thanh chuột bị gây độc bằng PAR (bảng 3.7)
Bảng 3.7: Hoạt độ AST trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu
Lô thí nghiệm N AST (UI/L)
SD X % giảm so với lô 2 p so với lô 1 p so với lô 2 Lô 1 (chứng sinh học) 11 29,31 ± 4,92 95,60 Lô 2 (gây mô hình) 12 666,70 ± 121,70 < 0,0001 Lô 3 (silymarin 100 mg/kg) 10 245,95 ± 139,04 63,11 > 0,05 < 0,05 Lô 4 (KKC 200 mg/kg) 12 125,71 ± 34,11 81,15 < 0,05 < 0,001 Lô 5 (KKC 500 mg/kg) 15 95,35 ± 32,88 85,70 > 0,05 < 0,0001 Lô 6 (KKE 200 mg/kg) 14 59,34 ± 12,51 91,10 > 0,05 < 0,0001 Lô 7 (KKE 500 mg/kg) 15 42,00 ± 6,03 93,70 > 0,05 < 0,0001
Nhận xét: Hoạt độ AST ở lô 2 (mô hình) tăng cao rõ rệt (95,60%) so với lô 1 chứng sinh học (p < 0,0001).
Hoạt độ AST ở các lô chuột uống cắn chiết ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat ở cả 2 mức liều và silymarin 100 mg/kg đều giảm rõ rệt so với lô 2 (p < 0,05 – 0,0001) nhưng vẫn tăng hơn lô 1 (chứng sinh học).
Mức độ hạn chế tăng hoạt độ AST ở các lô chuột uống dịch chiết Khúng khéng đều lớn hơn so với lô chuột uống silymarin 100 mg/kg và lô chuột uống cắn
phân đoạn ethyl acetat ở cả 2 mức liều đều có tác dụng hạn chế hoạt độ AST lớn hơn so với lô chuột uống cắn ethanol toàn phần.
3.2.4 Ảnh hưởng của cắn chiết Khúng khéng lên hàm lượng MDA trong gan chuột bị gây độc bằng PAR
Xây dựng đường chuẩn hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan.
Hàm lượng MDA trong dịch đồng thể được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA: y = 32,455 x – 0,3411
Trong đó: - x là mật độ quang đo được.
- y là hàm lượng MDA dịch đồng thể (nmol/ml dịch đồng thể) Sau khi tính được hàm lượng MDA trong dịch đồng thể (nmol/ml dịch đồng thể), suy ra hàm lượng MDA trong gan chuột (nmol/100mg gan).
Bảng 3.8: Hàm lượng MDA trong gan chuột ở các lô nghiên cứu Lô thí nghiệm n MDA (nmol/100mg gan) SD X % giảm so với lô 2 p so với lô 1 p so với lô 2 Lô 1 (chứng sinh học) 11 75,77 ± 4,54 25,17 Lô 2 (gây mô hình) 13 101,26 ± 8,60 < 0,05 Lô 3 (silymarin 100 mg/kg) 11 72,29 ± 4,23 28,61 < 0,01 > 0,05 Lô 4 (KKC 200 mg/kg) 13 83,28 ± 4,69 17,76 > 0,05 > 0,05 Lô 5 (KKC 500 mg/kg) 14 97,05 ± 5,74 4,16 < 0,01 > 0,05 Lô 6 (KKE 200 mg/kg) 14 83,40 ± 4,24 17,63 > 0,05 > 0,05 Lô 7 (KKE 500 mg/kg) 15 78,31 ± 2,77 22,66 > 0,05 < 0,05
Nhận xét: Hàm lượng MDA ở lô 2 (mô hình) tăng rõ rệt (25,17%) so với lô 1 chứng sinh học (p < 0,05).
Hàm lượng MDA trong gan ở các lô chuột uống cắn chiết ethanol toàn phần, cắn phân đoạn ethyl acetat và silymarin đều giảm so với lô 2, tuy nhiên sự khác biệt chỉ có ý nghĩa thống kê ở lô chuột uống cắn phân đoạn ethyl acetat liều 500 mg/kg.
3.3 BÀN LUẬN
3.3.1 Về thành phần hóa học
Đề tài đã sử dụng những phương pháp nghiên cứu thường quy tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ của dược liệu.
Sử dụng máy chấm sắc ký Linomat 5, điều khiển bằng phần mềm WinCATS nên kết quả thu được khá rõ ràng, hữu ích cho việc định tính và bán định lượng thành phần hóa học trong dịch chiết, đóng góp cơ sở dữ liệu cho công tác kiểm nghiệm sau này.
