Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây khúng khéng (hovenia dulcis thumb ) ở cao bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol

BÙI THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY KHÚNG KHÉNG Hovenia dulcis Thunb.. BÙI THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ

BÙI THỊ KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY

KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)

Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PARACETAMOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI – 2015

BÙI THỊ KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY

KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)

Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PARACETAMOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn :

1 TS Bùi Hồng Cường

2 DS Trần Thị Phương Liên Nơi thực hiện :

1 Bộ môn Dược học cổ truyền

2 Viện Dược liệu

HÀ NỘI - 2015

trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phương Thiện Thương, TS Phạm Thị

Nguyệt Hằng, DS Phạm Huy Bách cùng các anh chị cán bộ của Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Khoa Dược lý Sinh hóa Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ

tôi trong thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu của đề tài này

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy Cô giáo và các anh chị kỹ

thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn

hỗ trợ kịp thời và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại

bộ môn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể

các Thầy Cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn yêu quý của tôi đã luôn

động viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt qua mọi khó khăn

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy

cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Tác giả Khóa luận

Bùi Thị Khánh Linh

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia 2

1.1.3 Phân loại chi Hovenia 3

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố, sinh thái của cây Khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.) 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA 4

1.2.1 Thành phần hóa học của Hovenia dulcis 4

1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia 7

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA 7

1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis 7

1.3.2 Tác dụng sinh học của Hovenia acerba và Hovenia trichocarpa 11

1.4 CÔNG DỤNG THEO DÂN GIAN, Y HỌC CỔ TRUYỀN CỦA KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 14

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học: 15

2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học: 15

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

chuột nhắt trắng bằng Paracetamol 16

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 19

3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học…… 19

3.1.2 Định tính các nhóm chất đặc trưng bằng sắc kí lớp mỏng 30

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PARACETAMOL 35

3.2.1 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên trọng lượng gan chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.5) 38

3.2.2 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.6) 38

3.2.3 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.7) 39

3.2.4 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hàm lượng MDA gan chuột bị gây độc bằng PAR 40

3.3 BÀN LUẬN 41

3.3.1 Về thành phần hóa học 41

3.3.2 Về tác dụng bảo vệ gan 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ALT Alanin amino transferase

AST Aspartat amino transferase

NAPQI N-acetyl parabenzoquinon-imin

OD Optical density (Mật độ quang)

UV Ultra violet (Tia cực tím)

γ-GT Gamma glutamyl transferase

1 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng

(Hovenia dulcis)

28

2 Bảng 3.2: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-hexan 32

3 Bảng 3.3 Kết quả SKLM cắn phân đoạn ethyl acetat 33

4 Bảng 3.4: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-buthanol 35

5 Bảng 3.5: Trọng lượng gan chuột ở các lô nghiên cứu 38

6 Bảng 3.6: Hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 38

7 Bảng 3.7: Hoạt độ AST trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 39

8 Bảng 3.8: Hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lô nghiên cứu 41

1 Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng 5

2 Hình 1.2: Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng 6

3 Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng 13

4 Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan 17

5 Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn Khúng khéng 30

6 Hình 3.2: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân

đoạn n-hexan (Hx) của Khúng khéng

31

7 Hình 3.3: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân

đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng

33

8 Hình 3.4: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân

đoạn n-buthanol (Bu) của Khúng khéng

34

9 Hình 3.5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử tác dụng bảo vệ gan của Khúng

khéng

37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khúng khéng - còn gọi là chỉ cụ, vạn thọ, kê trảo [7], [11] có tên khoa học

Hovenia dulcis Thunb., họ Táo ta (Rhamnaceae), là một loài cây được trồng và mọc

hoang rải rác tại các tỉnh phía Bắc, chủ yếu ở Cao Bằng và Lạng Sơn.Trên thế giới

đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Khúng khéng Trong đó nổi bật là tác dụng bảo vệ gan trước các tác nhân gây độc như CCl4, D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [14], [17], [19], [23], [24], [27], [28], [46] Tại Việt Nam, từ lâu nhân dân ta cũng đã biết sử dụng Khúng khéng để giải độc rượu, giảm các cảm giác bồn chồn, buồn nôn và nôn sau khi uống rượu [7], [11] Tuy nhiên, các nghiên cứu

về Khúng khéng ở Việt Nam chỉ mới dừng lại ở mức độ sàng lọc, chưa thực sự đầy

đủ và chuyên sâu Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử dụng cây Khúng khéng từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn, nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc trong dân gian cũng như phục vụ

cho công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Khúng khéng (Hovenia sp.)

