2.4.3.1.Thử độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của phân đoạn chứa alcaloid, phân đoạn chứa polysaccharid chiết từ Phụ tử và phân đoạn chứa flavonoid chiết từ lá cây Ô đầu, trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và phương pháp BLISS [16], [128].
36
Chuột được chia thành các lô khác nhau. Cho chuột uống phân đoạn dịch chiết với liều tăng dần trong cùng một thể tích để xác định liều thấp nhất gây chết 100 % chuột và liều cao nhất không gây chết chuột (gây chết 0 % chuột).
Theo dõi tình trạng chung của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, co giật, kích động…) và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc. Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc.
2.4.3.2. Nghiên cứu tác dụng giảm đau
+ Mẫu nghiên cứu: Phân đoạn dịch chiết từ Phụ tử chứa alcaloid + Phương pháp và cách thực hiện:
* Nghiên cứu tác dụng giảm đau trên mô hình “mâm nóng” (hot plate) [51], [136] - Nguyên lý: Đánh giá tác dụng giảm đau thông qua khả năng đáp ứng với kích thích nhiệt của chuột theo thời gian. Đặt chuột lên mâm nóng (máy Hot plate), luôn duy trì ở nhiệt độ 56 oC bằng hệ thống ổn nhiệt. Thời gian phản ứng với kích thích nhiệt được tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến khi chuột có phản xạ liếm chân sau. So sánh thời gian phản ứng với kích thích nhiệt trước và sau khi uống mẫu nghiên cứu và so sánh giữa các lô chuột với nhau.
- Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con: + Lô 1 (chứng): Uống nước cất liều 0.2 ml/10 g/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 2: Uống codein phosphat 20 mg/kg 1 lần trước khi đo lần thứ hai 1 giờ.
+ Lô 3: Uống MNC liều 12.5 mg (tương đương khoảng 8 g dược liệu)/kg TT/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 4: Uống MNC liều 25 mg (tương đương khoảng 16 g dược liệu)/kg TT/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 5: Uống MNC liều 50 mg (tương đương khoảng 32 g dược liệu)/kg TT/ngày trong 3 ngày.
Chuột ở các lô 1, 3, 4 và 5 được uống nước cất hoặc thuốc thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 3 ngày liên tục.
37
Đo thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột trước khi uống thuốc và sau khi uống thuốc lần cuối cùng 1 giờ.
* Nghiên cứu tác dụng giảm đau bằng máy tail-flick [136], [138]
- Nguyên lý: Đánh giá tác dụng giảm đau thông qua khoảng cách đau (tính từ lúc bắt đầu tác động lực đến lúc chuột có phản ứng quay lại liếm đuôi) so sánh giữa lô chuột uống mẫu nghiên cứu với lô chứng. Phương pháp gây đau bằng máy tail-flick trên đuôi chuột nhắt trắng được thực hiện như sau:
+ Tác dụng một lực tăng dần lên đuôi chuột.
+ Khi đạt ngưỡng gây đau, chuột phản ứng lại bằng cách quay lại liếm vào đuôi ở vị trí gây đau hoặc rút đuôi ra khỏi kim gây đau.
+ Đo các chỉ số trước khi cho uống mẫu nghiên cứu
+ Sau 3 ngày, sau khi uống mẫu nghiên cứu liều cuối cùng 1 giờ, đo lại lần 2 như lần 1 (trước khi uống thuốc).
- Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con + Lô 1 (chứng): Uống nước cất liều 0.2 ml/10 g/ngày
+ Lô 2: Uống codein phosphat 20 mg/kg 1 lần trước khi đo lần thứ hai 1 giờ. + Lô 3: Uống MNC liều 12.5 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 4: Uống MNC liều 25 mg/kg/ngày trong 3 ngày. + Lô 5: Uống MNC liều 50 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
Chuột ở các lô 1, 3, 4 và 5 được uống nước cất hoặc thuốc thử mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 3 ngày liên tục. Đánh giá phản ứng của chuột trước khi uống mẫu nghiên cứu và sau khi uống mẫu nghiên cứu lần cuối cùng 1 giờ và so sánh lô chứng.
* Nghiên cứu tác dụng giảm đau trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic [52], [142]
- Nguyên lý: Dùng acid acetic 1 % tiêm màng bụng chuột để gây quặn đau và đếm số cơn quặn đau trong mỗi 5 phút cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm, so sánh số cơ quặn đau trong mỗi 5 phút của chuột giữa các lô uống mẫu nghiên cứu với lô uống nước cất, lô uống aspirin để đánh giá tác dụng của mẫu nghiên cứu.