Theo các tài liệu tham khảo, Hovenia dulcis có các nhóm chất chính là flavonoid [26], [41], [45] và saponin [15], [42], [43], [44]. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng đều cho thấy có sự phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Dựa vào sắc ký đồ của các phân đoạn ta nhận thấy rằng:
- Phân đoạn n-hexan tách được nhiều vết màu từ hồng đến tím sau khi hiện màu bằng thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol. Có thể sơ bộ kết luận rằng trong phân đoạn này có các chất có khung terpenoid hoặc steroid [3]. - Phân đoạn ethyl acetat chứa các vết phát huỳnh quang xanh sáng hơn dưới
UV 366 nm sau khi phun thuốc thử acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2 : 1) so với vết trước khi phun thuốc thử nên có thể kết luận sơ bộ là các flavonoid [3].
Flavonoid là nhóm chất được nhiều nhà khoa học quan tâm do nhóm chất này được nghi ngờ là nguồn gốc của một số tác dụng sinh học như chống oxy hóa (khả năng khóa các gốc tự do, tạo phức với ion kim loại là tác nhân của phản ứng oxy hóa), bảo vệ gan trước các tác nhân gây độc như CCl4, ethanol,... Do đó đây là cơ sở để góp phần lựa chọn phân đoạn thử tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt trắng.
- Phân đoạn n-buthanol xuất hiện nhiều vết tách nhau khá rõ trong đó có các vết có màu xanh ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử anisaldehyd trong ethanol nên có thể kết luận sơ bộ phân đoạn này có chứa saponin hoặc các chất có khung terpenoid [3].
Đây mới chỉ là những khảo sát bước đầu, là cơ sở để lựa chọn hệ dung môi thích hợp với từng loại cắn phân đoạn dùng làm dung môi rửa giải cho sắc ký cột phục vụ cho việc chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết sau này. Đồng thời những kết quả định tính bằng SKLM cũng là cơ sở cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu.
3.3.2 Về tác dụng bảo vệ gan
3.3.2.1 Lựa chọn mô hình thực nghiệm
Để gây tổn thương gan trên thực nghiệm, có thể dùng nhiều chất hóa học khác nhau như paracetamol, CCl4, D - galactosamin, ethanol, thiocetamid… Mỗi một mô hình gây tổn thương gan đều có cơ chế riêng. Trong nghiên cứu này, với mục đích đánh giá tác dụng bảo vệ gan, paracetamol (PAR) được lựa chọn làm tác nhân gây tổn thương gan. PAR là thuốc hạ sốt, giảm đau được sử dụng rộng rãi để
điều trị triệu chứng trong nhiều bệnh và được dùng khá phổ biến. PAR sau khi vào cơ thể, 93% được đào thải qua nước tiểu dưới dạng liên hợp, 2% ở dạng không đổi, phần còn lại được chuyển hóa qua CYP2E1 trong hệ thống enzym Cyt - P450 ở gan để tạo thành N-acetyl parabenzoquinon-imin (NAPQI) – một gốc tự do gây peroxy hóa lipid và sinh ra MDA dẫn đến tổn thương các tế bào gan. Với liều điều trị thông thường, PAR ít gây độc với gan vì lượng NAPQI sinh ra sẽ được trung hòa ngay bởi glutathion, một chất chống oxy hóa có sẵn trong tế bào gan, tạo ra cystein và liên hợp mercapturic không độc và đào thải ra ngoài. Nhưng với liều cao, lượng NAPQI sinh ra nhiều, lượng glutathion trong gan không đủ để trung hòa, khi đó tế bào gan sẽ bị tổn thương. PAR gây tổn thương gan ngoài cơ chế sinh ra các gốc tự do như CCl4, còn làm cạn kiệt hệ thống chống oxy hóa của cơ thể (các chất thiol…). Trong lâm sàng, khi tế bào gan bị tổn thương sẽ dẫn đến rối loạn cấu trúc và chức năng gan. Các tế bào gan thực hiện các chức năng gan nhờ vào một hệ thống enzym. Khi tế bào gan bị tổn thương, các enzym này sẽ được giải phóng vào máu và nồng độ enzym sẽ tăng cao trong máu. Khi tổn thương gan, dẫn đến sự thay đổi của ít nhất 20 enzym trong huyết thanh, trong đó sự thay đổi của 2 enzym là AST và ALT có giá trị chẩn đoán hơn cả. Hoạt độ AST và ALT tăng cao và tăng sớm trong viêm gan do virus hoặc nhiễm độc. Các enzym này xuất hiện trong máu sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng và hết muộn sau khi triệu chứng đã hết. ALT chỉ có trong bào tương tế bào gan còn AST chủ yếu nằm trong các ti thể và một số cơ quan khác như tim, phổi. Vì vậy, khi tổn thương ở mức độ tế bào (chưa làm ảnh hưởng tới màng ti thể) thì chủ yếu là ALT và một phần nhỏ AST được giải phóng vào máu. Do vậy, để đánh giá mức độ tổn thương gan ở giai đoạn đầu thì việc đánh giá hoạt độ ALT là chính xác và đặc hiệu hơn [29], [34].