ở Cao Bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol” được tiến hành với những mục tiêu cụ thể như sau:

- Định tính thành phần hóa học trong cuống mang quả và quả Khúng khéng bằng các phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng

- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cắn chiết ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat của Khúng khéng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)

1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [2], vị trí của chi Hovenia như sau:

Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Lớp phụ (Subclass): Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Bộ (Order): Bộ Táo ta (Rhamnales)

Họ (Family) : Họ Táo ta (Rhamnaceae)

Chi (Genus): Hovenia

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia

Cây rụng lá hoặc hiếm khi cây bụi, cao tới 25m Cành non có nhiều lông hoặc có lông măng Lá thay liên tiếp, cuống lá dài, 3 gân, gân chính với gân bên 4-8 đôi, phiến lá không cân, mép răng cưa

Hoa trắng hoặc màu vàng - xanh, lưỡng tính, mẫu 5, cụm hoa chuỳ mọc ở kẽ

lá hoặc cuối cành Đài ống hình bán cầu, thuỳ hình tam giác, hướng trục có sống rõ ràng Cánh hoa hình elip hoặc hình trứng, hơi dính nhau ở đáy, hiếm khi có khía ở đỉnh, thường bao bọc hoàn toàn nhị hoa, có mở rộng khi nở Nhị hoa được bao bọc bởi cánh hoa, chỉ nhị hình mũi mác, bao phấn đính lưng Đĩa gần tròn, dày, nhiều thịt, thường có nhiều lông tơ, hiếm khi nhẵn, làm đầy ống đài Bầu nhuỵ ở thấp hơn bên dưới 1 nửa, gần như hoàn toàn chìm trong đĩa, bầu 3 ngăn, mỗi ngăn 1 noãn, kiểu 2 hoặc 3 miếng, chẻ nhánh sâu

Quả hạch gần hình cầu, nhẵn hoặc nhiều lông, đế với ống đài không rụng, đỉnh mới, vỏ quả giữa như da, thường tách từ màng vỏ quả trong; khi chín những nhánh con mang quả trở nên nạc và nhiều nước Hạt 3, màu hơi nâu hoặc hơi đen, bóng, dẹt hoặc hình cầu, thường có vết lõm [20]

1.1.3 Phân loại chi Hovenia

Theo phân loại của Nguyên Tiến Bân và các cộng sự chi Hovenia chỉ có 01 loài là Hovenia dulcis Thunb [1]

Tuy nhiên theo Thực vật chí Trung Quốc [20], chi Hovenia gồm có 3 loài như

ở mặt dưới Gốc lá tròn, đầu lá nhọn, mép lá khía răng cưa không đều 3 gân tỏa ra

từ gốc lá [10], 5 - 6 cặp gân phụ khác [9] Mặt trên lục sẫm, mặt dưới nhạt [11] Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành xim ngắn hơn lá Hoa màu trắng hoặc lục nhạt, đường kính 6-8mm, cuống hoa nhỏ và nhẵn [10] Đài hoa hình chén khía 5 răng nhỏ kích thước 2,2 - 2,5 × 1,6 - 2 mm, nhẵn Tràng 5 cánh nhọn, hình thìa hoặc hình trứng, kích thước 2,4 - 2,6 x 1,8 - 2,1 mm [20] Đĩa có lông thưa thớt Nhị 5 xếp xen kẽ với cánh hoa Bầu nhụy hình cầu, nhẵn, đường kính 2 - 2,2 mm, bầu có đầu nhụy chia 3 [11]

Quả hạch có 3 hạt, gần hình cầu, nhẵn, khi chín có màu đen hoặc nâu xám, đường kính 6,5 - 7,5 mm Khi chín, cuống quả và những nhánh con mang quả trở nên mọng nước, màu hồng, nhiều thịt và có vị ngọt, ăn được [10], [11] Hạt tròn, dẹt, có màu nâu bóng, đường kính 5 - 5,5 mm [11], [20]

Mùa hoa: tháng 5 - 6, mùa quả: tháng 8 - 10 [11]

1.1.4.2 Phân bố, sinh thái

Cây Khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.) phân bố ở vùng ôn đới ấm và cận

nhiệt đới Đông - Bắc Á bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên Ngoài ra còn gặp ở Nga và cận Himalaya của Ấn Độ Cây thường mọc trong các thung lũng, gần bờ suối trên các loại đất còn tương đối màu mỡ Ở Việt Nam, Khúng khéng là cây nhập nội, được trồng rải rác các tỉnh Lạng Sơn và Cao Bằng [7], [10], [11] Cây ưa sáng, thường có ở vườn hoặc bờ mương rẫy, ra hoa quả nhiều Xung quanh gốc cây mẹ thường thấy cây con mọc từ hạt Có thể trồng Khúng khéng bằng hạt hoặc bằng cây mọc từ chồi rễ [7], [11]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA 1.2.1 Thành phần hóa học của Hovenia dulcis

Nghiên cứu bộ phận dùng gồm cuống mang quả, quả và hạt của Hovenia

dulcis, thấy có các thành phần sau:

