Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây khúng khéng (hovenia dulcis thumb ) ở cao bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PARACETAMOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PARACETAMOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn : 1. TS. Bùi Hồng Cường 2. DS. Trần Thị Phương Liên Nơi thực hiện : 1. Bộ môn Dược học cổ truyền 2. Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Thầy TS. Bùi Hồng Cường và DS. Trần Thị Phương Liên – người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như động viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt từ những bước đầu tiên cho đến khi hoàn thiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phương Thiện Thương, TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng, DS. Phạm Huy Bách cùng các anh chị cán bộ của Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Khoa Dược lý Sinh hóa Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm nghiên cứu của đề tài này. Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các Thầy Cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn hỗ trợ kịp thời và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn yêu quý của tôi đã luôn động viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt qua mọi khó khăn. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015. Tác giả Khóa luận Bùi Thị Khánh Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) 2 1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia 2 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia 2 1.1.3 Phân loại chi Hovenia 3 1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố, sinh thái của cây Khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.) 3 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA 4 1.2.1 Thành phần hóa học của Hovenia dulcis 4 1.2.1 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cùng chi Hovenia 7 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA 7 1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis 7 1.3.2 Tác dụng sinh học của Hovenia acerba và Hovenia trichocarpa 11 1.4 CÔNG DỤNG THEO DÂN GIAN, Y HỌC CỔ TRUYỀN CỦA KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) 11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 14 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học: 15 2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học: 15 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học. 15 2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM 16 2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol. 16 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 19 3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học…… 19 3.1.2 Định tính các nhóm chất đặc trưng bằng sắc kí lớp mỏng 30 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG PARACETAMOL 35 3.2.1 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên trọng lượng gan chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.5) 38 3.2.2 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.6) 38 3.2.3 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.7) 39 3.2.4 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hàm lượng MDA gan chuột bị gây độc bằng PAR 40 3.3 BÀN LUẬN 41 3.3.1 Về thành phần hóa học 41 3.3.2 Về tác dụng bảo vệ gan 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADH Alcohol dehydrogenase ALT Alanin amino transferase AST Aspartat amino transferase BuOH, Bu n - buthanol dd dung dịch EtOAc, Et Ethyl acetat EtOH, C Ethanol Hx n – hexan HD Hovenia dulcis HDT Hovenia dulcis Thunb. KK Khúng khéng KKC Cắn chiết Ethanol toàn phần của Khúng khéng KKE Cắn chiết phân đoạn Ethyl acetat của Khúng khéng MDA Malonyl dialdehyd MeOH Methanol MYR Myricetin NAPQI N-acetyl parabenzoquinon-imin OD Optical density (Mật độ quang) PAR Paracetamol R f Retension factor SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin - layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TT Thuốc thử UV Ultra violet (Tia cực tím) γ-GT Gamma glutamyl transferase DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng (Hovenia dulcis) 28 2 Bảng 3.2: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-hexan 32 3 Bảng 3.3. Kết quả SKLM cắn phân đoạn ethyl acetat 33 4 Bảng 3.4: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-buthanol 35 5 Bảng 3.5: Trọng lượng gan chuột ở các lô nghiên cứu 