Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz) Hack họ poaceae)

Bô Y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật Eriochloa ramosa Retz... Bô Y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tà

Bô Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu thành phần hóa học

và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật

(Eriochloa ramosa (Retz.) Hack họ Poaceae

Chủ nhiện đề tài TS.Lê Thị Kim Loan

Cơ quan chủ trì đề tài Viện D−ợc liệu

7440

10/7/2009

năm 2008

Bô Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan

của cây cỏ mật

(Eriochloa ramosa (Retz.) Hack họ Poaceae

Chủ nhiện đề tài TS Lê Thị Kim Loan

Cơ quan chủ trì đề tài Viện D−ợc liệu

Cấp quản lý Bộ Y tế

Thời gian thực hiện từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 7 năm 2008

Tổng kinh phí thực hiện đề tài 270 triệu đồng

Trong đó kinh phí SNKH 270 triệu đồng

năm 2008

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ

1 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ

mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae

2 Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Thị Kim Loan

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu

4 Cơ quan quản lý đề tài: BộY tế

5 Danh sách những người thực hiện chính:

- TS Lê Thị Kim Loan - Viện Dược liệu

- PGS.TS Bùi Thị Bằng - Viện Dược liệu

- DSCKI Nguyễn Thị Kim Bích - Viện Dược liệu

- CN Ngô Văn Trại - Viện Dược liệu

- TS Phan Văn Kiệm - Viện Hóa các hợp chất tự nhiên

- PGS.TS Nguyễn Trọng Thông - Đại học Y Hà Nội

- PGS.TS Vũ Thị Ngọc Thanh - Đại học Y Hà Nội

- DS Nguyễn Kim Phượng - Viện Dược liệu

- ThS Đỗ Thị Phương - Viện Dược liệu

6 Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 7 năm 2006 đến tháng 7 năm 2008

( Được gia hạn đến 2/2009)

môc lôc

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Bệnh viêm gan và một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan 2

2.1.1 Bệnh viêm gan 2

2.1.2 Một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan 4

2.2 Thuốc và phương pháp điều trị viêm gan 5

2.2.1 Thuốc điều trị viêm gan 5

2.2.2 Các phương pháp điều trị viêm gan 8

2.3 Tổng quan về cây cỏ mật ( Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.) 9

3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Nguyên liệu 11

3.2 Hóa chất và động vật thí nghiệm 11

3.3 Phương pháp nghiên cứu 12

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật 12

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học trong dược liệu 12

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 14

3.3.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan 14

3.3.3.2 Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan 16

3.3.3.3 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ với phenobarbital 16

3.3.3.4 Nghiên cứu tác dụng lợi mật 17

3.3.3.5 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp 17

3.3.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn 18

3.3.3.7 Nghiên cứu độc tính cấp 19

3.3.3.8 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 19

3.3.3.9 Phương pháp xử lý kết quả 20

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

4.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 21

4.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học 24

4.2.1 Định tính các thành phân hóa học 24

4.2.2 Định lượng các thành phần hoa học trong cao nước và cao cồn cỏ mật 26

4.2.3 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hóa học trong cỏ mật 27

4.2.3.1 Nghiên cứu phân lập một số thành phần hóa học 27

4.2.3.2 Hằng số vật lý và các dữ liệu phổ của các hợp chất 30

4.2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 34

4.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 70

4.3.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan của cỏ mật 68

4.3.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao nước cỏ mật 75

4.3.2.1 Ảnh hưởng của cỏ mật lên trong lượng gan chuột -Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl 4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR

75 76 4.3.2.2 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên hoạt độ enzym transaminase

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl 4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR

77 4.3.2.3 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên nồng độ bilirubintrong

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl 4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR

80 4.3.2.4 Ảnh hưởng của cỏ mật lên lên mô bệnh học gan chuột 81

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl 4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR

4.3.2.5 Ảnh hưởng của cỏ mật lên nồng độ MDA trong dịch đồng thể

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl 4

-Trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng PAR

90 4.3.3 Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan của cao nước cỏ mật 91

4.3.4 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cao cỏ mật khi phối hợp với phối hợp với phenobarbital 103

4.3.5 Nghiên cứu tác dụng lợi mật của cao nước cỏ mật 103

4.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của cỏ mật 104

4.3.7 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của cỏ mật 104

4.3.8 Nghiên cứu độc tính cấp 105

4.3.9 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 105

4.3.9.1 Tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của thỏ 105

4.3.9.2 Đánh giá chức năng tạo máu 106

4.3.9.3 Đánh giá chức năng gan 109

4.3.9.2 Đánh giá chức năng thận 112

5 BÀN LUẬN 117

6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139

TÀI LIỆU THAM KHẢO 142

PHỤ LỤC

- Bản tự đánh giá về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của

ĐT

- Danh sách tác giả

- Những bài báo đã công bố

147

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ

Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới

của đề tài KH&CN cấp Bộ

1 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ

mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae

2 Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Thị Kim Loan

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu

4 Thời gian thực hiện (BĐ-KT): Tháng 7/2006 đến tháng 7/2008 ( Đã được gia hạn đến tháng 2/2009)

5 Tổng kinh phí thực hiện Đề tài: 270 triệu đồng

Trong đó, kinh phí từ NSNN: 270 triệu đồng

6 Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:

6.1/ Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc : Hoàn thành các nội dung nghiên cứu

6.2/ Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN: Đạt các yêu cầu khoa học và các chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm

6.3/ Về tiến độ thực hiện : So với thời gian thực hiện xác nhận trong ĐC bị chậm vì vậy CNĐT và Cơ quan chủ trì ĐT đã có công văn gửi Vụ KH và ĐTxin gia han CNĐT và Viện DL đã nhận được QĐ của Vụ KH và ĐT, cho phép ĐT được kết thúc vào tháng 2/2009

7 Về những đóng góp mới của đề tài:

Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm trong và ngoài nước đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm mới sau đây: 8.1/ Về giải pháp khoa học - công nghệ

- Lần đầu tiên đã nghiên cứu chiết tách và xác định cấu trúc của 5 hợp chất hữu cơ

trong cây cỏ mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack ) Trong đó có 1 chất mới, lần

đầu xác nhận được từ thiên nhiên

- Lần đầu tiên nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan, làm tăng phục hồi tổn thương gan và tác dụng lợi mật của cây cỏ mật Tác dụng bảo vệ gan của cỏ mật theo

cơ chế chống oxy hóa

- Đã đánh giá độc tính của cỏ mật thông qua việc nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn, kết quả cho thấy dùng cỏ mật rất an toàn do độc tính thấp

8.2/ Về phương pháp nghiên cứu

Phương pháp NC tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với phenobarbital Đây là phương pháp mới nhằm chứng minh cơ chế bảo vệ gan của thuốc nghiên cứu

8.3/ Những đóng góp mới khác :

- Hướng dẫn cán bộ NC của Viện Dược liệu trong thời gian tập sự

- Đã hướng dẫn luận văn ThS Y học cho BS Đinh Thị Kim Chi, Luận văn đã bảo vệ thành công

-Tham gia Hội thảo khoa học Quốc tế với nội dung ;” A new dammarane - type

triterpene saponin from Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack hội thảo được tổ chức và

tháng 10/2007 tại Viện Khoa học CNVN

- Đã có hai bài báo đăng trên tạp chí Dược liệu

+ Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan của cỏ mật- Tạp chí DL số 3+4, tập 12/2007

+ A new dammarane - type triterpene saponin from Eriochloa ramosa ( Retz.) Tạp

chí DL số 2, tập 13/2008

Hà Nội.,ngày 20 tháng 12 năm2008

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Họ, tên và chữ ký)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan là bệnh lý thường gặp trong các bệnh về gan mật Có nhiều nguyên nhân gây bệnh, có thể do các loại virus ( A, B, C ), do thuốc, do rượu hoặc do hóa chất xâm nhập vào gan Bệnh có thể tiến triển từ viêm gan cấp đến viêm gan mạn rồi tiến tới xơ gan hoặc ung thư gan Theo Phạm Hoàng Phiệt, Việt Nam nằm trong vùng dịch tễ của viêm gan B với khoảng 10 triệu người mang HBsAg [23], ước tính

tỷ lệ tử vong có liên quan đến viêm gan vào khoảng 48.000 người trong một năm [29] Viêm gan do nhiễm độc thuốc hoặc do hóa chất cũng thường gặp đặc biệt là viêm gan do dùng thuốc chống lao hoặc thuốc hạ sốt giảm đau paracetamol có xu hướng ngày càng tăng

