3.1.1.1 Định tính flavonoid:
Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml cồn 90o. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng 10 mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5) giọt. Để yên một vài phút.
Kết quả: Dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
b. Phản ứng với kiềm
Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng.
Kết quả: vết màu vàng đậm hơn so với tờ giấy đối chứng. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%.
Kết quả: Xuất hiện tủa vàng và khi thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: xuất hiện dung dịch màu xanh đen. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9 g acid sulfanilic trong 9 ml HCl đậm đặc (đun nóng), pha loãng với nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch ngâm trong nước đá rồi cho thêm 10 ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá. Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút. Dung dịch chỉ pha để dùng ngay.
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy vài phút).
Kết quả: xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống nghiệm. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa Flavonoid.
3.1.1.2 Định tính coumarin:
Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành các phản ứng sau:
a. Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết: - Ống 1: thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. - Ống 2: để nguyên.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát. Nếu có coumarin quan sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong. Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát.
- Ống 1: dd vẫn đục. - Ống 2: trong suốt.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại trong như ống 2.
Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
b. Phản ứng diazo hóa:
Cho vào ống ngiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo.
Kết quả: Không xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống nghiệm. Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
c. Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dich NaOH 5%. Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra. Quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại.
Kết quả: phần không bị che và phần bị che đều không phát huỳnh quang. Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa coumarin.
3.1.1.3 Định tính saponin:
Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 5 ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi 15 phút. Lọc nóng qua giấy lọc. dịch lọc được đưa vào làm các phản ứng.
a. Phản ứng tạo bọt:
Cho 0,5 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 ml nước cất, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm trong 30 giây. Để yên. Quan sát cột bọt sau 15 phút.
Kết quả: xuất hiện cột bọt cao 1 cm và bền vững sau 15 phút.
b. Phân biệt 2 loại saponin:
Lấy hai ống nghiệm có đướng kính trong bằng nhau: - Ống 1: cho 5 ml HCl 0,1N.
- Ống 2: cho 5 ml NaOH 0,1N.
Cho thêm 1 ml dịch chiết ethanol vào mỗi ống rồi bịt miệng ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh cả hai ống trong 30 giây. Để yên, quan sát cột bọt sau 15 phút.
Kết quả: cột bọt ở cả hai ống cao bằng nhau.
c. Phản ứng Salkowski:
Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm. Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ theo thành ống nghiệm 2 - 3 giọt acid sulfuric đặc.
Kết quả: Xuất hiện vòng màu đỏ tía ở mặt phân cách. Lắc nhẹ dung dịch màu đỏ nhạt. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa saponin triterpenoid.
3.1.1.4 Định tính glycosid tim:
Cân khoảng 10 g bột dược liệu đã tán nhỏ cho vào một bính nón dung tích 250 ml. Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml. Thêm vào dịch chiết 30 ml Chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt Chì acetat, nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1 ml Chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với Chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100 ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml, gạn lớp cloroform vào một cốc có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng Natrisulfat khan.
Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô, cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Liebermann – Burchardat (TT phản ứng lên nhân Steroid của
glycosid):
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn Glycosid tim 1 ml anhydrid acetic. Lắc đều cho tan hết cắn. Nghiếng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Nếu có Glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai
lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá.
Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
b. Phản ứng Baljet (TT phản ứng lên vòng butenolic của các glycosid và aglycol thuộc nhóm cardenolid):
Pha thuốc thử Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn, nếu có Glycosid tim thì thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
c. Phản ứng Legal (TT phản ứng lên vòng butenolic):
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ một giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ thấy xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn. Nếu có Glycosid tim thì thấy ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
Chú ý: Phản ứng của vòng lacton cho màu sắc không bên cần quan sát màu ngay sau khi nhỏ thuốc thử.
Kết quả: phản ứng âm tính với dịch chiết mẫu nghiên cứu.
d. Phản ứng Keller – Kiliani (TT phản ứng với đường 2-desoxy):
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Nhỏ từ từ theo thành ống 0,5 ml aicd sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Nếu có Glycosid tim thì ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa glycosid tim.
3.1.1.5 Định tính anthranoid (dạng tự do): Phản ứng Bortraeger:
Chiết xuất: Lấy 1 g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10 ml). Thêm 5ml nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50 ml. Làm nguội dịch lọc. Thêm 5 ml cloroform. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm phản ứng.
Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch amoniac 10%. Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có acid chrysophanic. Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu.
Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ.
Kết quả: Lớp nước không có màu đỏ sim. Phản ứng âm tính với dịch chiết mẫu nghiên cứu.
Anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) được định tính hoàn toàn tương tự nhưng trong bước chiết xuất ban đầu thay thế 5 ml nước cất bằng 5 ml H2SO4 1N.
Kết quả: phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
Phản ứng vi thăng hoa:
Đặt khoảng 3 g bột dược liệu trong một đĩa nhôm. Hơ nhẹ trên bếp điện cho bay hết nước trong dược liệu. Đặt lên trên đĩa nhôm một phiến kính, trên phiến kính đó có để một miếng bông đã tẩm nước lạnh. Để đĩa nhôm trực tiếp trên bếp điện. Sau 5 - 10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển vi.
Kết quả: không thấy tinh thể hinh kim màu vàng. Nhỏ dung dịch NaOH lên lam kính, không xuất hiện dung dịch màu đỏ.
Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa anthranoid.
3.1.1.6 Định tính tanin:
Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để làm các phản ứng định tính sau:
- Phản ứng 1: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc. Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT).
Kết quả: xuất hiện dung dịch màu màu xanh nâu. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
- Phản ứng 2: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc. Thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT).
Kết quả: xuất hiện tủa bông. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu. - Phản ứng 3: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc. Thêm 5 giọt dung dịch
gelatin 1%.
Kết quả: xuất hiện tủa bông trắng. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa tanin.
3.1.1.7 Định tính alcaloid:
Cân 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml. Thêm 15 ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun đến sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8 ml) đến pH = 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alcaloid bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết cloroform. Loại nước bằng Natrisulfat khan. Lấy một phần dịch chiết cloroform đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Kết quả: không xuất hiện tủa, phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu. - Ống 2: TT Bouchardat.
Kết quả: không xuất hiện tủa. Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu. - Ống 3: TT Dragendoff.
Kết quả: không xuất hiện tủa. Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa alcaloid.
3.1.1.8 Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ
Lấy khoảng 1 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội. Lọc. dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính sau:
Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước. Thêm vào 5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy 10 phút.
Kết quả: Đáy ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch.phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa đường khử.
Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn. cho vào mỗi ống: - Ống 1: 4 ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol.
- Ống 2: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol. Quan sát và so sánh hai ống nghiệm.
Kết quả: ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa polysaccharid.
Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết nước. Thêm vào 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy sôi 10 phút.
Kết quả: dung dịch có màu tím hoặc xanh tím. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa acid amin.
Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn 4 ml dịch chiết nước. Thêm một ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm.
Kết quả: có bọt khí sủi lên. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa acid hữu cơ.
3.1.1.9 Định tính chất béo, sterol, caroten
Cân 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml. Đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm. Lọc thu lấy dịch lọc để làm phản ứng:
Định tính chất béo: nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi.
Kết quả: quan sát thấy vết mờ trên giấy lọc. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa chất béo.
Định tính sterol: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thủy bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống nghiệm 45o, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: Tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng có vòng tròn màu tím đỏ. Phản ứng dương tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu có chứa chất béo.
Định tính caroten: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn. Quan sát.
Kết quả: dung dịch không đổi màu. Phản ứng âm tính với mẫu nghiên cứu.
Kết luận sơ bộ: Trong thành phần mẫu nghiên cứu không chứa caroten.
Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng được tóm tắt ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng (Hovenia dulcis) TT Tên nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận sơ bộ Hiện tượng Đánh giá 1
Chất béo Dấu hiệu vết mờ trên giấy lọc
Có vết mờ trên giấy
lọc + Có
Carotenoid H2SO4 đậm đặc Dd không đổi màu - Không
Sterol Libermann- bourchardt Không có vòng tròn tím đỏ giữa mặt phân cách 2 chất lỏng ++ Có 2 Flavonoid
Cyanidin Dd có màu đỏ cam +++
Có NaOH hoặc
NH4OH đặc
Dd có màu cam đậm
+++ FeCl3 5% Dd màu xanh nâu +++ Diazo hóa Xuất hiện tủa đỏ gạch +
3 Coumarin Mở, đóng vòng lacton Phản ứng âm tính - Không Diazo hóa Xuất hiện tủa đỏ gạch -
Phát huỳnh quang (chuyển dạng đồng phân cis-tran) Cả hai phần (bị che và không bị che) có huỳnh quang như