Quá trình chiết xuất polysaccharid từ Phụ tử như sau: 500 g bột Phụ tử được ngâm với 3 lít nước cất trong 1 h ở nhiệt độ 90 o
C. Đem siêu âm 20 phút ở 90 o
C. Lọc lấy dịch chiết nước, loại bớt nước bằng cất quay chân không dưới áp suất giảm, nhiệt độ khoảng 90 oC, đến thể tích 300 ml và thêm ethanol 96 % đến tỷ lệ 80 % ethanol về thể tích, ly tâm 15000 vòng/phút, trong 20 phút, thu lấy tủa. Hòa tan tủa trong nước,
Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0.063-0.2 mm. Hệ dung môi là: n- hexan và EtOAc (tỷ lệ EtOAc tăng từ 0-85 %)
Ô đầu sấy khô (3.2 kg), xay thô (5-10 mm)
Ngâm chiết trong EtOH 96 % (6 l x 3 lần x 24 h/lần)
Dịch chiết ethanol
Cao ethanol (298.9 g)
Cao n-hexan (129.5 g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Chiết bằng n-hexan (750 ml x 3 lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
PĐ G (2.9 g) PĐ L (4.0 g) PĐ I (2.5 g) PĐ H (1.7 g) PĐ K (1.5 g) PĐ M (2.3 g) OG OD4 16 mg OD6 18 mg OH OD7 12 mg OK OL OM SK cột silica gel SK cột silica gel
56
tiến hành tủa polysaccharid lần nữa, thu lấy tủa, sấy khô ở 60 o
C được 195.3 g polysaccharid toàn phần. Lấy 30 g bột polysaccharid thô hòa tan trong nước cất và triển khai sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G100, dung môi rửa giải là nước cất thu được phân đoạn chứa polysaccharid chính ký hiệu là: phân đoạn I (3.2 g) và phân đoạn II (2.0 g). Quá trình chiết xuất polysaccharid từ Ô đầu tương tự như Phụ tử. Sơ đồ chiết xuất polysacharid từ Phụ tử được trình bày ở hình 3.16.
Hình 3.16. Sơ đồ chiết xuất polysaccharid từ Phụ tử
Phụ tử sấy khô, xay nhỏ (1-3 mm)
Ngâm với 3 lít nước cất trong 1 h ở nhiệt độ 90 oC, siêu âm 20 phút
Dịch chiết nước
Tủa polysaccharid
Tủa polysaccharid bằng Ethanol 96 %, ly tâm lấy tủa
Dung dịch polysaccharid
Hòa tan tủa trong nước
Polysaccharid toàn phần
Tủa polysaccharid bằng Ethanol 96 %
Triển khai sắc ký trên cột Sephadex G100
57
3.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu [49], [57]
Lá Ô đầu (1.5 kg) sau khi thu hái được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60 0C, sau đó được ngâm chiết trong ethanol (4 lần x 5 l x 8 h/lần ). Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao ethanol (40 g).
Cao ethanol được kiềm hóa bằng dung dịch K2CO3 10 % (pH 8.0), lọc loại tạp thu được dịch nước, acid hóa bằng HCl 10 % (pH 6.0) và muối ăn NaCl bão hòa. Chiết lại bằng ethyl acetat (3 lần x 300 ml/lần) và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 15g cao ethyl acetat. Cao ethyl acetat triển khai sắc ký trên cột silica gel, cỡ hạt 0.063-0.200 mm, rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan - EtOAc với nồng độ EtOAc tăng từ 0-100 %, EtOAc - MeOH với nồng độ MeOH tăng từ 0-80 %) thu được các phân đoạn có kí hiệu là: A, B, C, D, E.
Phân đoạn A (1.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (1:3) thu được chất F1, tinh thể màu trắng, Rf = 0.57 (CHCl3 - EtOAc, 6:4). Chất này được kết tinh lại trong dung môi n-hexan.
Phân đoạn B (0.8 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063mm, rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3 - EtOAc (90:10) thu được chất F2, tinh thể màu trắng, Rf = 0.30 (CH2Cl2 - EtOAc, 90:10). Chất này được kết tinh lại trong dung môi ethyl acetat.
Phân đoạn C (4.2 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc - MeOH (80:20) thu được chất F3 (16 mg), F4 (19 mg). Trong đó F3 là tinh thể vàng, Rf = 0.45 (CHCl3 - MeOH, 85:15); F4 là tinh thể màu vàng, Rf = 0.31 (CHCl3 - MeOH, 85:15).Các chất F3, F4 cho phản ứng hiện màu với dung dịch FeCl3 5 %.
Phân đoạn D (1.0 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, cỡ hạt 0.040-0.063 mm, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan - EtOAc (85:15) thu được chất F7 (21 mg), tinh thể có màu trắng đục, Rf = 0.50 (CH2Cl2 - MeOH, 90:10).
Phân đoạn E (2.1 g) triển khai sắc ký trên cột silica gel pha đảo YMC, cỡ hạt 0.030-0.050 mm, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH - EtOAc (90:10) thu được chất F5
58
(12 mg), F6 (22 mg). Chất F5 tinh thể màu vàng nhạt, Rf = 0.40 (CHCl3 - MeOH, 10:90). Chất F6 có màu vàng, Rf = 0.30 (CHCl3 - MeOH, 15:85).
Sơ đồ chiết xuất các hợp chất từ lá cây Ô đầu được trình bày ở hình 3.17
Hình 3.17. Sơ đồ chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu
Lá Ô đầu sấy khô (1.5 kg), xay thô (5-10 mm)
Ngâm chiết EtOH 96 % (4 lần x 5 l x 8 h/lần) Dịch chiết ethanol
Cao ethanol (80 g)
Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Dịch lọc
Kiềm hóa bằng Na2CO3, lọc loại tạp
Dịch lọc đã được acid hóa
Acid hóa bằng dd HCl + dd NaCl bão hòa
Cao EtAC (15 g)
Chiết 3 lần bằng ethyl acetat, cất thu hồi DM dưới áp suất giảm
Rửa giải bằng sắc ký cột Phân đoạn A (1.1 g) Phân đoạn B (0.8 g) Phân đoạn C (4.2 g) Phân đoạn D (1.0 g) Phân đoạn E (2.1 g) Chất F1 (32 mg) Chất F2 (26 mg) Chất F3 (16 mg) Chất F4 (19 mg) Chất F7 (21 mg) Chất F5 (12 mg) Chất F6 (22 mg)
59