Viêm gan do virus có thể điều trị bằng thuốc kháng virus như Inteferol, Lamivudin Tuy nhiên những thuốc này có giá thành quá cao và có nhiều tác dụng không mong muốn Hơn nữa hiện nay đã xuất hiện dòng virus đột biến kháng Lamivudin Các trường hợp viêm gan do nguyên nhân khác (do thuốc, hóa chất ) hiện chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, những bệnh nhân này chủ yếu được điều trị bằng các thuốc làm tăng khả năng phục hồi tổn thương gan và bảo vệ gan Một số thuốc bảo vệ gan được nhập vào Việt Nam như Silymarin (Legalon), Biphenyldimethyl dicarboxylat (Fortex) có tác dụng tương đối tốt song giá thành tương đối cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế của đa số người bệnh khi phải dùng thuốc dài ngày Vì thế việc nghiên cứu các thuốc bảo vệ gan từ nguồn nguyên liệu trong nước là điều hết sức cần thiết

Y học cổ truyền nước ta có lịch sử hàng ngàn năm Với sự phong phú và đa dạng sinh học vào bậc nhất khu vực Đông nam á, tạo điều kiện cho nước ta có nguồn cây thuốc dồi dào Dược liệu dùng chữa bệnh gan mật có rất nhiều và cũng được các thầy thuốc Y học cổ truyền sử dụng rộng rãi như chi tử ( hạt dành dành ), actiso, nghệ vàng, nhân trần, bồ bồ Để có thể tìm kiếm, bổ sung và danh mục này những cây thuốc có tác dụng tốt lại có sẵn trong tự nhiên là công việc hết sức cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn Cây cỏ mật là cây mọc hoang ở vùng đồng bằng và trung du nước ta Theo kinh nghiệm của nhân dân ở một số địa phương như Nam Định, Phú thọ, Sơn tây dùng cỏ mật để chữa cảm sốt, chữa mụn nhọt và chữa các bệnh về gan mật Một

số tác giả trong nước cũng đã nghiên cứu về tác dụng hạ sốt, giảm đau, lợi mật, lợi tiểu của cỏ mật trên thực nghiệm [11], [26] nhưng chưa thấy có nghiên cứu nào về tác dụng bảo vệ gan và phục hồi tổn thương gan của cây này Để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng cây thuốc này với mục đích làm thuốc bảo vệ và phục hồi tổn thương gan, chúng tôi tiến hành thực hiện Đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và

tác dụng bảo vệ gan của cây cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., họ Poaceae với các mục tiêu sau:

- Xác định thành phần hóa học chính của cây cỏ mật

- Xây dựng quy trình chiết xuất và phân lập các nhóm hoạt chất chính trong cây cỏ mật

- Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của hoạt chất toàn phần

- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình súc vật thí nghiệm của hoạt chất toàn phần

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh viêm gan và một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan

* Viêm gan cấp: Có ba nguyên nhân gây viêm gan cấp hay gặp nhất đó là do virus, do thuốc hoặc do nhiễm độc

- Viêm gan cấp do virus

Viêm gan do virus là bệnh phổ biến với tác nhân gây bệnh là các loại virus A, B,

C, D, E và G Viêm gan virus A và E thường gây thành dịch nhưng lành tính Viêm gan virus B, C, D tiến triển âm ỉ, dễ gây tình trạng mạn tính dẫn tới xơ gan, ung thư gan với tỷ lệ tương đối cao [23], [33] Cơ chế sinh bệnh viêm gan do virus liên quan đến quá trình đáp ứng miễn dịch, trong đó chủ yếu là đáp ứng qua trung gian tế bào

và sự tăng sinh gốc tự do tạo ra các phản ứng oxy hóa dẫn đến tổn thương gan và hủy hoại tế bào gan [35], [47] Mỗi năm trên thế giới có khoảng 2 triệu người chết

do suy gan cấp, xơ gan và ung thư gan do virus viêm gan B gây ra Bệnh hay gặp ở các nước đang phát triển như Ấn Độ, Việt Nam

- Viêm gan cấp do thuốc

Một số thuốc có độc tính cao đối với gan như Tetracyclin hoặc chất chuyển hóa

ổn định của chúng gây độc với gan như 5.Fluorouracin hoặc chất chuyển hóa trung gian tấn công trực tiếp vào tế bào gan gây viêm gan, hủy hoại tế bào gan như Paracetamol, Erythromycin, Isoniasid Trong số các lọai thuốc trên thì Paracetamol ( PAR) là thuốc hạ sốt, giảm đau dùng phổ biến trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam Với liều điều trị thông thường, PAR không gây độc cho gan, nhưng nếu dùng liều cao sẽ sinh ra nhiều N-acetyl-p-benzoquinoneimin (NAPQI ), đó là chất gây tổn

thương tế bào gan [7],[45] Theo thống kê tại Trung tâm chống độc thuộc Bệnh viện Bạch mai, ngộ độc thuốc hạ sốt giảm đau trong 2 năm 1998-2000 chiếm 6,34% số các trường hợp ngộ độc Đến năm 2002-2003, tỷ lệ này tăng lên 12,2% và đứng thứ

ba trong các loại ngộ độc thuốc Viêm gan cấp do một số thuốc khác, đặc biệt là do dùng thuốc chống lao Isoniasid phối hợp với Rifampicin cũng thường gặp, trong số

đó có một số trường hợp đã gây tử vong

- Viêm gan cấp do nhiễm độc

Các trường hợp thường gặp là nhiễm độc thuốc trừ sâu, phẩm nhuộm, nấm độc, nhiễm độc thực phẩm hoặc các hóa chất dùng trong công nghiệp như Carbon tetraclorid (CCl4) CCl4 là một chất gây hủy hoại tế bào gan điển hình Trong quá trình chuyến hóa, CCl4 tạo thành các gốc tự do, chính các gốc tự do này sẽ liên kết với lipid và các protein trên hệ thống lưới nội mô của tế bào gan gây phá hủy cấu trúc và chức năng của hệ thống lưới, làm tổn thương gan [41], [47] Mức độ tổn thương phụ thuộc vào liều lượng CCl4, dạng tổn thương thường tập trung chủ yếu ở vùng trung tâm tiểu thùy Chính vì vậy CCl4 hay được dùng trong mô hình gây viêm gan cấp để nghiên cứu thuốc có tác dụng bảo vệ gan

- Viêm gan mạn do thuốc hoặc hóa chất: Nguyên nhân thường gặp là do dùng một hay nhiều loại thuốc/ chất độc đối với gan trong thời gian dài như dùng thuốc điều trị lao, thuốc sốt rét, thức ăn chứa formon hoặc do nhiễm độc nghề nghiệp, do tiếp xúc với hóa chất độc hại thường xuyên Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật không đúng phương pháp cũng gây nhiều tác hại đến sức khỏe nói chung và đặc biệt là gây tác hại với tế bào gan Theo thống kê của trung tâm ADR quốc gia năm 2006, ADR

do thuốc chống lao đứng thứ hai sau ADR do kháng sinh, trong đó gặp nhiều trường hợp viêm gan do dùng phối hợp Isoniazid phối hợp Rifampicin [4]

- Viêm gan mạn do rượu: Viêm gan do rượu được biết đến từ lâu, rượu chuyển hóa

ở gan tạo các gốc tự do, các gốc tự do này tấn công vào các thành phần tế bào, kết hợp với các protein làm tăng quá trình peroxy hóa lipid dẫn đến tình trạng màng lipid bị phá hủy, ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của màng tế bào Bên cạnh đó rượu còn làm giảm glutathion ( GSH) nội bào thông qua hàng loạt các cơ chế khác nhau

Như vậy tổn thương gan do rượu là do tăng quá trình peroxy hóa lipid và làm giảm các chất chống oxy hóa [10], [35]

- Viêm gan mạn tính tự miễn: Là tình trạng mất khả năng thích ứng miễn dịch của gan với chính các tổn thương gan Nguyên nhân và cơ chế chưa rõ song viêm gan mạn tính tự miễn luôn có mặt các tự kháng thể và tăng gama globulin máu [10]