- Quả chứa: lipid 74%, protein 3,07%, acid toàn phần 358,8 mg/kg, ascorbat 16,29 mg/100g, đường 28,55%, đường khử 13,96%, acid amin 2,38 mg/100g và các

nguyên tố vi lượng như Fe, Ca, Cu, Mn, P, Zn… [11]

- Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh sự hiện diện của các nhóm chất:

flavonoid [26], [41], [45]; alcaloid [31], [33]; saponin [15], [42], [43], [44]

1.2.1.1 Flavonoid

Năm 2000, trong công bố về bằng sáng chế liên quan đến cây Khúng khéng

[26], tác giả Kim H.S và Lee H.Y đã phân lập được hợp chất Hovenodulinol (I) có

cấu trúc tương tự các flavonoid khác trong Khúng khéng đã được phân lập trước đó

như Hovenitin (II), (+) Ampelopsin (III), Laricetrin (IV), Myricetin (V), (+)

Gallocatechin (VI) [11] (hình 1.1)

Năm 2013, Wu long-huo và cộng sự đã tách được 10 hợp chất từ cây Khúng

khéng bao gồm kaempferol (VII), myricitin (VIII), dihydromyricitin (IX), dihydroxy-3',4',5'-methoxyflavon (X), chrysophanol (XI), ethyl caffeat (XII), 3- hydroxy-4-methoxybenzoic acid (XIII), β-sitosterol (XIV), epicatechin (XV) và

5,7-vanillin (XVI) Trong đó các hợp chất X, XI, XII, XIII và XV là lần đầu phân lập

được trên loài này [41] (hình 1.1)

Hovenodulinol (I) Hovenitin (II) (+) Ampelopsin (III)

Myricetin (V) (+) Gallocatechin (VI)

Kaempferol (VII) Myricitin (VIII) Epicatechin (XV)

Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng

Một số flavonoid khác được phân lập từ hạt Khúng khéng như: (2R, 3R) 5,7,4’,5’ tetrahydroxy 3’ methoxy dihydro flavonol; (2R, 3S) 5,7,3’,4’,5’ pentahydroxyhydro flavanol; (2R, 3S) 5,7,4’,5’ tetrahydroxy 3’ methoxy dihydro flavonol [45]

1.2.1.2 Saponin

Lá Khúng khéng chứa các saponin triterpenoid A, B, C, D, E, F, G Ngoài ra còn có Jujubogenin , 20 – O – α L – rhamnopyranosyl jujubogenin, hodulcin, acid gymnemic và ziziphin, acid hovenic [11] Trong đó: saponin C2, D, G là các saponin mới, được xác định cấu trúc bằng quang phổ NMR và có tên khoa học lần lượt là: 3-O-(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-α-L-arabinopyranosyl) jujubogenin; 3-O-(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin; và 3-O-β-D-glucopyranosyl-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin [42]

Năm 1995, hai chất triterpen glucosid có hoạt tính sinh vật ức chế sự giải phóng histamin được Yosikawa, Masayuki, Ueda Tomishiko phát hiện và đặt tên là

hovenidulcinosid A1 và A2 [44] (hình 1.3)

Hình 1.2 : Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng

Các nghiên cứu về sau thấy 4 hợp chất loại damaran 16-17 seco là hovenidulciocosid A1 A2 B1 B2 đã được chiết xuất và xác định cùng với hodulosid III Chúng đều có tác dụng ức chế sự giải phóng histamin [43]

Năm 2002, Atta ur Rahman đã công bố trong cây Khúng khéng có rất nhiều saponin như jujuboside B, hoduloside I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, hovenoside

I, saponin C2, saponin E và saponin H Đây là các saponin đặc trưng cho chi

Hovenia [15] Bên cạnh các saponin này, Yoshikawa và cộng sự đã phát hiện thêm

các hodulosid V là những damaran glucosid [11]

1.2.1.3 Alcaloid

Ba alcaloid peptid bao gồm frangulanine, hovenin A, hovenin B được phân lập từ dịch chiết methanol của vỏ rễ Trong khi Hovenin A đã được xác định cấu trúc là des-N-methyl-frangulanine (II) thì cấu trúc của Hovenin B chưa được làm

sáng tỏ [31]

Hạt Khúng khéng chứa alcaloid perlorin, perlolyrin, β – carbolin [7], [11], [33]

1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia

Các công trình nghiên cứu đã phân lập được 25 hợp chất từ quả của Hovenia

acerba và xác định được cấu trúc của 23 hợp chất như: Hovenin A, B, C, D;

myricerin, quecertin, laricetin, kaempferol, hovenitin I, epigallocatechin… và 2 saponin triterpenoid mới như acerboside A và acerboside B [18]

Ngoài ra có 3 steroid được phân lập lần đầu tiên: beta-sitosterol, hydroxy-3-deoxymoronic acid và beta-sitosteryl-3-O-beta-D-glucopyranoside [47]

3-beta-Trong hạt của Hovenia trichocarpa, 2 saponin mới là dẫn xuất của

pseudojujubogenin đã được phát hiện và xác định cấu trúc [49]

