ, cồn xoa bóp Jamda của công ty cổ phần Traphaco, trị đau nhức xương khớp

+ Sản phẩm Vatsanabha của Ấn Độ dùng giảm đau, chống viêm khớp

+ Các sản phẩm khác chứa Aconitum với tác dụng tăng cường miễn dịch, chống viêm,

giảm đau, tim mạch với các tên biệt dược như: Aconite 30C, Boiron, HylADNs, Aconit, Aconiti Tuber, Acónito, Aconitum, Ativisha, Autumn Monkshood, Bachnag, Bikhma, Blue Monkshood

Hình 1.10 Một số hình ảnh về thuốc sản xuất từ một số loài thuộc chi Aconitum

30

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

Thu hái mẫu cây Ô đầu trồng ở xã Cao Mã Pờ, huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Lấy củ mẹ, củ con khi cây đã ra quả và lụi Lấy lá cây khi cây mới ra quả Nguyên liệu được sấy khô ở 600

C, bảo quản trong túi polyetylen kín, khô ráo Mẫu nghiên cứu về thành phần hóa học là các bộ phận của cây Ô đầu, mẫu nghiên cứu về tác dụng sinh học và độc tính cấp là các phân đoạn dịch chiết từ củ, lá cây Ô đầu

Mẫu cây có hoa quả để định tên khoa học thu hái vào ngày 29/9/2012 tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Mẫu cây tươi được tiến hành làm tiêu bản và lưu giữ tại: + Phòng tiêu bản Khoa tài nguyên cây thuốc, Viện Dược liệu, tiêu bản số: 9938

+ Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật, trường ĐH Dược Hà Nội, tiêu bản số: HNIP/1057/14

+ Bộ môn Dược liệu-Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, ĐHQGHN, tiêu bản số: SMPIP/01/14

2.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng cả 2 giống khoẻ mạnh, khoảng 06 tuần tuổi, trọng lượng khoảng 20± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp

2.3 Trang thiết bị và hóa chất

2.3.1 Trang thiết bị

*Thiết bị để nghiên cứu về thực vật:

- Máy ảnh, thiết bị phân tách ADN điện di bằng bản gel agarose, thiết bị giải trình tự gen tự động Nextseq 500

* Thiết bị nghiên cứu thành phần hoá học và xác định cấu trúc các chất:

- Máy quang phổ UV-Vis Cary 60 tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 (Merck, Germany) được hoạt hoá ở 1100C trong 1giờ

31

- Thiết bị siêu âm Utrasonic cleaner- MRC tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

- Máy đo pH AL 20 pH- Aqualitic tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

- Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

- Máy đo điểm chảy Kofler micro-hotstage tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

- Máy đo phổ ICP-MS, Perkin Elmer, tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

- Phổ hồng ngoại được đo dưới dạng viên nén KBr trên máy Impact 410 Nicolet tại Viện Hoá học, VHLKHCNVN

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap tại Viện Hoá học, VHLKHCNVN

ESI Phổ cộng hưởng từ (1D và 2DESI NMR) được đo trên máy Bruker Avance AM500 FTESI NMR tại Viện Hoá học, VHLKHCNVN

*Thiết bị thử tác dụng sinh học, thực hiện tại Viện Dược liệu và Trường ĐH Y Hà Nội:

- Máy đo phản ứng đau tail-flick (series 16881), sản xuất bởi Ugo – Basile, Italy

- Máy đo quang UV-Vis mini 1240 Shimadzu, Nhật Bản

- Máy nghiền đồng thể hãng IKA, Malaysia

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout

- Máy xét nghiệm huyết học tự động ABC (Animal Blood Counter)

- Máy xét nghiệm hóa sinh máu Screen master

- Máy Hot plate model – DS37, hãng Ugo-Basile

2.3.2 Hóa chất

- Thuốc đối chiếu: Silymarin (biệt dược Safegan® 70)

- Thuốc đối chiếu: Aspirin (Aspégic) gói bột 100mg của hãng Sanofi aventis, Pháp

- Chất chuẩn: Codein phosphat (99.2 %), aconitin (99.0 %), D-glucose (98.6 %),

quercetin (99.0 %) của hãng Fermentas (Đức), Sigma Aldrich (Mỹ)

- Nhũ dịch OA (Ovalbumin + Al(OH)3): dùng làm kháng nguyên gây mẫn cảm cho chuột

- Hồng cầu cừu: máu tĩnh mạch cừu được lấy trong điều kiện vô trùng, bảo quản trong dung dịch alsever (glucose 24.6 g, natricitrat 9.6 g, natriclorid 5.05 g, nước cất vừa đủ