- Viêm gan tiềm tàng: Là những trường hợp có biểu hiện tình trạng viêm gan mạn tính nhưng không tìm được nguyên nhân Hiện nay với các phương pháp nghiên cứu hiện đại như y sinh học phân tử, miễn dịch học, thì viêm gan tiềm tàng đã giảm do

đã xác định được nguyên nhân và điều trị kịp thời [10]

2.1.2 Một số xét nghiệm thường dùng để đáng giá tổn thương gan

Gan là cơ quan quan trọng trong cơ thể, được thể hiện thông qua các chức năng

do gan đảm nhận Các xét nghiệm của hệ thống gan, mật rất đa dạng và phong phú,

có vai trò lớn trong quá trình chẩn đoán và tiên lượng bệnh Khi tế bào gan bị tổn thương, một số enzym có nhiều trong gan sẽ được giải phóng vào máu Do vậy để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan sẽ dựa vào việc tiến hành các xét nghiệm xác định hoạt độ các enzym có nguồn gốc ở gan trong máu và thăm dò hình thái mô bệnh học của gan.[16],[22]

* Trên lâm sàng: Để thăm dò sự huỷ hoại tế bào gan thường xác định hoạt độ của các enzym transaminase trong huyết thanh vì khi tế bào gan bị tổn thương các enzym này thường thay đổi sớm nhất và có tính chất đặc trưng Trong số đó có hai loại enzym được chú ý nhất , đó là :

1 AST ( Aspartat aminotransferase): Enzym này có ở hai nơi trong tế bào Phần lớn nó tồn tại trong ty thể và một phần nhỏ trong bào tương Enzym này có ở nhiều

mô khác nhưng nhiều nhất ở cơ tim, gan và cơ xương [19],[22]

2.ALT (Alanin aminotransferase): Là enzym chỉ có trong bào tương, đặc trưng cho các bệnh lý ở gan vì có mặt nhiều nhất ở gan, rất ít ở cơ tim và cơ vân [19], [22] Trong viêm gan do virut hoặc do nhiễm độc, hoạt độ AST và ALT trong huyết thanh phản ánh mức độ huỷ hoại tế bào gan đều tăng cao và tăng sớm nhưng ALT tăng nhiều hơn [19], [30] Các enzym này xuất hiện trong máu trước khi có triệu chứng lâm sàng và hết muộn sau khi các triệu chứng lâm sàng đã hết Đặc biệt các enzym này tăng rất cao trong nhiễm độc carbon tetraclorid, nhiễm độc rượu cấp có

mê sảng hoặc nhiễm độc các hoá chất như phospho (có thể tăng gấp 100 lần so với bình thường) [22]

Ngoài hai enzym AST và ALT thì một số chỉ số sinh hoá khác trong huyết thanh như bilirubin, protein toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, phosphatase kiềm cũng biến đổi khi gan bị tổn thương [8 ], [19], [30]

* Trên thực nghiệm : Để đánh giá tổn thương gan trên thực nghiệm, ngoài các xét nghiệm hoá sinh máu còn thông qua việc đánh giá mô bệnh học quan sát đại thể

và cấu trúc vi thể gan Ngoài ra, để góp phần tìm hiểu cơ chế tác dụng của thuốc có liên quan đến tác dụng chống oxy hoá hay không? thường định lượng malondialdehyd (MDA) Mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 và PAR trong cơ chế đều có điểm chung là các chất này bị chuyển hoá ở gan và tạo thành các gốc tự

do Chính các gốc tự do này sẽ phản ứng với lớp lipid kép của màng tế bào gây ra sự peroxy hoá lipid màng tế bào, từ đó gây tổn thương và huỷ hoại tế bào gan MDA là sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào do đó xác định nồng

độ MDA trong gan có thể đánh giá được quá trình peroxy hoá lipid

2.2 Thuốc và phương pháp điều trị viêm gan

2.2.1 Thuốc điều trị viêm gan

- Các thuốc tương tự nucleosid : Các chất tương tự nucleosid điều trị viêm gan mạn thường được sử dụng là Lamivudine (LAM) LAM cũng như các chất tương tự nucleosid khác gây ức chế quá trình tổng hợp ADN của virut Sử dụng LAM cho bệnh nhân với liều 100mg hàng ngày sau 12 tháng thấy tỷ lệ chuyển đảo huyết thanh 16-18% (so với nhóm dùng giả dược tỷ lệ này là 4-6%) Tỷ lệ này tăng lên khi dùng LAM kéo dài 2,3,4 năm Do thuốc ít độc tính nên có thể dùng kéo dài Như vậy dùng thuốc dài ngày gây tốn kém cho bệnh nhân nhưng quan trọng hơn là hiện nay

đã xuất hiện dòng đột biến kháng Lamivudin [43]

* Nhóm thuốc bảo vệ tế bào gan

- Cơ chế tác dụng của thuốc bảo vệ gan

Các thuốc bảo vệ gan (Hepatoprotective drug) có tác dụng duy trì sự ổn định của

tế bào gan, làm cho tế bào gan vững bền trước sự tấn công của các tác nhân gây bệnh Đề bảo vệ tế bào gan, các loại thuốc này có thể tác dụng theo các cơ chế sau:

+ Ngăn cản sự chuyển hóa các thuốc hoặc hóa chất khi vào cơ thể thành các chất độc với gan

+ Dọn sạch gốc tự do khi được hình thành

+ Làm bền vững màng tế bào, giúp tăng sức chống đỡ với các tác nhân gây bệnh

- Hiện nay có nhiều thuốc bảo vệ gan đã được nghiên cứu và sử dụng trong điều trị đặc biệt có nhiều thuốc có nguồn gốc thảo dược như Legalon (silymarin), Abivina (bồ bồ), Dihacharin (Diệp hạ châu đắng), Hana (Cà gai leo)[3]

- Một số dược liệu được dùng chữa bệnh gan, mật

Bồ bồ (Herba Adenosmatis indiani)

-Thành phần hóa học: Bồ bồ chứa 0,8% tinh dầu, saponin, flavonoid, acid nhân thơm và coumarin Đã nhận dạng được 7 chất trong tinh dầu bồ bồ là L-Fenchon chiếm 33,5%, L- Limonen 28,6%, Humulen 11,6%, Xineol 5,9%, Fenchol, Piperitenon oxyd, Geranyl acetat [ 3]

-Tác dụng sinh học [3]:

+ Tác dụng làm tăng tiết mật : Dịch chiết bằng ethanol 40% có tác dụng làm tăng tiết mật 45% trên chuột lang so với lô đối chứng trong khi đó tinh dầu bồ bồ và dịch chiết nước có tác dụng yếu hơn với lần lượt là tăng tiết mật 29% và 20% so với lô đối chứng

+Tác dụng thải độc của gan, nghiệm pháp BSP: Tốc độ thải trừ BSP trên chuột lang của lô uống dịch chiết ethanol 40% là 50,99%, của lô uống tinh dầu bồ bồ là 48,5% so với lô chứng Trong khi đó chỉ số BSP của lô uống dịch chiết nước không thay đổi so với lô chứng

+ Tác dụng chống viêm cấp: Cả ba loại chế phẩm dịch chiết ethanol 40%, dịch chiết nước và tinh dầu bồ bồ đều có tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng kaolin, trong đó dịch chiết nước có tác dụng mạnh nhất sau đó đến dịch chiết ethanol và tinh dầu có tác dụng yếu hơn cả

+ Tác dụng chống viêm mạn: Cả ba loại chế phẩm dịch chiết ethanol 40%, dịch chiết nước và tinh dầu bồ bồ đều có tác dụng chống viêm mạn trên mô hình u hạt thực nghiệm, trong đó dịch chiết nước và dịch chiết ethanol có tác dụng tương đương còn tinh dầu có tác dụng yếu so với hai chế phẩm trên

Bồ bồ được dùng chữa cảm sốt, viêm gan, vàng da, viêm ruột, làm thuốc kích thích ăn ngon cho phụ nữ sau khi sinh [3 ],[6]