1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis

1.3.1.1 Tác dụng bảo vệ gan

Cao chiết ethanol, methanol hoặc nước của Hovenia dulcis đều được chứng

minh có tác dụng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm trước các tác nhân gây độc như Carbon tetrachloride, D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các

mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [19], [23], [24], [46] Trong đó thành phần

mang lại hoạt tính được phỏng đoán là dihydromyricetin ((+) - Ampelopsin) có nhiều trong dịch chiết methanol [23]

Năm 2006, một nghiên cứu được thực hiện tại Đại học Y Bắc Kinh cho thấy

dịch chiết nước của Hovenia dulcis làm giảm nồng độ cồn trong máu và tăng cường hoạt tính của enzyme ADH sau khi uống rượu Nghĩa là Hovenia dulcis có khả năng

ngăn cản sự hấp thu rượu ở đường tiêu hóa, tăng chuyển hóa rượu tại gan, phòng chống say rượu và các tác dụng bất lợi do rượu gây ra [16]

Năm 2007, một nghiên cứu khác được thực hiện trên chuột với mục đích

đánh giá ảnh hưởng của phân đoạn dịch chiết ethyl acetat từ hạt của Hovenia lên hệ

thống các enzym chuyển hóa ở gan Cyt P450 Kết quả là phân đoạn dịch chiết này

có ảnh hưởng khác nhau lên một số enzym hệ Cyt P450 cụ thể là: hoạt động của enzym khử NADPH - cyt C và erythromycin N - demethylase không bị ảnh hưởng., hoạt động của aminopyrine N-demethylase trong gan đã tăng lên đến 42,4% Các biểu hiện mARN của CYP1A1, CYP2C11 và CYP3A1 đều tăng lên rõ rệt [48] Năm 2010, Du J cùng cộng sự đã thực hiện nghiên cứu riêng trên hạt của

Hovenia dulcis, kết quả cũng cho thấy dịch chiết hạt Hovenia dulcis có tác dụng bảo

vệ gan do ngộ độc rượu cấp tính thông qua việc làm giảm đáng kể hoạt độ men AST

và ALT, tăng cường hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa như: superoxide dismutase glutathione S - transferase, glutathione tạo điều kiện cho quá trình chuyển hóa rượu [17]

Bên cạnh đó, tác dụng bảo vệ của nước trái cây và giấm lên men từ Hovenia

dulcis chống lại những thay đổi sinh hóa mạn tính ở chuột đực gây ra do ethanol đã

được nghiên cứu Khi sử dụng ethanol (50%, v/v, 10 mL/kg) trong 6 tuần trên chuột thí nghiệm cho thấy tổn thương gan với sự gia tăng đáng kể (P < 0,01) các enzym gan như AST, ALT, γ-GT trong huyết thanh và mức độ peroxid hóa lipid của gan

(LPO) Ngược lại, khi sử dụng nước hoa quả hoặc giấm lên men từ Hovenia dulcis

(10 mL/kg) cùng với ethanol cho thấy sự giảm đáng kể (P < 0,05) các enzym (AST, ALT và γ-GT), các chỉ số gan, nồng độ triglyceride và cholesterol trong huyết thanh, LPO gan Những con chuột được sử dụng nước trái cây hoặc giấm lên men

từ Hovenia dulcis cho thấy hệ thống chống oxy hóa tốt hơn với lượng glutathione,

tổng superoxide dismutase, catalase hoạt động và glutathione peroxidase tương đối cao Tất cả những kết quả này được đi kèm cùng những quan sát mô học ở gan Từ

đó, cho thấy cả nước hoa quả và dấm lên men từ Hovenia dulcis đều có tác dụng

trong việc làm giảm các tác dụng phụ của rượu [37]

Năm 2012, Minchun Wang và đồng sự cũng đã chứng minh được tác dụng bảo vệ gan do ngộ độc rượu cấp tính của các thành phần polysaccharide - chủ yếu

gồm galactose, arabinose, rhamnose và acid galacturonic - trong cuống quả Hovenia

dulcis Dịch chiết Hovenia dulcis làm giảm đáng kể nồng độ AST, ALT trong huyết

thanh, giảm đáng kể mức độ của MDA trong gan và phục hồi đáng kể các hoạt động của các enzym superoxide dismutase và glutathione peroxidase ở chuột bị tổn thương gan do rượu [38]