Mức độ tổn thương gan do PAR gây ra tùy thuộc vào liều lượng và đường dùng. Khi dùng liều PAR càng cao thì mức độ tổn thương gan càng nặng, có thể dẫn tới tử vong. Hiện nay, trên thị trường PAR được dùng chủ yếu theo đường uống. Khoa Dược lý sinh hóa Viện dược liệu đã tiến hành thăm dò liều gây độc PAR trên chuột nhắt trắng theo đường uống với nhiều mức liều khác nhau và đưa ra (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lựa chọn mức liều 220 mg/kg để quan sát được tổn thương gan ở mức độ vừa phải, chuột không chết sau khi gây độc.
Silymarin được lựa chọn là thuốc đối chứng dương. Silymarin được dùng trong nhiều nghiên cứu, là một thuốc có nguồn gốc từ thực vật – là hỗn hợp các flavonolignan (silybin, silychristin, silydiamin) có trong quả của cây Silybum marianum Gaertn., họ Cúc (Asteraceae) [5] vốn đã được sử dụng điều trị các chứng vàng da và rối loạn đường mật. Silymarin có hiệu quả bảo vệ gan ở các mức độ khác nhau khỏi bị phá hủy bởi rượu, hóa chất, thuốc, bệnh tật và ngộ độc cây cỏ, được chứng minh có tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan theo cơ chế: tăng tạo các cyt - P450 trong lưới nội bào; có tác dụng ổn định tế bào, ngăn cản quá trình xâm nhập của các chất độc vào bên trong tế bào gan do đó nó làm bền vững màng tế bào, duy trì được cấu trúc, chức năng của tế bào; có tác dụng ức chế sự biến đổi của gan thành các tổ chức xơ, giảm sự hình thành và lắng đọng của các sợi collagen dẫn đến xơ gan; có tác dụng tăng cường chức năng gan và kích thích sự phát triển của các tế bào gan đã bị hủy hoại cũng như có tác dụng chống peroxy hóa lipid, chống viêm, từ đó cải thiện các dấu hiệu, triệu chứng bệnh gan, làm giảm nồng độ các enzym trong máu.
3.3.2.2 Lựa chọn liều dùng thuốc
Khúng khéng được người dân địa phương sử dụng dưới nhiều dạng như: ngâm rượu uống hoặc sắc lấy nước, với liều thường dùng là 3 - 5g dược liệu khô/ngày cho người lớn [12] tương đương 0,06 - 0,1 g/kg thể trọng/ngày (tính trung bình người lớn nặng 50 kg). Tiến hành ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa người và động vật thí nghiệm để tính liều dùng ở chuột nhắt trắng là 0,6 - 1,0 g/kg (theo hệ số 10) [8].
Mẫu thử trong nghiên cứu được bào chế dưới dạng cắn chiết ethanol toàn phần và cắn chiết phân đoạn ethyl acetat có độ ẩm xác định. Từ độ ẩm đo được, ta có tỉ lệ chiết là 1,18 kg dược liệu khô thu được 0,21 kg cắn ethanol toàn phần khô tuyệt đối. Vì vậy trong nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan này, chúng tôi tiến hành thử trên 2 mức liều là 200 mg/kg chuột và 500 mg/kg chuột (tính theo cắn khô
tuyệt đối). Mức liều này áp dụng cho cả 2 loại cắn để có thể so sánh tác dụng của cắn ethanol toàn phần và phân đoạn ethyl acetat từ đó định hướng nghiên cứu phân lập hoạt chất trong phân đoạn ethyl acetat.
3.3.2.3 Tác dụng của cắn ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat đối với gan chuột bị gây độc bởi Paracetamol.
Có sự khác nhau về số chuột thí nghiệm (n) trong các lô nghiên cứu do trong quá trình làm thí nghiệm một số chuột bị chết hoặc vì lý do nào đó mà kết quả biến động quá lớn so với giá trị của cả nhóm nên cần loại đi. Sự loại bỏ này trên cơ sở loại đi số liệu lạc mà không thay đổi kết quả nghiên cứu trước và sau khi loại.