Một chế phẩm được bào chế từ bồ bồ có bổ sung tinh dầu (đặt tên là Abivina) cuả Viện Dược liệu đã thử lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan virus bệnh viện Nhi trung ương, viện quân y 103 có tác dụng tốt vì vậy thuốc đã được Cục Dược, Bộ Y

tế cấp giấy phép sản xuất

Diệp hạ châu đắng (Herba phyllanthi amari)

-Thành phần hóa học: Lá diệp hạ châu đắng chứa các chất đắng hypophylanthin, phylanthin Ngoài ra còn có flavonoid (1,15%), alcaloid kiểu securinin như niuroidin, isobubialin, epibubianin, quercetin, quercitrin, các acd hữu cơ, tanin(7,78%) [3 ]

-Tác dụng sinh học [3 ]

+ Tác dụng bảo vệ gan

Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng được gây nhiễm độc gan bằng carbon tetraclorid, làm giảm hàm lượng colagen trong máu, làm giảm mức độ xơ hóa, làm giảm men gan ở gan động vật so với lô đối chứng

Các thành phần hóa học trong diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan là lignan phyllanthin và hypophyllanthin Tuy nhiên các thành phần này có tác dụng độc với hệ thần kinh

+ Cơ chế tác dụng bảo vệ gan là do cao diệp hạ châu đắng có hoạt tính chống oxy hóa, làm giảm lượng MDA 28,7% trên động vật thí nghiệm so với lô đối chứng + Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng lợi tiểu

+ Cao diệp hạ châu đắng có tác dụng lợi mật

Actiso (Folium Cynarae scolymi)

-Thành phần hóa học: Lá Actiso chứa acid hữu cơ gồm cynarin, acid malic, acid succinic, các hợp chất flavonoid và nhiều chất vô cơ

- Tác dụng sinh học

+ Tác dụng lợi mật: Dung dịch actiso tiêm tĩnh mạch gây tăng mạnh lượng mật bài tiết

+Tác dụng lợi tiểu: Uống hoặc tiêm dung dịch actiso làm tăng lượng nước tiểu, làm giảm lượng cholesterol và urê huyết

- Ứng dụng trong điều trị

Actiso được dùng làm thuốc thông tiểu, thông mật chữa các bệnh suy gan, thận, viêm thận cấp và mạn

Nghệ vàng (Rhizoma Curcumae longae)

-Thành phần hoá học: Trong thân rễ nghệ vàng có rất nhiều thành phần hoá học như tinh dầu, chất béo, chất vô cơ và nhóm chất màu Trong đó nhóm chất màu được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh học Nhóm chất màu curcuminoid gồm 3 chất là curcumin, demethoxycurcumin và bis demethoxycurcumin

-Tác dụng sinh học: Curcuminoid có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan cấp thông qua hai cơ chế [3],[20]

+ Ức chế isoenzym của CYP ( CYP2E1), ngăn chặn quá trình chuyển hoá PAR thành chất độc N-acetyl- benzoquinoneimin (NAPQI) và CCl4 thành CCl3

+ Chống oxy hoá, ức chế quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan

- Ứng dụng trong điều trị: Nghệ vàng được dùng trong Y học cổ truyền để chữa các bệnh về gan, mật [3] Curcuminod được dùng như một loại thực phẩm chức năng để phòng chống ung thư như ung thư đường tiêu hoá, gan hoặc một số trường hợp ung thư khác

Ngoài ra còn rất nhiều các dược liệu khác đã được nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan như cà gai leo, nhàu, nhó đông, chàm tía, nhân trần, chè đắng [6]

2.2.2 Các phương pháp điều trị viêm gan

- Viêm gan mạn tính: Cho đến nay bệnh viêm gan mạn không có biện pháp điều trị đặc hiệu

+ Với viêm gan mạn tính giai đoạn ổn định thì chế độ ăn và sinh hoạt hợp lý là quan trọng, đó là chế độ ăn giàu năng lượng và vitamin, giảm mỡ, bỏ rượu, bia và hạn chế lao động nặng [10], [33]

+ Với viêm gan mạn tính giai đoạn tiển triển thì ngoài chế độ ăn và sinh hoạt hợp

lý phải kết hợp dùng thuốc điều trị

- Đối với viêm gan do virus: Điều trị nguyên nhân bằng các thuốc kháng virus như Lamivudin, Entercavir, Inteferol Bên cạnh việc dùng các thuốc này kết hợp việc điều trị dự phòng biến chứng, giải quyết tình trạng viêm gan, điều trị dự phòng

xơ gan và ung thư gan bằng các thuốc bảo vệ tế bào gan hoặc các thuốc giúp phục hồi các tổn thương tế bào gan

- Đối với viêm gan do thuốc/ hóa chất độc ngoài việc loại bỏ các tác nhân gây độc này phải dùng thêm các thuốc giúp phục hồi và bảo vệ tế bào gan

- Đối với viêm gan tự miễn điều trị bằng cách dùng liệu pháp Corticoid [25]

- Đối với viêm gan tiềm tàng : Điều trị triệu chứng là chủ yếu nếu chưa tìm được căn nguyên [10]

2.3 Tổng quan về cây cỏ mật (Eriochloa procera (Retz.) C.Hubb (Syn E

ramosa (Retz.) Hack.)

2.3.1 Một số loài trong chi Eriochloa H.B.K (Cỏ mật)

Theo tài liệu “Danh mục các loài thực vật ở Việt Nam”, tập III của 2 cơ sở Đại học Quốc Gia và Viện Sinh thái tài nguyên phối hợp soạn thảo, xuất bản năm 2005

cho biết chi cỏ mật (Eriochloa H.B.K) ở Việt Nam có 03 loài [ 27 ]

* Eriochloa polystachya H.B.K 1815 (CCVN, 3:813), Cỏ mật to, Cỏ mật nhiều

gié

- Phân bố: An Giang (Long xuyên, Mỹ luông ), nguyên sản Mêhicô

- Dạng sống và sinh thái: Cỏ thuỷ sinh, dài 1,4-2m Mọc ở ruộng nước, kênh rạch

- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc

* Eriochloa villosa (Thunb.) Kuath 1829- Paspalum villosum Thunb

1784-Panicum tuberculiflorum Steud 1854- Cỏ mật lông, Cỏ mật nhiều lông

- Phân bố: Cao Bằng, còn có ở Ấn Độ, Trung quốc, Nhật Bản

- Dạng sống và sinh thái : Cỏ 1 năm, cao 30-100cm Mọc ở ven bờ kênh, rạch, ruộng nước

- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc

*Eriochloa procera ( Retz.) C Hubb.1930 ( CCVN,3 : 813) - Agorostis procera Retz 1786 - Milium ramosum Retz 1791- Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.1906 , Cỏ

- Công dụng: Làm thức ăn cho gia súc

2.3.2 Tổng quan về cỏ mật thân cao ( Eriochloa procera (Retz.) C.Hubb (Syn

E ramosa (Retz.) Hack.)

Ảnh 2.1 Ảnh của loài Eriochloa

procera (Retz.) C.Hubb (Syn E

ramosa (Retz.) Hack )

* Đặc điểm thực vật [3]

Cây thảo, sống lâu năm Rễ hình sợi, mọc dầy đặc Thân khí sinh mọc thành bụi dầy, nhẵn, có lông ở các đốt, cao 0,3-1,5m Lá mọc so le, hình dải,đầu lá nhọn, mép hơi nháp, bẹ lá xoè rộng, lưỡi bẹ ngắn, có lông

Cụm hoa mọc thành bông đơn hoặc phân nhánh, dài 5-13cm, cuống chung mảnh, nhẵn, bông nhỏ xếp lớp rất thưa mọc so le, hơi thẳng đứng, hình bầu dục nhọn, có lông cứng ở đỉnh, không có mày ngoài, mày trong mềm nhọn, mép hơi gập lại, có lông mềm, cuống bông nhỏ, có lông, hoa ở dưới không sinh sản, hoa ở trên lưỡng tính dẹt, màu xám, bóng, 3 nhị, chỉ nhị hình sợi, bầu thuôn dẹt, nhẵn, có 2 vòi nhuỵ, núm nhuỵ phát triển, màu hung đen nhạt