38
- Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con: + Lô 1 (chứng): Uống nước cất liều 0.2 ml/10g/ngày trong 3 ngày. + Lô 2: Uống aspirin 150 mg/kg 1 lần trước khi đo lần thứ hai 1 giờ. + Lô 3: Uống MNC liều 12.5 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
+ Lô 4: Uống MNC liều 25 mg/kg/ngày trong 3 ngày. + Lô 5: Uống MNC liều 50 mg/kg/ngày trong 3 ngày.
Chuột ở các lô uống nước cất hoặc mẫu nghiên cứu mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng trong 3 ngày liên tục. Ngày thứ 3, sau khi cho chuột uống mẫu nghiên cứu 1 giờ, tiêm vào ổ bụng mỗi chuột 0.2 ml dung dịch acid acetic 1 % để gây quặn đau. Đếm số cơn quặn đau của từng chuột trong mỗi 5 phút cho đến hết phút thứ 30 sau khi tiêm acid acetic.
2.4.3.3. Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch
+ Mẫu nghiên cứu: Phân đoạn dịch chiết từ Phụ tử chứa polysaccharid
+ Nguyên lý: Gây suy giảm miễn dịch cấp bằng cyclophosphamid trên chuột nhắt bằng cách tiêm màng bụng chuột cyclophosphamid (CY), liều duy nhất 200 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch. Sau đó chuột được uống mẫu nghiên cứu, uống thuốc levamisol trong 7 ngày liên tục, đến ngày thứ 8 giết chuột để đánh giá tác dụng miễn dịch thông qua khả năng phục hồi miễn dịch dựa trên các chỉ số về miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào [5], [46], [74].
+ Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuột thí nghiệm được chia thành 5 lô.
- Lô 1 (Chứng sinh học): Chuột không bị tác động gì (n=10) (uống nước cất). - Lô 2 (Tiêm CY): Chuột được tiêm CY, không điều trị (n=10).
- Lô 3 (Tiêm CY +levamisol): Chuột được tiêm CY, được uống levamisol liều 100 mg/kg (n=10).
- Lô 4 (Tiêm CY + PĐ polysaccharid): Chuột được tiêm CY, được uống PĐ Polysaccharid liều 100 mg/kg thể trọng chuột tương đương 3 g dược liệu/kg TT (n=10).
39
- Lô 5 (Tiêm CY + PĐ polysaccharid): Chuột được tiêm CY, được uống PĐ Polysaccharid liều 300 mg/kg thể trọng chuột tương đương 9 g dược liệu/kg TT (n=10).
Sau khi tiêm màng bụng cyclophosphamid liều 200 mg/kg ở các lô 2, 3, 4 và 5 vào ngày thứ 2 các lô chuột được uống nước cất và các thuốc liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, giết chuột, lấy máu và các tổ chức lympho để làm xét nghiệm [10], [37].
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch
Các giai đoạn nghiên cứu
3 giai đoạn nghiên cứu: Ức chế miễn dịch, mẫn cảm kháng nguyên và điều trị thuốc thử [88], [130].
+ Ức chế miễn dịch: Tiêm CY gây suy giảm miễn dịch dịch thể nhiều hơn miễn dịch
tế bào, đặc biệt thuốc làm ức chế khả năng tiết kháng thể đặc hiệu của các tế bào lympho B mẫn cảm, liều duy nhất 200 mg/kg thể trọng chuột, tiêm màng bụng.
+ Mẫn cảm kháng nguyên:
- Kháng nguyên OA tiêm mũi duy nhất dọc sống lưng chuột liều 0.1 ml/chuột và HCC dung dịch 5 %, tiêm màng bụng, thể tích duy nhất 0.5 ml/chuột (nhóm chứng dương).
Ngày N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 - xét nghiệm Lô 1: Chứng sinh học Lô 2: Tiêm CY Lô 3: Tiêm CY + levamisol Lô 4, 5
( Tiêm CY+DC Ô đầu
CY MC PH
Ghi chú: Uống nước cất MC - Mẫn cảm KN
Uống levamisol PH - Phát hiện (tiêm KN OA) Uống thuốc thử CY - Tiêm cyclophosphamid
40
- Tiêm phát hiện: Kháng nguyên OA và dung dịch làm chứng BSA được tiêm vào hai gan bàn chân chuột với thể tích 0.05 ml một ngày trước khi giết chuột làm xét nghiệm.
+ Điều trị thuốc thử:
Chuột ở các lô 3 được uống levamisol liều 100 mg/kg thể trọng chuột. Chuột ở lô 4 và 5 được uống thuốc thử.
Thời gian uống thuốc thử: 7 ngày với mô hình tiêm CY.
