+ Mẫu nghiên cứu: Phân đoạn dịch chiết từ lá cây Ô đầu chứa flavonoid
+ Nguyên lý: CCl4 là chất gây tổn thương gan kinh điển. Khi vào cơ thể, nó biến đổi thành các gốc tự do, các gốc này thúc đẩy quá trình peroxy hoá lipid (POL) của màng tế bào gan, tạo ra sản phẩm độc cho tế bào gan, biểu hiện làm tăng MDA (Malonyl dialdehyd – là sản phẩm của quá trình POL), phá vỡ tế bào gan gây tăng enzym gan trong máu [12], [39], [42].
+ Cách tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên 6 lô chuột nhắt: 1 lô chứng sinh lý, 1 lô chứng bệnh lý, 3 lô mẫu thử với các liều 10 mg, 20 mg và 30 mg phân đoạn chứa flavonoid/kg thể trọng chuột cho 1 ngày (tương đương với khoảng 4, 8, 12 g dược liệu/kg TT), 1 lô uống thuốc đối chứng silymarin liều 100 mg/kg. Tất cả các chuột (trừ lô chứng sinh lý được tiêm dầu olive) được tiêm CCl4 với liều 0.2 ml/ 20 g chuột dung dịch CCl4 7% pha trong dầu olive, tiêm cách 2 ngày một lần. 3 lô mẫu thử và lô đối chứng dương được cho uống trong 8 ngày. Song song, lô chứng sinh lý và lô chứng bệnh được cho uống nước. Đến ngày thứ 8, sau khi uống 1 giờ, lấy huyết thanh để định lượng AST, ALT và bilirubin và lấy gan để định lượng MDA [100], [110], [123].
Hoạt độ AST, ALT, bilirubin được định lượng theo KIT định lượng Human, sử dụng máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout tại Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu.
Định lượng MDA theo phương pháp Wasowich và Balahoroglu, tiến hành tại Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu.
Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: Ngày thứ 8: Sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột, lấy 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0.15 M ở nhiệt độ 0 – 5 oC (nước đá). Hút 300 l dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml
42
H2O, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0.25 % pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100 oC trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3.5 ml n-butanol, ly tâm 3000v/phút x 10 phút, hút phần dịch nổi đem đo quang ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình POL của chất thử [49], [87], [98].
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel [18]. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M ± SE). Đánh giá, so sánh giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t-Student.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học theo T test - Student [16]. Kết quả được trình bày
X± SE. Quy ước:
*: p ≤ 0,05; **: p ≤ 0,01; ***: p ≤ 0,001 so với lô chứng sinh học Δ: p ≤ 0,05 ; ΔΔ: p ≤ 0,01; ΔΔΔ: p ≤ 0,001 so với lô mô hình
43
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật
Cây thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng 0.6- 2 m hoặc hơn, phần thân trên mặt đất, lụi hàng năm. Rễ củ gồm củ mẹ ở giữa và các củ con mọc xung quanh, có hình con quay, hình nón thuôn, đường kính 1-4 cm, dài 3-9 cm. Thân khí sinh mọc thẳng ít phân cành, phần thân non và ngọn có lông đơn bào cong. Lá đơn, mọc so le, phiến lá có dạng gần hình tim tròn hoặc xẻ 3 thùy sâu, hai thùy bên xẻ tiếp thành 5 thùy không đều nhau, mép khía răng cưa to, gân lá 5 hình chân vịt, cuống lá, mặt trên có lông tơ. Cụm hoa dạng chùm đơn, mọc ở ngọn thân và kẽ lá, dài 10-30 cm gồm nhiều hoa màu xanh tím. Cuống hoa dài 2-6 cm, cuống hoa và cụm hoa có lông tơ dày cong, các lá bắc ở phần dưới cụm hoa chia 3 thùy hình mác, 2 lá bắc con nhỏ dài 4- 8mm, rộng 1-2.5 mm, 2 mặt có lông tơ. Hoa không đều lưỡng tính, 5 lá đài mặt ngoài có lông tơ ngắn, lá đài trên hình mũ cao, hơi dẹt trùm lên 2 lá đài bên và 2 cánh hoa dài 2-3cm, rộng 1.8-2.5 cm. Hai lá đài bên hình trứng dài 1.7-2.2 cm, rộng 1.8-2.6 cm. Hai lá đài dưới thuôn dài 1.3-2 cm, rộng không đều nhau. Tràng hoa gồm 2 cánh hoa tiêu giảm, nhẵn, dài 1.8-2.1 cm nằm trong lá đài trên, hai bên cuộn vào thành hình trụ. Nhị nhiều (40-46) không có lông, dài 9-12 mm, chỉ nhị rộng có cánh ở dưới, bao phấn 2 ô đính gốc hình cầu hoặc elip nứt dọc. Bầu trên dài 5-12 mm, có lông nhỏ rải rác. Lá noãn 5, rời, mỗi lá noãn có nhiều noãn, đính bên. Vòi nhụy ngắn hơn bầu nhụy. Quả gồm 5 đại hình elip dài 1.5-2.5 cm, đường kính 0.5 cm, có mỏ ngắn, đài không tồn tại. trong mỗi đại chứa 10-20 hạt dẹt, dài 4-5mm, rộng 2-3 mm, có cánh mỏng.