Quả nằm trong mày hoa, góc rất nhọn, tù ở đầu, nhẵn, dẹt, có vòi tồn tại

* Phân bố, sinh thái: Mọc hoang ở vùng đồng bằng và trung du

Cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm lẫn với các loại cỏ khác ở bãi sông, ruộng trồng hoa màu, ven đường hay nương rẫy Cây con mọc từ hạt vào khoảng cuối tháng 3 đến tháng 5, sau mùa hoa quả, cây tàn lụi

Cỏ mật là nguồn thức ăn cho trâu, bò và có hại cho cây trồng

* Thành phần hóa học

Theo tác giả Lê Văn Công, trong cỏ mật có tinh dầu, hàm lượng này ở cây tươi

là 0,0012-0,02% còn cây khô là 0,12-0,2% ngoài ra trong cỏ mật còn có flavonoid, peptit, acid amin [11]

* Tác dụng sinh học

- Theo các tác giả Lê Văn Công, Đỗ Trung Đàm, cao cỏ mật (chiết bằng ethanol

80%) có tác dụng hạ sốt trên mô hình gây sốt bằng men bia ở chuột cống trắng với liều 0,5g/kg và 1g/kg thân trọng, tác dụng này tuy kém analgin (liều 200mg/kg) nhưng đến giờ thứ năm vẫn còn giữ được [3], [11]

- Vẫn theo các tác giả trên, cao cỏ mật còn có tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau bằng acid acetic trên chuột [12]

- Kết quả nghiên cứu của sinh viên Nguyễn Thị Thanh Xuân trong khoá luận tốt

nghiệp đại học cho biết cao cỏ mật ( chiết bằng ethanol 90% ) có tác dụng lợi mật, lợi tiểu, giảm đau (theo phương pháp gây đau bằng mâm nóng) và hạ sốt trên chuột nhắt trắng [26]

* Công dụng

Cỏ mật được dùng theo kinh nghiệm của nhân dân một số vùng như Sơn Tây, Nam Định để chữa cảm sốt, cúm, sốt xuất huyết.[3],[11]

Cho đến nay (2008) chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào của các tác giả

nước ngoài về thành phần hoá học và tác dụng dụng sinh học của cây cỏ mật thân cao

3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu

- Nguyên liệu để nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, tác dụng sinh học là cây cỏ mật thu hái tại Đông Anh- Hà Nội vµo thêi ®iÓm c©y b¾t ®Çu ra hoa

- Nguyên liệu để nghiên cứu tác dụng sinh học là các lớp chất chiết xuất và phân lập từ toµn c©y cỏ mật ( bá rÔ ), liều thí nghiệm được tính tương đương với dược liệu

3.2 Hóa chất và động vật thí nghiệm

3.2.1 Thuốc và hóa chất phục vụ nghiên cứu tác dụng sinh học

- Carbon tetraclorid của hãng Placebo (CE), paracetamol (Trung Quốc), carboxymethylcellulose (CMC) (Thuỵ Điển) Dầu olive (Thailand) Silymarin (biệt dược Legalon) dạng viên nén, hàm lượng 70mg của hãng Madaus (Korea)

- Kít định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: AST, ALT, bilirubin toàn phần, cholesterol, albumin, creatinin của hãng DIALAB GmbH (Áo)

- Dung dịch xét nghiệm mẫu ABX Minidil LMG của hãng ABX – Diagnostics

- Các hóa chất nghiên cứu dùng để xác định hàm lượng MDA trong gan: Acid ascorbic, muối Mohr, acid thiobarbituric, kaliclorid, acid tricloacetic do phòng Đông y thực nghiệm - Bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương cung cấp

- Các hóa chất làm tiêu bản mô bệnh học do Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại

học Y - Hà Nội cung cấp

3.2.2 Dụng cụ, máy móc phục vụ nghiên cứu tác dụng sinh học

-Máy xét nghiệm huyết học Vet abc TM Animal Blood Counter

- Máy xét nghiệm sinh hóa máu Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy)

- Máy nghiền đồng thể Stomater 80 (Anh)

- Máy quang phổ Elisa Lx 800 (Mỹ)

- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường của bộ môn Dược lý, Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội và Phòng Đông y thực nghiệm - Bệnh viện Y học

cổ truyền Trung ương và Khoa Dược lý-Viện Dược liệu

3.2.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25,0 ± 2,0 gam

do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

- Thỏ trắng (chủng Newzealand), cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 2,0 ± 0,2kg

(để nghiên cứu độc tính bán trường diễn) do Trung tâm chăn nuôi - Viện kiểm nghiệm cung cấp

- Chuột cống trắng, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 150 ± 20g

Động vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm từ 3 - 5 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội và Khoa Dược lý- Viện Dược liệu

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật

Thu thập các mẫu cây tại nhiều địa phương, mô tả hình thái, đối chiếu với các tài liệu để xác định tên khoa học

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học trong dược liệu

* Nghiên cứu định tính các thành phần hóa học

- Định tính các thành phần hóa học bằng các phản ứng hóa học [ 2 ]

- Định tính các thành phần hóa học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [ 2 ], [6 ] Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel, DC-Alufolien

60 F254( Merck 1,05715), RP18F254s(Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở các bước sóng 254nm, 366nm hoặc dùng thuốc thử tương ứng phun đều lên bản mỏng, sấy khô đến khi hiện màu

* Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học

- Định lượng các chất tan trong ethyl acetat có trong cao nước và cao cồn : Dược liệu (cân và xác định độ ẩm) được chiết nước hoặc chiết bằng ethanol, sau đó cô đến cao lỏng Lắc cao lỏng với ethyl acetat nhiều lần, gạn lớp ethyl acetat, làm bay hơi dung môi và làm khô cắn Cân cắn để tính hàm lượng các chất tan trong ethyl acetat trong cao nước và cao cồn cỏ mật

-Định lượng nitơ amin có trong cao nước và cao cồn theo phương pháp ghi trong DĐVN I, tập 1.[5]

Dược liệu (cân và xác định độ ẩm) được chiết nước hoặc chiết bằng ethanol, sau đó

cô đến cao khô Cân cao khô Lấy 1g cao thêm 40ml nước, đun cánh thủy cho tan hết, để nguội Thêm vào 1g bari clorid (TT) và 1,5ml dung dịch bari hydroxyd bão hòa trong methanol, khuấy cho tan hết ChuyÓn dung dịch này vào bình định mức 200ml, thêm nước đến vạch Để yên khoảng 1giờ Lọc, bỏ 30ml dịch lọc đầu Lấy 100ml dịch lọc cho vào bình nón, thêm dung dịch acid hydrocloric 0,1N để điều chỉnh pH tới 6,8 bằng pH mét Thêm 10ml focmol trung tính Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1N đến pH = 9,2 ( đo bằng pH mét )

Hàm lượng nitơ amin trong chế phẩm ( cao nước, cao cồn ) được tính toán dựa trên kết quả chuẩn độ với 1ml dung dịch natri hydroxyd 0,1N tương ứng với 0,0014g nitơ

* Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số chất

- Nghiên cứu chiết xuất: Chiết xuất các chất trong dược liệu bằng phương pháp ngâm hoặc chiết nóng với các loại dung môi khác nhau

- Phương pháp phân lập các chất

+ Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60

GF254( Merck 10575), Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở các bước sóng 254nm, 366nm hoặc cắt rìa bản mỏng đề phun thuốc thử, hơ nóng để phát hiện vết Ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, cạo lớp silicagel có chất , giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

+ Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063mm ( 240-430 mesh) Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50µm, Fujisilisa chemical Ltd.)

- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

+ Điểm nóng cháy đo trên máy Kofler microhotstage của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

+ Độ quay cực [α]D đo trên máy JASCO DIP-1000KUY polarimeter của Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

+ Phổ khối ( ESI-MS) : Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Eletron spray ionization mass spectra )đo trên máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (MNR) : 1H-NMR (500MHz), 13C-NMRR ( 125MHz) đo trên máy Brruke AM500FT-NMR Spectrometer của Viện hóa học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học

3.3.3.1.Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan

* Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetraclorid (CCl 4 ) trên chuột nhắt trắng:

Chuột nhắt trắng được chia thành nhiêu lô, mỗi lô 10 con:

+ Lô 1 (chứng sinh học- Csh): Uống nước cất + tiêm dầu olive

+ Lô 2 (chứng bệnh lý- Cbl ) : Uống nước cất + tiêm CCl4

+ Lô 3 (chứng dương) : Uống silymarin 67mg/kg + tiêm CCl4

+ Lô 4, lô 5 (thử thuốc) Uống cao cỏ mật với liều tương ứng + tiêm CCl4.