32

1200 ml, pH 6.1), ở nhiệt độ 4 0C, sử dụng trong thời hạn 2 tuần Sản phẩm của công

ty Dược phẩm Nam Khoa

- Kit định lượng IgG, IL-2, TNF-α của Hãng Invitrogen, 542 Flynn- Camarillo, CA

93012 Mỹ

- Kit định lượng ALT, AST và bilirubin do hãng Human cung cấp

- Các dung môi hoá chất tiêu chuẩn phân tích (quy định của Dược điển Việt Nam IV)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu về thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa

- Làm tiêu bản mẫu cây

- Thẩm định tên khoa học của cây trên cơ sở:

+ Phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với khoá phân loại thực vật [89], so sánh với các mẫu tiêu bản cây Ô đầu đang lưu tại Viện Dược liệu

+ Lấy mẫu lá cây tươi để chiết và phân tích ADN, giải trình tự gen, so sánh với mẫu

trình tự gen của loài thuộc chi Aconitum [15], [83]

* Tách chiết ADN tổng số:

ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết ADN DNeasy plant mini kits (QIAGEN, USA) ADN toàn phần được kiểm tra lại bằng phương pháp điện di trên gel agarose [53]

*Khuếch đại ADN bằng PCR:

Đoạn trình tự ADN mARN ITS1-5,8S-ITS2 được khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS5 – GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG và ITS4 –

TCCTCCGCTTATTGATATGC

Hình 2.1.Vùng gen khảo sát ITS1-5,8S-ITS2

33

C trong 3 phút.Tiến hành 35 chu kỳ (Biến tính: 94 oC trong 1 phút + Bắt cặp: 54 o

C trong 1 phút + Khuếch đại: 72 o

C trong 1 phút) Pha tổng hợp cuối cùng: 72 o

C trong 8 phút

* Điện di ADN trên gel agarose

Nguyên tắc: Các đoạn ADN mang điện tích âm nên di chuyển trong điện trường theo chiều từ cực âm sang cực dương Trên bản gel agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường Nhuộm ADN bằng Ethidium bromid để quan sát ADN dưới ánh sáng tử ngoại, bước sóng 254 nm

Tiến hành: Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel Chạy điện di ở điện thế 110 V Sau đó nhuộm bản gel bằng Ethidium bromid, rửa sạch bằng nước cất rồi quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

* Phương pháp tinh sạch ADN

Để tinh sạch ADN, sử dụng kit tinh sạch của hãng Fermentas (Đức) gồm các bước tiến hành như sau:

- Lấy 100 L đệm tách ADN, cùng với 100L ADN rồi trộn đều

- Chuyển lên cột Genne JetTm Sau đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong

Nguyên tắc: Dựa theo phương pháp Sanger cải tiến có sử dụng các

dideoxynucleotid Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang

có màu khác nhau Nhờ vậy tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotid sẽ có cùng một màu Trình tự ADN được giải trình tự bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc) trên máy đọc trình tự tự động

34

* So sánh trình tự ADN

Trình tự ADN của các mẫu được phân tích bằng phần mềm MEGA 6.0 và so sánh

với ADN của loài thuộc chi Aconitum đã công bố trên genbank bằng công cụ

NCBI/BLAST, công cụ này sẽ chỉ ra độ tương đồng của các gen giữa loài nghiên cứu với các công bố trước đây [146]

2.4.2 Nghiên cứu thành phần hoá học

- Định tính các nhóm chất hữu cơ [1], [13], [20]

- Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp acid-base [6], [127]:

Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (Ô đầu, Phụ tử) hoặc một lượng phân đoạn

D, E tương đương khoảng 10 g dược liệu cho vào bình nón nút mài 250 ml Thêm 50

ml hỗn hợp ether-cloroform (3:1) và 4 ml dung dịch amoniac Đậy nắp, lắc kỹ để qua đêm, gạn lọc thu dịch Lắc bã với 50 ml hỗn hợp trên trong 1 giờ, lọc thu dịch lọc Rửa

bã 3-4 lần nữa, mỗi lần 15ml hỗn hợp trên Gộp dịch lọc và dịch rửa, bốc hơi cách thủy đến khô ở nhiệt độ thấp (60-65 0

C) Cắn hòa tan bằng 5ml ethanol, thêm chính xác 15ml H2SO4 0.02N và 15ml nước cất mới đun sôi để nguội, 3 giọt chỉ thi đỏ methyl Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.02N đến khi xuất hiện màu vàng

1 ml dung dịch H2SO4 0.02N tương đương với 12,9mg alcaloid toàn phần tính theo aconitin

Hàm lượng phần trăm alcaloid toàn phần được tính theo công thức:

X% =

Trong đó:

- X %: là hàm lượng alcaloid toàn phần (tính trên mẫu khô tuyệt đối)

- p: là khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (g)

- n : số ml dung dịch NaOH 0.02N tham gia phản ứng (ml)

- Định lượng aconitin bằng phương pháp HPLC [11], [13], [75], [127]

- Định lượng flavonoid toàn phần và polysaccharid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến [28], [33], [36], [34], [58], [96], [97]