Mới đây nhất, năm 2015, các nghiên cứu ở Đại học Shaanxi Normal, Trung Quốc đã được tiến hành để tìm hiểu tác dụng bảo vệ của myricetin (MYR) tinh chế

từ Hovenia dulcis Thunb về chống rối loạn chức năng nội mô mạch máu và tổn

thương gan ở chuột sử dụng nước chứa 3% choline MYR đã được chứng minh là

có hoạt động thu dọn các gốc DPPH˙, HO-, và O2˙ mạnh mẽ Sử dụng liên tục MYR liều 400 mg/kg và 800 mg/kg ở chuột uống choline có thể làm giảm đáng kể cholesterol huyết thanh, triglyceride, lipoprotein tỷ trọng thấp, endothelin 1, thromboxan A2 các loại cũng như ALT và AST, trong khi nồng độ lipoprotein tỉ trọng cao, endothelin nitric oxide synthase, oxit nitric và prostaglandin I2 được nâng lên rõ rệt ở chuột (p < 0,05, p < 0,01) Đồng thời, MYR 400 mg/kg và 800 mg/kg cũng gia tăng hoạt động tổng hợp superoxide dismutase và glutathione peroxidase

và giảm MDA gan so với những con chuột được sử dụng choline (p<0,05, p<0,01) Những kết quả này cho thấy rằng MYR đóng vai trò bảo vệ quan trọng trong việc chống rối loạn chức năng nội mô và tổn thương gan ở chuột có chế độ ăn nhiều choline Đây là báo cáo đầu tiên cho thấy rằng hàm lượng của choline cao trong chế

độ ăn uống có thể gây tổn thương gan và MYR có thể cải thiện tình trạng rối loạn chức năng nội mô mạch máu và gan tổn thương do choline gây ra [22]

1.3.1.2 Tác dụng chống oxy hóa

Theo một nghiên cứu của Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc:

Cắn phân đoạn ethyl acetat thu được từ dịch chiết methanol của Hovenia dulcis

Thunb thể hiện các hoạt động bảo vệ hệ thần kinh chống lại glutamate gây độc thần kinh ở các tế bào HT22 vùng đồi thị của chuột Sự cách ly đường dẫn bảo vệ

hệ thần kinh bắt nguồn từ 8 hợp chất phenolic (1-8) như: vanillic axit (1), axit ferulic (2), 3,5 - dihydroxystilbene (3), (+) - aromadendrin (4), methyl vanillate (5), (-) - catechin (6), 2,3,4 - trihydrobenzoic acid (7) và (+) - afzelechin (8) Trong số này, các hợp chất 6 và 8 có tác dụng bảo vệ thần kinh trên glutamate gây độc thần kinh trong các tế bào HT22 do chúng có thể là các tác nhân dọn dẹp gốc tự do [30]

1.3.1.3 Tăng cường hoạt động thể chất, chống mệt mỏi:

Khi tiến hành nghiên cứu trên mô hình chuột đang thực hiện hoạt động bơi

người ta thấy rằng: Dịch chiết từ cuống quả Hovenia dulcis Thunb (HDT) sử dụng

bằng đường uống làm tăng thời gian bơi đáng kể so với nhóm chuột đối chứng Điều này là do HDT làm giảm đáng kể nồng độ hormon stress như cortisol, hormon kích thích thượng thận ACTH (adrenocorticotropic hormone) Nồng độ của acid thiobarbituric đã đột ngột giảm trong cơ bắp cẳng chân ở cả liều 100 mg/kg và 200 mg/kg của HDT so với nhóm chuột đối chứng Đồng thời HDT làm gia tăng đáng

kể các tác nhân chống oxy hóa trong gan như superoxide dismutase Ngoài ra, HDT làm giảm đáng kể lượng glucose máu, cholesterol toàn phần và triglyceride Những kết quả này gợi ý rằng HDT đã có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường hoạt động thể chất đáng kể thông qua tác dụng chống căng thẳng và chống oxy hóa [32]

1.3.1.4 Tăng cường miễn dịch

Theo một nghiên cứu in vitro đánh giá hoạt động miễn dịch, các

polysaccharide trong cuống quả HDT bao gồm chủ yếu rhamnose, arabinose, galactose và axit galacturonic làm tăng cường đáng kể hoạt động thực bào, sản xuất oxit nitric và hoạt động acid phosphatase của các đại thực bào phúc mạc, có thể được đánh giá như một tác nhân điều hòa miễn dịch tự nhiên tiềm năng [39]

1.3.1.5 Tác dụng hạ đường huyết

Theo một nghiên cứu đã được công bố trong tạp chí Dược liệu Trung Quốc năm 2002 cho thấy: Khi sử dụng mô hình gây tiểu đường bởi alloxan và chia chuột thành 3 nhóm Một nhóm chỉ đơn thuần gây mô hình, một nhóm điều trị với liều lượng khác nhau của HDT trong 7 ngày, nhóm còn lại được điều trị tích cực với glibenclamide Sau đó, tiến hành đo lượng đường trong máu và glycogen gan Kết quả là: nồng độ đường trong máu của những con chuột được điều trị bằng HDT hoặc glibenclamide thấp hơn đáng kể so với nhóm mô hình Nồng độ glycogen gan