38 6 Bảng 3.6: Hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 38 7 Bảng 3.7: Hoạt độ AST trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu 39 8 Bảng 3.8: Hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lô nghiên cứu 41 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng 5 2 Hình 1.2: Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng 6 3 Hình 2.1: Một số hình ảnh mẫu nghiên cứu thu hái tại Cao Bằng 13 4 Hình 2.2: Nguyên tắc định lượng MDA dịch đồng thể gan 17 5 Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn Khúng khéng 30 6 Hình 3.2: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân đoạn n-hexan (Hx) của Khúng khéng 31 7 Hình 3.3: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng 33 8 Hình 3.4: Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (C) và cắn phân đoạn n-buthanol (Bu) của Khúng khéng 34 9 Hình 3.5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử tác dụng bảo vệ gan của Khúng khéng 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Khúng khéng - còn gọi là chỉ cụ, vạn thọ, kê trảo [7], [11] có tên khoa học Hovenia dulcis Thunb., họ Táo ta (Rhamnaceae), là một loài cây được trồng và mọc hoang rải rác tại các tỉnh phía Bắc, chủ yếu ở Cao Bằng và Lạng Sơn.Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Khúng khéng. Trong đó nổi bật là tác dụng bảo vệ gan trước các tác nhân gây độc như CCl 4 , D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [14], [17], [19], [23], [24], [27], [28], [46]. Tại Việt Nam, từ lâu nhân dân ta cũng đã biết sử dụng Khúng khéng để giải độc rượu, giảm các cảm giác bồn chồn, buồn nôn và nôn sau khi uống rượu [7], [11]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về Khúng khéng ở Việt Nam chỉ mới dừng lại ở mức độ sàng lọc, chưa thực sự đầy đủ và chuyên sâu. Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử dụng cây Khúng khéng từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn, nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc trong dân gian cũng như phục vụ cho công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Khúng khéng (Hovenia sp.) ở Cao Bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol” được tiến hành với những mục tiêu cụ thể như sau: - Định tính thành phần hóa học trong cuống mang quả và quả Khúng khéng bằng các phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng. - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cắn chiết ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat của Khúng khéng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol . 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI HOVENIA VÀ CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb.) 1.1.1 Vị trí phân loại chi Hovenia Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [2], vị trí của chi Hovenia như sau: Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Lớp phụ (Subclass): Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ (Order): Bộ Táo ta (Rhamnales) Họ (Family) : Họ Táo ta (Rhamnaceae) Chi (Genus): Hovenia 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hovenia Cây rụng lá hoặc hiếm khi cây bụi, cao tới 25m. Cành non có nhiều lông hoặc có lông măng. Lá thay liên tiếp, cuống lá dài, 3 gân, gân chính với gân bên 4-8 đôi, phiến lá không cân, mép răng cưa. Hoa trắng hoặc màu vàng - xanh, lưỡng tính, mẫu 5, cụm hoa chuỳ mọc ở kẽ lá hoặc cuối cành. Đài ống hình bán cầu, thuỳ hình tam giác, hướng trục có sống rõ ràng. Cánh hoa hình elip hoặc hình trứng, hơi dính nhau ở đáy, hiếm khi có khía ở đỉnh, thường bao bọc hoàn toàn nhị hoa, có mở rộng khi nở. Nhị hoa được bao bọc bởi cánh hoa, chỉ nhị hình mũi mác, bao phấn đính lưng. Đĩa gần tròn, dày, nhiều thịt, thường có nhiều lông tơ, hiếm khi nhẵn, làm đầy ống đài. Bầu nhuỵ ở thấp hơn bên dưới 1 nửa, gần như hoàn toàn chìm trong đĩa, bầu 3 ngăn, mỗi ngăn 1 noãn, kiểu 2 hoặc 3 miếng, chẻ nhánh sâu. Quả hạch gần hình cầu, nhẵn hoặc nhiều lông, đế với ống đài không rụng, đỉnh mới, vỏ quả giữa như da, thường tách từ màng vỏ quả trong; khi chín những nhánh con mang quả trở nên nạc và nhiều nước. Hạt 3, màu hơi nâu hoặc hơi đen, bóng, dẹt hoặc hình cầu, thường có vết lõm [20]. [...]... 