Kết quả thí nghiệm cho thấy:
- Cắn chiết ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat từ Khúng khéng không có tác dụng làm giảm trọng lượng gan chuột so với lô 2 mô hình (p > 0,05). Có thể lý giải điều này do việc gây độc bằng PAR ở mức liều 220 mg/kg chưa đủ để làm tăng trọng lượng gan chuột so với lô 1 chứng sinh học.
- Với tác dụng chống viêm gan cấp: Cả cắn chiết ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat Khúng khéng ở cả 2 mức liều 200 mg/kg và 500 mg/kg đều có tác dụng làm giảm rõ rệt hoạt độ AST (p < 0,001) và ALT (p < 0,0001) trong huyết thanh. Mức độ giảm mạnh hơn so với liều Silymarin 100 mg/kg và phụ thuộc vào liều: liều tăng thì tác dụng tăng. Từ đó có thể để xuất dò liều để tìm ra liều thấp nhất cho hiệu quả tối ưu với mỗi loại cắn.
- Với tác dụng chống oxy hóa: cả 2 mức liều này của cắn chiết ethanol đều không thể hiện tác dụng chống oxy hóa cụ thể là: hàm lượng MDA trong gan giảm so với lô 2 mô hình thấp và không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05); chỉ có mức liều 500 mg/kg (tương ứng với 26g dược liệu/kg) của cắn phân đoạn ethyl acetat có tác dụng chống oxy hóa thông qua việc làm giảm hàm lượng MDA trong gan (p < 0,05). Từ đây đề xuất việc dò liều cắn phân đoạn ethyl acetat để tìm liều thấp nhất cho hiệu quẩ tối ưu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Thành phần hóa học
Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu của khóa luận tốt nghiệp, kết quả thu được như sau:
- Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học: xác định trong dược liệu Khúng khéng có flavonoid, saponin, tanin, đường khử, acid amin, polysaccarid, acid hữu cơ, sterol, chất béo.
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng:
Với cắn n-hexan, sử dụng hệ dung môi toluen : ethyl acetat (7 : 3) cho kết quả tách tốt với 9 vết khi quan sát dưới UV 366 nm và 6 vết có màu từ tím đến hồng khi quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử acid sulfuric 10% trong ethanol. Có thể kết luận phân đoạn
n-hexan chứa các chất có khung steroid hoặc terpenoid.
Với cắn ethyl acetat, sử dụng hệ dung môi ethyl acetat : methanol : nước (100 : 13 : 10) cho kết quả tách với 3 vết phát huỳnh quang mạnh hơn khi quan sát dưới UV 366 nm và có màu từ vàng đến cam khi quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2 : 1). Có thể kết luận phân đoạn ethyl acetat chứa flavonoid.
Với cắn n-buthanol, sử dụng hệ dung môi cloroform : methanol : amoniac (65 : 35 : 10) cho kết quả tách tốt với 8 vết khi quan sát dưới UV 366 nm và 6 vết có màu từ xanh đến tím khi quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử anisaldehyd 10% trong ethanol. Có thể kết luận phân đoạn n-buthanol chứa các saponin hoặc các chất có khung terpenoid.
2. Tác dụng bảo vệ gan:
Cắn ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat của Khúng khéng (Hovenia dulcis) có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng paracetamol.
- Ở cả 2 mức liều 200 mg/kg và 500 mg/kg của cả cắn ethanol toàn phần và cắn phân đoạn ethyl acetat đều có tác dụng hạn chế tổn thương gan trên mô hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol thông qua hạn chế tăng hoạt độ enzym ALT, AST, tuy nhiên không có tác dụng hạn chế tăng trọng lượng gan tương đối.
- Cắn chiết ethyl acetat liều cao 500 mg/kg chuột có tác dụng chống oxy hoá thông qua tác dụng làm giảm hàm lượng MDA trong gan.
KIẾN NGHỊ
Trên đây là một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bằng Paracetamol của cây Khúng khéng thu hái tại Cao Bằng, Việt Nam. Để có thể sản xuất được sản phẩm ứng dụng cây thuốc độc đáo này theo hướng điều trị mới, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu về các mặt sau:
- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của dược liệu đi sâu vào chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học một số hoạt chất chính, có hàm lượng cao của Khúng khéng.
- Nghiên cứu đặc điểm vi học và khảo sát các chỉ tiêu để xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Khúng khéng.
- Nghiên cứu một số tác dụng dược lý khác của Dược liệu như: tác dụng chống nôn, nhuận tràng, lợi tiểu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});