ở nhóm điều trị bằng HDT liều trung bình hoặc thấp và nhóm glibenclamide được tăng lên đáng kể Từ đó thấy rằng HDT có tác dụng hạ đường máu và có thể trở thành một loại thảo dược chống bệnh tiểu đường hiệu quả [25]

1.3.1.6 Tác dụng chống dị ứng

4 hợp chất saponin: hovenidulciosides A1, A2, B1, B2 được phân lập từ quả

và hạt của HDT tại Trung Quốc đã được chứng minh có tác dụng ức chế sự phóng thích histamine từ tế bào màng bụng của chuột [43], [44]

1.3.2 Tác dụng sinh học của Hovenia acerba và Hovenia trichocarpa

2 hợp chất Saponin mới được phân lập từ hạt của Hovenia trichocarpa thể

hiện tác dụng gây độc tế bào, chống lại dòng tế bào ung thư của người trong một

thử nghiệm in vitro [49]

Các hợp chất Hovenin A - D được phân lập từ hạt của Hovenia acerba đều

thể hiện tác dụng chống viêm và tác dụng ức chế sản xuất oxit nitric [18]

KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.)

Khúng khéng có vị ngọt, hơi chát, tính bình, có công dụng trừ phiền chỉ khát, chỉ thổ, thanh nhiệt, lợi tiểu và giải độc rượu [7] Khúng khéng còn là vị thuốc bổ dưỡng, trị tiêu hóa và đại tiểu tiện kém, nôn mửa, ngộ độc, miệng khô khát [11]

Khi dùng lấy 100 g dược liệu ngâm với một lít rượu 40o, càng lâu càng tốt Rượu có màu đỏ sẫm như rượu vang Ngày uống 3 lần trước bữa ăn, mỗi lần 30 ml

[11]

Ở Trung Quốc, cuống quả được dùng để trị say rượu, phiền nhiệt, miệng khát, nôn mửa, đại tiểu tiện bất lợi Ngày dùng 6 g, ngâm rượu uống [7], [11] Ở Nhật Bản, hạt khúng khéng là thuốc bổ giải độc chữa ngộ độc rượu, tiểu tiện không thông, cơ thể gầy yếu, khát nước khô cổ Ngày dùng 3 - 5 g, ngâm rượu uống [11],

[10]

Ở Ấn Độ, cao chiết từ quả khúng khéng chứa kali nitrat và kali malat là thuốc có tác dụng lợi tiểu mạnh [11]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu: Cuống mang quả và quả của cây Khúng khéng được thu hái tại Cao Bằng vào tháng 10 năm 2014 Mẫu nghiên cứu được làm sạch, phơi khô, đựng trong 2 lần túi PE kín và lưu trữ tại Phòng Lưu mẫu, Khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

- Mẫu thực vật được Th.S Nguyễn Quỳnh Nga và Th.S Hoàng Văn Toán - cán

bộ Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa học là

Hovenia dulcis Thunb (Phụ lục 1)

- Mẫu thực vật được lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu với số hiệu là DL – 050515

Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

 Thiết bị dùng cho nghiên cứu:

- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích, bếp đun cách thủy

- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60

- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200

- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng 254 nm và 366 nm)

- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn,

bình cầu, phễu, giấy lọc…

- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3

- Máy vi tính với phần mềm winCATS

- Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) (code: 1.05554.0001)

- Kit định lượng ALT, AST và bilirubin do hãng Human cung cấp

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Human Lyzer 2000

- Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU

- Máy nghiền đồng thể

 Hóa chất, dung môi

- Các dung môi: ethanol (C), methanol (Me), hexan (Hx), ethylacetat (Et),

n-buthanol (Bu), acid formic, cloroform, toluen, ether dầu hỏa… đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn DĐVN IV

- Các thuốc thử dùng trong phản ứng hóa học: TT Lugol, TT Bouchardat, TT Mayer, TT Dragendoff, TT Diazo được pha theo hướng dẫn của DĐVN IV

- Các thuốc thử hiện màu trong sắc ký lớp mỏng, đặc hiệu cho các nhóm chất: hỗn hợp acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2:1), anisaldehyd trong ethanol, … pha theo các tài liệu tham khảo

- Các thuốc thử tinh khiết dùng trong thử tác dụng bảo vệ gan: KCl, acid

tricloracetic, acid thiobarbituric, HCl 0,1N chuẩn, acid acetic, n-butanol,

CCl4, dầu olive

- Các thuốc dùng trong nghiên cứu:

o Silymarin (biệt dược Honymarin) dạng viên nén hàm lượng 70 mg của hãng Alpha pharma (Korea)

o Paracetamol (độ tinh khiết 98%) do Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp

 Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino khỏe mạnh, sử dụng cả chuột đực và

chuột cái, trọng lượng từ 20 ± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp bởi Ban chăn nuôi, Học Viện Quân Y 103

Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng chăn nuôi, Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày

và trong suốt thời gian nghiên cứu theo các tài liệu hướng dẫn thường quy

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học:

Định tính bằng phản ứng hóa học từ dịch chiết toàn phẩn của Khúng khéng bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, acid sulfuric)

Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 98%

chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, ethylacetat, n-buthanol Khảo sát hệ dung môi pha động để định tính các nhóm chất

chính trong các phân đoạn với các thuốc thử đặc trưng

2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:

Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol bao gồm:

- Tác dụng chống viêm gan cấp

- Tác dụng chống oxy hóa

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học

Chuẩn bị mẫu: Sấy khô dược liệu ở nhiệt độ 60oC Tán nhỏ bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo

Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu Khúng khéng bằng phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [4], [5], [6].