+ Trước khi gây độc 14 - 16 giờ, cho chuột nhịn đói, 24 giờ sau khi gây độc, lấy máu động mạch cảnh để định lượng enzym AST, ALT và bilirubin, đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA và quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể)

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ thời gian làm thực nghiệm NC tác dụng bảo vệ gan trên

mô hình gây tổn thương gan bằng CCl 4

ngày lấy máu và gan tiêm CCl4

Uống thuốc hoặc uống nước cất

1 2 3 4 5 6 7 8 9

- Định lượng hoạt độ AST, ALT theo phương pháp Reitman-Franker [30]

- Xác định nồng độ MDA

Nồng độ MDA được xác định theo phương pháp Mitsuru Uchiyama và Midori Mihama MDA là sản phẩm chuyển hóa trung gian của quá trình peroxy hóa lipid, MDA phản ứng với acid thiobacbituric tạo phức trimethine màu hồng, có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530-532nm

Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm luợng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA trong cùng điều kiện

Cách tiến hành: Giết chuột nhắt trắng, mổ lấy gan, bảo quản gan trong đá lạnh Cân

400mg gan, nghiền trong 9,6ml dung dịch KCl lạnh (1 lít dung dịch chứa 1,2g KCl) trên máy nghiền đồng thể

Dung dịch phản ứng gồm 2ml dung dịch đồng thể gan chuột + 0,4ml dung dịch acid ascorbic 0,04352% + 0,4ml dung dịch muối Mohr 0,001645%

Đặt các ống chứa dung dịch phản ứng trong bình điều nhiệt ở 370C trong 30 phút sau đó thêm 0,5ml dung dịch acid tricloacetic 40%, ly tâm dung dịch phản ứng với tốc độ 3000vòng/ phút trong 10 phút ở 40C Lấy 0,1ml dịch nổi cho phản ứng với 0,5ml acid thiobarbituric, đun sôi trong 20 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng Đo

độ hấp thụ màu của dung dịch phản ứng ở bước sóng 532nm

- Quan sát mô bệnh học: Sau khi giết chuột, gan được lấy ra quan sát đại thể Sau

đó lấy một mẩu gan nhỏ ở mỗi phân thuỳ gan, cố định trong dung dịch formalin trung tính tối thiểu trong 1 tuần Bệnh phẩm được làm khô trong các mẫu ethanol 75-100% trước khi cố định trên nến Cắt từng lát mỏng 5µm, nhuộm với hematoxylin và eosin (HE), đem soi trên kính hiển vi quang học quan sát cấu trúc vi thể gan

*Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol (PAR): Chuột nhắt trắng

được chia ngẫu nhiên thành nhiều lô, mỗi lô 10 con :

+ Lô 1 (Csh) : Uống nước cất + uống CMC 1%

+ Lô 2 (Cbl): : Uống nước cất + uống PAR

+ Lô 3 (chứng dương) : Uống silymarin 67 mg/kg +uống PAR

+ Lô 4 , lô 5 (thuốc nghiên cứu): Uống cao cỏ mật liều tương ứng + uống PAR

Chuột được uống nước cất hoặc thuốc liên tục trong 7 ngày như trong mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 Ngày thứ 8 sau uống thuốc 1 giờ, và nhịn đói 16-18 giờ trước đó, gây độc cho chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 bằng uống PAR liều 400mg/kg pha trong carboxymethylcellulose (CMC) 1% với thể tích 0,2ml/10g 48 giờ sau khi uống paracetamol, lấy máu động mạch cảnh để định lượng enzym AST, ALT và bilirubin, đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA và quan sát mô bệnh học

3.3.3.2.Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan

Chuột nhắt trắng, được chia thành 7 lô, mỗi lô 10 con Gây tổn thương gan chuột

bằng cách tiêm màng bụng CCl4 3 ngày liên tục, với liều 0,2ml/kg/ngày (pha 0,2ml

CCl4 trong 3,8ml dầu olive, tiêm 0,04ml/10g) Ngày thứ ba, sau khi tiêm CCl4 1 giờ

bắt đầu cho uống nước cất, sylimarin (67mg/kg) hoặc cao cỏ mật (9,0g/kg) tương

ứng với từng lô theo sơ đồ 3.2 Chuột được lấy máu động mạch cảnh để định lượng

các enzym AST, ALT và bilirubin, lấy gan để xác định trọng lượng, nồng độ MDA

và làm tiêu bản mô bệnh học ở các thời điểm sau uống thuốc 2 ngày và 4 ngày

Sơ đồ 3.2 Thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu tác dụng tăng phục hồi tổn

thương gan Ngày 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7

Lô 1 tiêm dầu olive nước cất nước cất giết 5 chuột

Lô 2 tiêm CCl4 nước cất giết 5 chuột

Lô 3 tiêm CCl4 silymarin giết chuột

Lô 4 tiêm CCl4 cỏ mật

Lô 5 tiêm CCl4 nước cất

Lô 6 tiêm CCl4 silymarin giết chuột

Lô 7 tiêm CCl4 cỏ mật

3.3.3.3 Tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với phenobarbital

Phương pháp nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ của cỏ mật với

+ Thời gian tiềm tàng là thời gian được tính từ lúc tiêm phenobarbital đến khi chuột ngủ ( đặt chuột ở tư thế nằm ngửa mà chuột không lật dậy được thì được coi là ngủ)

+ Thời gian ngủ được tính từ lúc bắt đầu ngủ đến khi thức dậy (lúc bò được bằng 4 chân)

3.3.3.4.Nghiên cứu tác dụng lợi mật: Tiến hành theo phương pháp Rudii

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

Lô 1 (Csh): Uống nước cất với thể tích 0,2 ml/10g

Lô 2 (chứng dương): Uống actiso 1 ống/kg (1 ống 5 ml chứa 9,3 mg cao mềm actiso)

Lô 3 : Uống cao cỏ mật liều 4,5 g/kg

Lô 4 : Uống cao cỏ mật liều 9,0 g/kg

Actiso hoặc cao nước cỏ mật được pha trong nước cất, cho chuột uống với lượng 0,2 ml/10g

Chuột được uống nước hoặc thuốc trong 4 ngày liền Ngày thứ tư, sau khi uống thuốc 30 phút, gây mê chuột bằng ether Mổ bụng chuột, thắt ống mật chủ, sau

Trọng lượng dịch mật được quy về 10 g thể trọng

So sánh trọng lượng dịch mật ở các lô uống thuốc và lô chứng

Độ lợi mật được tính theo công thức:

LM% = x 100

Trong đó: m t : Trọng lượng dịch mật trung bình ở lô uống thuốc

m c : Trọng lượng dịch mật trung bình ở lô chứng sinh học

3.3.3.5.Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô

Lô 1 (Csl): Uống nước cất với thể tích 1,0 ml/100g

c

c t

m m

Lô 2 (chứng dương 1): Uống prednisolon 1,25 mg/kg

Lô 3 (chứng dương 2): Uống indometacin 1,5 mg/kg

Lô 4: Uống cao cỏ mật liều 3,0 g/kg

Lô 5: Uống cao cỏ mật liều 6,0 g/kg

Các thuốc chuẩn hoặc cao cỏ mật được pha trong nước cất, cho chuột uống với lượng 1,0 ml/100g

Chuột được uống cao cỏ mật trong 4 ngày liền Ngày thứ 4, sau khi uống thuốc 30 phút, gây viêm chân chuột bằng carragenin

Các thuốc chuẩn (prednisolon, indometacin) được uống 1 lần lúc 30 phút trước khi gây viêm

Gây viêm chân chuột bằng các carragenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) với liều 0,05 ml/ chân chuột, tiêm vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột

Đo thể tích chân chuột đến khớp cổ chân bằng dụng cụ chuyên biệt (máy Plethysmometer) vào các thời điểm ngay sau khi gây viêm và sau khi gây viêm 3h, 6h và 24h

Độ tăng thể tích chân chuột được tính theo công thức :