Đặc điểm hình thái thực vật của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang được trình bày ở các hình từ 3.1 đến 3.10.
44
Hình 3.1. Tiêu bản cây Ô đầu Hình 3.2. Cành mang hoa, quả
Hình 3.3. Lá mặt trên Hình 3.4. Lá mặt dưới
45
Hình 3.5. Hoa Hình 3.6. Các bộ phận của hoa
Hình 3.7. Nhụy hoa Hình 3.8. Nhị hoa
Hình 3.9. Quả và hạt Hình 3.10. Củ
46
3.1.2. Xác định tên khoa học
Căn cứ vào kết quả phân tích đặc điểm hình thái và khóa phân loại Thực vật chí Trung Quốc (2001), cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang đã được xác định tên khoa học là: Aconitum carmichaeli Debeaux. họ Ranunculaceae (Mẫu giám định chi tiết tên khoa học được trình bày trong phụ lục 2)
Mặt khác mẫu lá tươi được chiết xuất, phân tách, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen đã công bố của các loài Aconitum cho kết quả như sau:
* Tách chiết ADN tổng số và thực hiện phản ứng nhân gen PCR: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ADN tổng số sau khi tách được điện di trên gel agarose 1 % cho vạch ADN rõ, băng điện di sạch, không lẫn ARN. ADN tổng số sau khi thực hiện phản ứng nhân gen với đoạn ITS1-5,8S-ITS2 được điện di so sánh với thang ladder chuẩn 100 bps, cho thấy kích thước đoạn trình tự thu được vào khoảng hơn 600 bps. Vạch sản phẩm trên băng điện di đậm, rõ nét nên đủ điều kiện để tiếp tục tinh sạch để thực hiện phản ứng giải trình tự.
Hình 3.11. Điện di ADN tổng số Hình 3.12. Điện di sản phẩm PCR
* Trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2:
Trình tự ADN sau khi giải trình tự thu được gồm 640 bps trong đó có 609 bps hiện rõ, được đưa vào để so sánh với trình tự công bố, trong đó tỷ lệ G-C là 62.3 %, tỷ lệ A-T là 37.7 %. Công cụ NCBI/Blast được sử dụng để so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (mã hiệu genbank: FJ424223) cho thấy trình tự gen thu
47
được tương đồng với trình tự loài A. carmichaeli Debx. đã công bố với số nucleotid tương đồng là 606/609 (tương ứng tỷ lệ tương đồng 99%).
Hình 3.13. So sánh trình tự đoạn gen ITS1-5,8S- ITS2 của mẫu nghiên cứu với trình tự loài đã công bố trên thế giới.
Trong đó: Query là trình tự mẫu nghiên cứu và Sbjct là trình tự loài A. carmichaeli
Debx. đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (mã hiệu genbank: FJ424223) [83], [146].
Kết quả giải trình tự gen (chi tiết xem tại Phụ lục 1) và so sánh trình tự gen của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang với trình tự gen loài là A. carmichaeli Debx. là cơ sở tin cậy để khẳng định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx. Họ Ranunculaceae.
48
3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong cây Ô đầu 3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong cây Ô đầu
3.2.1.1.Định tính các nhóm chất hữu cơ
Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Ô đầu
TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Đánh giá Củ Thân Lá Hoa Hạt (1) (2) (3) (4) (5) (5) (7) (8) (9) 1 Alcaloid TT Mayer +++ ++ +++ +++ ++ Có TT Dragendorff +++ ++ +++ +++ ++ TT Bouchardat +++ ++ +++ +++ ++
2 Polysaccharid TT Lugol +++ - + - - có trong
củ 3 Flavonoid Cyanidin - - ++ ++ - Có trong lá, hoa Kiềm - - +++ ++ ++ FeCl3 5% + + +++ +++ ++
4 Chất béo Để vết mờ trên gấy lọc +++ - - - ++ Có trong
hạt, củ
5 Tinh dầu Có mùi thơm - - - Không có
6 Carotenoid H2SO4 đặc - ++ + + ++ Có trong thân, lá, hoa, hạt 7 Sterol Liebermann – Bourchardat ++ - ++ + - Có trong củ, lá, hoa 8 Coumarin Mở và đóng vòng lacton + - + + - Không có Diazo + - + + - Quan sát huỳnh quang - - - - -
49
10 Acid hữu cơ Na2CO3 khan ++ + ++ + + Có
11 Glycosid tim
TT Xanthydrol - - - - -
Không có
TT Legal - - - - -
12 Antranoid P/ư Bortraeger - - - Không có
13 Saponin Hiện tượng tạo
bọt - - - - - Không có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
14 Đường tự do TT Fehling ++ + + + + Có
15 Acid amin TT Ninhydrin + + + + + Có
Ghi chú: - : Phản ứng âm tính + : Phản ứng dương tính ++ : Phản ứng dương tính rõ +++: Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận xét: Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy thành phần chính là alcaloid có trong củ, thân, hoa, lá, hạt; flavonoid có chủ yếu trong lá; polysaccharid có chủ yếu trong củ. Ngoài 3 thành phần hóa học chính này, cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang còn có acid béo, acid amin, đường tự do, sterol, carotenoid.