2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM

Chiết xuất dịch chiết toàn phần bằng dung môi ethanol 98% bằng phương pháp chiết nóng hồi lưu, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Lắc phân đoạn bằng phân bố cắn dịch chiết ethanol vào nước và chiết lỏng - lỏng với các dung môi có

độ phân cực tăng dần theo thứ tự lần lượt là n-hexan, ethyl acetat, n-butanol kết hợp

thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khác nhau để chọn ra hệ cho kết quả tách tốt nhất đối với từng phân đoạn kết hợp quan sát ở các bước sóng UV-VIS với thuốc thử hiện màu đặc trưng, lưu giữ bằng máy ảnh với các thông số đặc trưng Cách tiến hành:

 Hoạt hóa bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) ở 110oC trong 1 giờ

 Bão hòa hệ dung môi khai triển trong 20-30 phút

 Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 - 15μl các dung dịch phân tích

 Sau khi triển khai để khô trong không khí hoặc sấy nhẹ

 Phun các thuốc thử hiện màu đặc trưng cho các nhóm chất và sấy ở nhiệt độ phù hợp

 Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254nm, 366nm, ánh sáng trắng trước và sau khi phun thuốc thử

2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol

Mẫu thử: cắn ethanol toàn phần (KKC) và cắn phân đoạn ethyl acetat

(KKE) Các cắn được hòa vào nước cất thành các nồng độ khác nhau để phù hợp với yêu cầu của thí nghiệm trước khi cho chuột uống

Phương pháp thử: nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc

bằng paracetamol có tham khảo các tài liệu hướng dẫn [13], [21], [35], [36], [40] và điều chỉnh phù hợp với môi trường nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Phân chia lô thí nghiệm: Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 7 lô:

 Lô 1 (chứng sinh học): uống nước cất

 Lô 2 (mô hình): uống nước cất + uống PAR 220 mg/kg

 Lô 3 (chứng dương): uống silymarin liều 100 mg/kg + uống PAR 220mg/kg

 Lô 4: uống KKC liều 200 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg

 Lô 5: uống KKC liều 500 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg

 Lô 6: uống KKE liều 200 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg

 Lô 7: uống KKE liều 500 mg cao/kg + uống PAR 220 mg/kg

Tiến hành thí nghiệm: Chuột trong các lô được uống nước cất hoặc mẫu thử

hoặc silymarin liên tục trong 8 ngày, mỗi ngày một lần vào buổi sáng Ngày thứ 8, sau uống nước cất hoặc mẫu thử hoặc silymarin 1 giờ và nhịn đói 16 - 18 giờ trước

đó, gây độc cho chuột ở tất cả các lô (trừ lô chứng sinh lý) bằng uống PAR liều 220 mg/kg với thể tích 0,2 ml/10g

Phương pháp đánh giá: 24 giờ sau khi gây độc bằng PAR, lấy máu động

mạch cảnh của tất cả các chuột trong thí nghiệm bằng cách cắt cổ, ly tâm lấy huyết thanh để định lượng enzym ALT, AST Đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, định lượng MDA dịch đồng thể để đánh giá tác dụng của mẫu thử

Nguyên lý phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan: MDA (malonyl

dialdehyd) là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gan MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng

và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 - 532nm

Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan

Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol

Nguyên tắc định lượng MDA: Định lượng MDA theo phương pháp

Wasowich và Balahoroglu [40]

Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M Hút 200 μl dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H2O, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25% pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100oC trong 60 phút Để nguội, thêm 25 µl

HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3,5 ml n-butanol, ly tâm 3000 v/phút x 10 phút, hút phần

n-butanol đo quang ở bước sóng 532 nm Hàm lượng MDA được tính theo phương

trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh (lô mô hình) sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của mẫu thử

Phương pháp xử lý số liệu, đánh giá kết quả: Các số liệu thu thập được xử lý

bằng phương pháp thống kê y sinh học theo t - Test Student, sử dụng phần mềm Microsoft – Excel, để đánh giá mức độ khác nhau giữa các lô Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng trừ độ lệch chuẩn (μ = X ± SD) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

3.1.1.1 Định tính flavonoid:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml cồn

90o Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

a Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5) giọt Để yên một vài phút