UV( %) = = x 100

Trong đó : V 0 : Thể tích chân chuột ngay sau khi gây viêm

Vt : Thể tích chân chuột tại thời điểm t (3h, 6h, 24h sau khi gây viêm) Tác dụng chống viêm cấp của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù

3.3.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn

Tiến hành theo phương pháp Ducrot R., Julou L (1965)

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô:

Lô 1 (Csh) : Uống nước cất với thể tích 1,0 ml/100g

Lô 2 (chứng dương ) : Uống indometacin 1,5 mg/kg

Lô 3 : Uống cao cỏ mật liều 3,0 g/kg

Lô 4 : Uống cao cỏ mật liều 6,0 g/kg

Gây viêm cho chuột bằng cách cấy vào dưới da gáy của chuột sợi amian trọng lượng 30 ± 1 mg (tiệt trùng 160oC / 2h) đã nhúng vào carragenin 1%

0

0

V V

Sau khi cấy amian, chuột được uống thuốc trong 5 ngày liền Ngày thứ 6, gây mê chuột bằng ether, bóc tách khối u hạt, sấy ở nhiệt độ 60oC / 90 phút Cân

So sánh trọng lượng trung bình của khối u hạt (đã trừ trọng lượng amian) giữa các lô uống thuốc và lô chứng Tác dụng chống viêm được biểu thị bằng tỉ lệ % giảm trọng lượng khối u

3.3.3.7 Nghiên cứu độc tính cấp

Độc tính cấp được xác định theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon: Chuột nhắt trắng có trọng lượng 20 ± 2g được chia thành nhiều lô, mỗi lô 10 con Cho chuột uống cao cỏ mật với liều tăng dần từ liều cao nhất không gây chết chuột đến liều thấp nhất gây chết 100% số chuột Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc nhưng vẫn được uống đủ nước Theo dõi số chuột chết trong 72 giờ đầu và tình trạng chung của chuột (ăn uống, hoạt động như đi lại, leo trèo, hoạt động bài tiết ) trong suốt 7 ngày sau khi uống thuốc Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá tổn thương mô bệnh học của các cơ quan

3.3.3.8.Nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Thỏ trắng có trọng lượng 2 ± 0,2kg được chia thành 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng một chuồng

- Lô chứng uống nước cất 5ml/kg/ngày

- Lô trị 1 uống cao cỏ mật liều tương đương 1,2g dược liệu /kg/ngày

- Lô trị 2 uống cao cỏ mật liều tương đương 4,8g dược liệu /kg/ngày

Thỏ được uống thuốc 30 ngày liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng Theo dõi các chỉ tiêu sau trong quá trình nghiên cứu

- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng creatinin trong huyết thanh ( Định lượng theo phương pháp so màu của Jaffe ) [30]

- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua một số chỉ tiêu như số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cấu, hàm lượng Hemoglobin, hematocrid, số lượng bạch cầu,công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu Các chỉ số này được định lượng trên máy

bán tự động Screen master của hãng Hospitex diagnostics Các thông số này được xác định tại 3 thời điểm trước uống thuốc và sau 15 ngày, 30 ngày uống thuốc

- Mô bệnh học: Sau 30 ngày uống thuốc, tất cả thỏ được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể của gan, thận của 30% số thỏ ở mỗi lô sau đợt nghiên cứu

3.3.3.9 Phương pháp xử lý kết quả

Tất cả các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê y học theo phương pháp TEST STUDENT

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi P < 0,05

Quy ước trong phần kết quả: Số liệu được biểu diễn dưới dạng X± SE

* : So với lô chứng sinh học (lô 1)

+ : So với lô chứng bệnh lý (lô 2)

* hoặc + : P < 0,05

* * hoặc + + : P < 0,01

* * * hoặc ++ + : P < 0,001

4 KẾT QUẢ NGHIấN CỨU 4.1 Kết quả nghiờn cứu về thực vật

4.1.1 Xỏc định tờn khoa học

* Thu thập mẫu

Để cú thể xỏc định đỳng loài Cỏ mật nghiờn cứu là Eriochloa ramosa ( Retz.)

Hack., chỳng tụi đó thu 10 mẫu thực vật cú tờn là Cỏ mật để phõn loại Việc thu mẫu được được tiến hành tại cỏc địa phương như huyện Từ Liờm, Thanh Trỡ, Đụng Anh, Gia Lõm - Hà Nội và huyện Mờ Linh- Vĩnh Phỳc Việc xỏc định đỳng loài sẽ giỳp cho việc thu đỳng nguyờn liệu phục vụ nghiờn cứu Trong số các mẫu thu thập đ−ợc gọi là

Cỏ mật, chúng tôi đã xác định đ−ợc mẫu cú đặc điểm hỡnh thỏi, cỏc đặc điểm vi phẫu thõn cõy và bột của cỏc phần trờn mặt đất của cõy như sau:

*Đặc điểm hỡnh thỏi thực vật

Hỡnh 4.1 Ảnh cõy cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., Poaceae)

Cõy thảo mọc thành bụi dầy, cao 0,3 đến 1,5m, thõn phự ở mắt và cú lụng Rễ chựm, mọc dầy đặc Lỏ mọc so le, hỡnh dải, đầu nhọn, phiến hẹp, khụng cú lụng, dài 8-15cm, bẹ lỏ xũe rụng, lưỡi bẹ ngắn, cú lụng Hoa tự hỡnh bụng kộp, phõn nhỏnh cao đến 15cm, mang 5- 8giộ, bụng nhỏ xếp lớp thưa, mọc so le Cụm hoa phự ở đầu, giộ dài 2,5-3,5 mm, nhọn, hẹp, cú lụng ở nơi gắn; dĩnh dưới gần như vắng Hoa ở trờn là

hoa lưỡng tính, dẹt, màu xám, 3 nhị chỉ nhị hình sợi, bầu thuôn dẹt, có hai vòi nhụy, núm nhụy màu hung đen Quả nằm trong mày hoa, gốc nhọn, tù ở đầu, nhẵn, dẹt có vòi tồn tại

* Đặc điểm giải phẫu

- Vi phẫu thân cây : Mặt cắt thân hình gần tròn, dưới kính hiển vi từ ngoài vào trong thấy: Biểu bì là một hàng tế bào hình tròn nhỏ, thành tế bào hóa gỗ nhiều Sát dưới biểu bì là 1-3 hàng tế bào trụ bì có thành tế bào hóa gỗ nhiều, mô mềm vỏ, cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác tròn thành mỏng, mang các đám khuyết tế bào có kích thước lớn Vòng trụ trong gồm nhiều bó libe-gỗ xếp lộn xộn thành 3 vòng trong mô mềm ruột, mỗi bó libe-gỗ cấu tạo bởi 3-4 mạch gỗ lớn xếp xen kẽ với lớp libe kém phát triển và được bao xung quanh bởi một vòng tế bào sợi hóa gỗ nhiều; hai vòng libe-gỗ phía ngoài xếp sít nhau và được ngăn cách bởi một vòng tế bào sợi liên tục, các bó libe-gỗ ngoài cùng có kích thước nhỏ hơn Mô mềm ruột là các tế bào hình đa giác hay gần tròn, kích thước lớn, thành mỏng, phía trong cùng thường bị khuyết hay rỗng ruột (Hình 4 2)

H×nh 4 2: ¶nh mét phÇn vi phÉu th©n

Cá mËt (Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., Poaceae)

Hình 4.3: ảnh một số đặc điểm bột Cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., Poaceae)

Căn cứ vào các đặc diểm hình thái và giải phẫu, đối chiếu với các tài liệu [3],[27]xác