2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol bao gồm: - Tác dụng chống viêm gan cấp - Tác dụng chống oxy hóa 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học Chuẩn bị mẫu: Sấy khô dược liệu ở nhiệt độ 60oC Tán nhỏ bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở. .. và xác định cấu trúc [49] 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI HOVENIA 1.3.1 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis 1.3.1.1 Tác dụng bảo vệ gan Cao chiết ethanol, methanol hoặc nước của Hovenia dulcis đều được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm trước các tác nhân gây độc như Carbon tetrachloride, D-Galactosamine/Lipopolysaccharide và rượu trong các mô hình gây độc gan. .. nhóm chất và sấy ở nhiệt độ phù hợp  Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254nm, 366nm, ánh sáng trắng trước và sau khi phun thuốc thử 2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol Mẫu thử: cắn ethanol toàn phần (KKC) và cắn phân đoạn ethyl acetat (KKE) Các cắn được hòa vào nước cất thành các nồng độ khác nhau để phù hợp với yêu cầu của thí... hồi đáng kể các hoạt động của các enzym superoxide dismutase và glutathione peroxidase ở chuột bị tổn thương gan do rượu [38] Mới đây nhất, năm 2015, các nghiên cứu ở Đại học Shaanxi Normal, Trung Quốc đã được tiến hành để tìm hiểu tác dụng bảo vệ của myricetin (MYR) tinh chế từ Hovenia dulcis Thunb về chống rối loạn chức năng nội mô mạch máu và tổn thương gan ở chuột sử dụng nước chứa 3% choline MYR... gây tổn thương gan và MYR có thể cải thiện tình trạng rối loạn chức năng nội mô mạch máu và gan tổn thương do choline gây ra [22] 10 1.3.1.2 Tác dụng chống oxy hóa Theo một nghiên cứu của Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc: Cắn phân đoạn ethyl acetat thu được từ dịch chiết methanol của Hovenia dulcis Thunb thể hiện các hoạt động bảo vệ hệ thần kinh chống lại glutamate gây độc thần kinh ở. .. nghiệm trước khi cho chuột uống Phương pháp thử: nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc bằng paracetamol có tham khảo các tài liệu hướng dẫn [13], [21], [35], [36], [40] và điều chỉnh phù hợp với môi trường nghiên cứu tại phòng thí nghiệm 17 Phân chia lô thí nghiệm: Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 7 lô:  Lô 1 (chứng sinh học) : uống nước cất  Lô 2 (mô hình) : uống nước cất +... bào HT22 vùng đồi thị của chuột Sự cách ly đường dẫn bảo vệ hệ thần kinh bắt nguồn từ 8 hợp chất phenolic (1- 8) như: vanillic axit ( 1), axit ferulic ( 2), 3,5 - dihydroxystilbene ( 3), ( +) - aromadendrin ( 4), methyl vanillate ( 5), ( -) - catechin ( 6), 2,3,4 - trihydrobenzoic acid ( 7) và ( +) - afzelechin ( 8) Trong số này, các hợp chất 6 và 8 có tác dụng bảo vệ thần kinh trên glutamate gây độc thần kinh trong... (II), ( +) Ampelopsin (III), Laricetrin (IV), Myricetin (V), ( +) Gallocatechin (VI) [11] (hình 1. 1) Năm 2013, Wu long-huo và cộng sự đã tách được 10 hợp chất từ cây Khúng khéng bao gồm kaempferol (VII), myricitin (VIII), dihydromyricitin (IX), 5,7dihydroxy-3',4',5'-methoxyflavon (X), chrysophanol (XI), ethyl caffeat (XII), 3hydroxy-4-methoxybenzoic acid (XIII), β-sitosterol (XIV), epicatechin (XV) và. .. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học: Định tính bằng phản ứng hóa học từ dịch chiết toàn phẩn của Khúng khéng bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, acid sulfuric) Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 98% chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, ethylacetat, n-buthanol Khảo sát hệ dung môi pha... và 5 vanillin (XVI) Trong đó các hợp chất X, XI, XII, XIII và XV là lần đầu phân lập được trên loài này [41] (hình 1. 1) Hovenodulinol (I) ( +) Ampelopsin (III) Myricetin (V) Kaempferol (VII) Hovenitin (II) ( +) Gallocatechin (VI) Myricitin (VIII) Epicatechin (XV) Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng Một số flavonoid khác được phân lập từ hạt Khúng khéng như: (2R, 3R) 5,7,4’,5’ tetrahydroxy . chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Khúng khéng (Hovenia sp .) ở Cao Bằng trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng. PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học. 15 2.4.2 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM 16 2.4.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương. ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ KHÁNH LINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY KHÚNG KHÉNG (Hovenia dulcis Thunb .) Ở CAO BẰNG TRÊN MÔ HÌNH GÂY TỔN THƯƠNG GAN CHUỘT