Kết quả: Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam Phản ứng dương

tính với mẫu nghiên cứu

b Phản ứng với kiềm

Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô

rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng

Kết quả: vết màu vàng đậm hơn so với tờ giấy đối chứng Phản ứng dương

tính với mẫu nghiên cứu

Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm

vài giọt dung dịch NaOH 10%

Kết quả: Xuất hiện tủa vàng và khi thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu

vàng của dung dịch tăng thêm Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu

c Phản ứng với FeCl 3

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%

Kết quả: xuất hiện dung dịch màu xanh đen Phản ứng dương tính với mẫu

nghiên cứu

d Phản ứng với diazo hóa

Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9 g acid sulfanilic trong 9 ml HCl đậm đặc

(đun nóng), pha loãng với nước đến 100 ml Lấy 10 ml dung dịch ngâm trong nước

đá rồi cho thêm 10 ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút Dung dịch chỉ pha để dùng ngay Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy vài phút)

Kết quả: xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống nghiệm Phản ứng dương tính với

mẫu nghiên cứu

Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa Flavonoid

3.1.1.2 Định tính coumarin:

Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành các phản ứng sau:

a Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết:

- Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

- Ống 2: để nguyên

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát Nếu có coumarin quan sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát

- Ống 1: dd vẫn đục

- Ống 2: trong suốt

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại trong như ống 2

Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu

b Phản ứng diazo hóa:

Cho vào ống ngiệm nhỏ 1 ml dịch chiết thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo

Kết quả: Không xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống nghiệm Phản ứng âm tính

với mẫu nghiên cứu

c Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dich NaOH 5% Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ miếng kim loại

ra Quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại

Kết quả: phần không bị che và phần bị che đều không phát huỳnh quang

Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu

Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa coumarin

3.1.1.3 Định tính saponin:

Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích

250 ml, thêm 5 ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi 15 phút Lọc nóng qua giấy lọc dịch lọc được đưa vào làm các phản ứng

a Phản ứng tạo bọt:

Cho 0,5 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm trong 30 giây Để yên Quan sát cột bọt sau

15 phút

Kết quả: xuất hiện cột bọt cao 1 cm và bền vững sau 15 phút

b Phân biệt 2 loại saponin:

Lấy hai ống nghiệm có đướng kính trong bằng nhau:

Kết quả: cột bọt ở cả hai ống cao bằng nhau

c Phản ứng Salkowski:

Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ theo thành ống nghiệm 2 - 3 giọt acid sulfuric đặc

Kết quả: Xuất hiện vòng màu đỏ tía ở mặt phân cách Lắc nhẹ dung dịch

màu đỏ nhạt Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu

Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa saponin triterpenoid

3.1.1.4 Định tính glycosid tim:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu đã tán nhỏ cho vào một bính nón dung tích

250 ml Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn dịch chiết vào cốc có

mỏ dung tích 100 ml Thêm vào dịch chiết 30 ml Chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt Chì acetat, nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml Chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với Chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml, gạn lớp cloroform vào một cốc

có mỏ đã được sấy khô Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng Natrisulfat khan

Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô, cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng sau:

a Phản ứng Liebermann – Burchardat (TT phản ứng lên nhân Steroid của glycosid):

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn Glycosid tim 1 ml anhydrid acetic Lắc đều cho tan hết cắn Nghiếng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có Glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai

lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá

Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu

b Phản ứng Baljet (TT phản ứng lên vòng butenolic của các glycosid và aglycol thuộc nhóm cardenolid):

Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric

1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều:

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam

So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn, nếu có Glycosid tim thì thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu

c Phản ứng Legal (TT phản ứng lên vòng butenolic):

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ một giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ thấy xuất hiện màu đỏ cam So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn Nếu có Glycosid tim thì thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

Chú ý: Phản ứng của vòng lacton cho màu sắc không bên cần quan sát màu

ngay sau khi nhỏ thuốc thử

Kết quả: phản ứng âm tính với dịch chiết mẫu nghiên cứu

d Phản ứng Keller – Kiliani (TT phản ứng với đường 2-desoxy):

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Nhỏ từ từ theo thành ống 0,5 ml aicd sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có Glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá

Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu

Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa glycosid tim

3.1.1.5 Định tính anthranoid (dạng tự do):

Phản ứng Bortraeger:

Chiết xuất: Lấy 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10 ml) Thêm

5ml nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50 ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5 ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform

để làm phản ứng

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch amoniac 10% Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nước sẽ có màu đỏ sim Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có acid chrysophanic Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ

Kết quả: Lớp nước không có màu đỏ sim Phản ứng âm tính với dịch chiết

mẫu nghiên cứu

Anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) được định tính hoàn

toàn tương tự nhưng trong bước chiết xuất ban đầu thay thế 5 ml nước cất bằng 5 ml

Kết quả: không thấy tinh thể hinh kim màu vàng Nhỏ dung dịch NaOH lên

lam kính, không xuất hiện dung dịch màu đỏ