định tên khoa học của mẫu Cỏ mật trên là Eriochloa procera ( Retz.) C.Hubb 1930

(CCVN, 3:831)- Agrostis procera Retz 1786.- Milium ramosum Retz 1971.-Eriochloa

ramosa (Retz.) Hack 1906 ( FGI,7 : 408; CCI: 339), non Kutze ( 1981)- Cỏ mật

4.1.2 Đặc điểm sinh học và phân bố

- Đặc điểm sinh học: Cây sống hàng năm, sinh trưởng và đẻ nhánh vào mùa xuân

và mùa hạ Đây là thời điểm cây đạt sinh khối lớn nhất trong năm Từ tháng 9 đến

tháng 12, cây ra hoa, kết hạt và tàn lụi vào tháng 1 năm sau Tuy nhiên ở những nơi đất

thường xuyên ẩm ướt và mầu mỡ, cây chỉ khô, lụi ở phần trên ngọn Phần thân và gốc

vẫn tồn tại để tiếp tục sinh trưởng và phát triển vào năm sau Thông thường quả chín

vào tháng 11-12 Quả chín ít rụng mà thường khô héo theo phần ngọn để cùng gục

xuống đất Sau một thời gian ngắn, hạt rời khỏi bông và chìm trong đất Vào mùa xuân,

hạt nảy mầm và phát triển cho một thế hệ mới

- Phân bố: Cây cỏ mật phân bố rộng rãi ở hầu hết các tỉnh vùng trung du và đồng

bằng nước ta Cây sống khá phổ biến trên ruộng bỏ hoang, bãi trống, bãi cỏ ven đường,

ven mương máng hoặc ven ao hồ ở hầu hết các xã trong các huyện Đông Anh, Gia

Lâm, Thanh Trì, Từ Liêm- Hà Nội, Mê linh- Vĩnh Phúc

4.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

4.2.1 Định tính các thành phần hóa học

* Định tính các thành phần hóa học bằng các phản ứng hóa học

Dược liệu được chiết với các dung môi khác nhau để làm các phản ứng định tính

Dược liệu chiết bằng ether dầu để định tính chất béo, phytosterol và carotenoid, chiết

bằng ethanol để định tính flavonoid, coumarin và alcaloid, chiết bằng nước dể định tính

đường khử, acid hữu cơ, tanin, saponin, anthraglycosid, flavonoid, acid amin, và

glycosid tim Kết quả được ghi ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Kết quả định tính một số thành phần hoá học trong cỏ mật

Carotenoid Cắn cô đặc của dịch chiết cho màu

Flavonoid

- P.ư với kiềm +Với hơi amoniac + Với dd NaOH 10%

- P.ư Cyanidin

- P.ư với dd FeCl3 5%

- P.ư với dd AlCl3

++

+ +++

+

có

Tanin - P.ư với dd FeCl3 5%

- P.ư với dd gelatin

+++

Acid amin Phản ứng với dd ninhydrin có màu xanh tím +++ Có

Anthranoid Dịch chiết nước lắc với ether mê Gạn lớp ether mê, thêm dd NaOH

lắc nhẹ có màu tím ở phân lớp

-

Không có

Alcaloid

- P.ư với TTMayer

- P.ư với TTMunier

- P.ư với TTBouchardatt

- P.ư với TTAcid picric

- ++

Hệ dung môi triển khai SKLM

Hệ dm1 : Ethyl acetat : acid acetic : acid formic : nước 10 : 1: 1 :2

Hệ dm2 :N propanol : ethyl acetat : acid acetic khan : nước 4 :3: 1: 2

Thuốc thử

1.Acid boric 10% : acid oxalic 10% 2: 1

2.Natural produc ( NP )/ PEG 4000

( dlC : Cỏ mật chiết bằng ethanol, dlN : Cỏ mật chiết bằng nước )

4.2.2 Định lượng các thành phần hóa học trong cao nước và cao cồn cỏ mật

Kết quả định tính thành phần hóa học trong cỏ mật bằng SKLM cho thấy có

flavonoid, đường, acid amin Các thành phần này đều có trong dịch chiết cồn và dịch

chiết nước Tuy nhiên khi nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan của hai loại dịch chiết này cho thấy cao nước có tác dụng tốt hơn Kết quả này cho thấy mặc dù các thành phần hóa học đã định tính là giống nhau song có thể tỷ lệ của chúng trong cao nước và cao cồn khác nhau nên tác dụng bảo vệ gan của cao nước mạnh hơn Để có thể

có kết luận về điều này và cũng là cơ sở cho việc nghiên cứu tách các lớp chất để thử tác dụng bảo vệ gan, chúng tôi tiến hành định lượng các chất tan trong ethyl acetat và xác định hàm lượng nitơ amin trong cao nước và cao cồn cỏ mật Kết quả ghi ở bảng 4.2

Bảng 4.2 Kết quả định lượng các chất tan trong etyl acetat và nitơ amin trong cỏ

4.2.3.Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hoá học

trong cỏ mật

4.2.3.1.Phân lập các hợp chất

Cỏ mật được phơi khô, nghiền nhỏ thu được 0,6 kg bột khô Sau đó mẫu này được ngâm chiết với methanol Dịch chiết methanol được loại dung môi dưới áp suất giảm và thu được 21 gam dịch cô methanol Bổ sung nước cất vào dịch cô, lắc đều rồi lần lượt chiết với hexan, clorofom, ethyl acetat, n-butanol Các dịch chiết này được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 2,2 gam dịch cô hexan, 3,5 gam dịch cô clorofom, 5,0 gam dịch cô ethyl acetat và 4,5 gam dịch cô n-butanol

Từ phân đoạn dịch cô ethyl acetat, sau khi tiến hành phân lập trên sắc ký cột kết

hợp giữa silicagel pha thường và pha đảo thu được hợp chất 3 (15 mg) dưới dạng chất

bột có màu vàng

Từ phân đoạn clorofom (3,5 gam), sau khi tiến hành phân lập bằng phương pháp sắc ký cột nhồi silicagel với hệ dung môi là CHCl3-MeOH (từ 20:1 đến 1:2 v/v) thu được bốn phân đoạn ký hiệu là F1 (0,5 g), F2 (0.8 g), F3 (1.0 g), và F4 (1.2 g) Phân đoạn F4 tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel với hệ dung môi rửa giải

là CHCl3-EtOAc (10:1, v/v) thu được hợp chất 4 (10 mg) dưới dạng chất kết tinh không màu, và hợp chất 5 (20 mg) dưới dạng chất rắn không màu Hợp chất 6 (8 mg)

nhận được dưới dạng kết tinh màu vàng từ phõn đoạn F2 sau khi tiến hành phõn lập trờn cột sắc ký YMC với hệ dung mụi là MeOH: H2O 8/2

Phần dịch nước được lọc qua giấy lọc, loại muối vụ cơ rồi phõn lập bằng cột sắc ký trao đổi ion Dianion HP-20 với hệ dung mụi rửa giải là MeOH:H2O (gradient từ 0% MeOH đến 100% MeOH) thu được cỏc phõn đoạn: FW1 (0% MeOH), FW2 (25%

MeOH), FW3 (50% MeOH), FW4 (75% MeOH) và FW5 (100% MeOH) Hợp chất 1

(13 mg) thu được dưới dạng chất bột khụng màu từ phõn đoạn FW2 sau khi tiến hành

cỏc sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng điều chế Hợp chất 2 (9 mg) cũng thu được

dưới dạng chất bột khụng màu từ phõn đoạn FW4 sau khi tiến hành phõn lập bằng cỏc phương phỏp sắc ký kết hợp

Sơ đồ 4.1: Sơ đồ chiết phân đoạn cây cỏ mật

Bổ sung nước n-hexan: nước 1/1

Sơ đồ 4.2 Sơ đồ phân lập các chất 4 – 6

Sơ đồ 4.3 Sơ đồ phân lập các chất 1 - 2

Dịch cô

CHCl3(3,5 g)

CC, Si-gel 60, 63-200 m, Clorrofom:MeOH građien

8 mg

6

YMC, MeOH: H2O, 8:2

Lớp nước

DIANION HP20 MeOH:H2O

Sơ đồ 4.4 Sơ đồ phân lập các chất 3

4.2.3.2 Hằng số vật lý và cỏc dữ kiện phổ của cỏc hợp chất

* Hợpchất 1: 20-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-

3β,12β,20(S)-trihydroxydammar-24-ene-3-O-[β-D-glucopyranoside]-glucopyranoside] (vina-erioramoside A, 1): Chất bột khụng màu, nhiệt độ núng chảy

183-184oC; ESI m/z: (positive) 1131 [M+Na]+; (negative) 1107[M-H]- (C 54 H 92 O 23); 1NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): Xem bảng 4.3

H-Bảng 4.3 : Kết quả dữ kiện phổ NMR của chất 1

Silica gel CC axeton/CHCl 3 /H 2 O:

5/10/0.5 F1A (1g) F1B (1g) F1C (1,2g) F1D (1g)

3 (12mg)