Cách đánh giá tác dụng miễn dịch:
Chuột ở tất cả các lô được đánh giá thông qua các chỉ số
+ Các chỉ số chung:
- Trọng lượng tuyến ức tương đối: được tính là trọng lượng tuyến ức tương ứng với thể trọng chuột.
Trọng lượng tuyến ức tương
đối =
Trọng lượng tuyến ức (mg) Thể trọng chuột (g)
Chuột được giết bằng cách kéo đứt đốt sống cổ, mổ bụng để bộc lộ tuyến ức. Bóc tách lấy toàn bộ tuyến ức và ngâm ngay vào dung dịch nuôi tế bào. Lọc sạch các tổ chức xung quanh, dùng gạc thấm khô rồi đem cân. Ghi lại trọng lượng tuyến ức của từng chuột. Trọng lượng tuyến ức tương đối bằng tỷ lệ trọng lượng các cơ quan này so với trọng lượng của từng chuột tương ứng.
- Số lượng bạch cầu chung, bạch cầu hạt trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu mônô và bạch cầu NK ở máu ngoại vi.
- Xét nghiệm đại thể và vi thể cơ quan miễn dịch: tuyến ức và tủy xương.
+ Các thông số đánh giá ĐƢMD dịch thể:
- Đánh giá chức năng tiết kháng thể của các tế bào lympho B thông qua định lượng IgG đặc hiệu lưu hành trong máu.
+ Các thông số đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào:
- Đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua phản ứng quá mẫn chậm ở gan bàn chân chuột với kháng nguyên OA. Trước khi đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA, tiêm 50 l kháng nguyên OA (liều phát hiện) vào một bên gan bàn chân chuột, bên còn lại tiêm thể tích tương tự dung dịch BSA. Sau 24 giờ tiêm kháng nguyên phát hiện, đo bề dày hai gan bàn chân chuột bằng thước palmer. Lấy
41
hiệu số bề dày phản ứng quá mẫn chậm của chuột với kháng nguyên OA và BSA được chỉ số phản ứng với kháng nguyên OA.
- Tỷ lệ tế bào lympho TCD4 trong máu bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với các chế phẩm của Hãng Invitrogen. - Định lượng các cytokin IL2 và TNF-α trong máu ngoại vi bằng phương pháp ELISA
2.4.3.4. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan
+ Mẫu nghiên cứu: Phân đoạn dịch chiết từ lá cây Ô đầu chứa flavonoid
+ Nguyên lý: CCl4 là chất gây tổn thương gan kinh điển. Khi vào cơ thể, nó biến đổi thành các gốc tự do, các gốc này thúc đẩy quá trình peroxy hoá lipid (POL) của màng tế bào gan, tạo ra sản phẩm độc cho tế bào gan, biểu hiện làm tăng MDA (Malonyl dialdehyd – là sản phẩm của quá trình POL), phá vỡ tế bào gan gây tăng enzym gan trong máu [12], [39], [42].
+ Cách tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên 6 lô chuột nhắt: 1 lô chứng sinh lý, 1 lô chứng bệnh lý, 3 lô mẫu thử với các liều 10 mg, 20 mg và 30 mg phân đoạn chứa flavonoid/kg thể trọng chuột cho 1 ngày (tương đương với khoảng 4, 8, 12 g dược liệu/kg TT), 1 lô uống thuốc đối chứng silymarin liều 100 mg/kg. Tất cả các chuột (trừ lô chứng sinh lý được tiêm dầu olive) được tiêm CCl4 với liều 0.2 ml/ 20 g chuột dung dịch CCl4 7% pha trong dầu olive, tiêm cách 2 ngày một lần. 3 lô mẫu thử và lô đối chứng dương được cho uống trong 8 ngày. Song song, lô chứng sinh lý và lô chứng bệnh được cho uống nước. Đến ngày thứ 8, sau khi uống 1 giờ, lấy huyết thanh để định lượng AST, ALT và bilirubin và lấy gan để định lượng MDA [100], [110], [123].
Hoạt độ AST, ALT, bilirubin được định lượng theo KIT định lượng Human, sử dụng máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout tại Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu.
Định lượng MDA theo phương pháp Wasowich và Balahoroglu, tiến hành tại Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu.
Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: Ngày thứ 8: Sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột, lấy 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0.15 M ở nhiệt độ 0 – 5 oC (nước đá). Hút 300 l dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml
42
H2O, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0.25 % pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100 oC trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3.5 ml n-butanol, ly tâm 3000v/phút x 10 phút, hút phần dịch nổi đem đo quang ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình POL của chất thử [49], [87], [98].