[ Báo cáo khoa học ] Nghiên cứu thành phần hoá học, tác dụng dược lý và độc tính của quả nhàu việt nam

Báo cáo đề tài nghiên cứu cấp bộ Tổng quan tình hình nghiên cứu về cây nhàu trên thế giới và ở trong nước. Giới thiệu kết quả nghiên cứu thành phần hoá học của quả nhàu, nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cao quả nhàu. Trình bày một số tác dụng dược lý của cao quả nhàu trên thực nghiệm

Bộ Y Tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu thành phần hoá học, tác dụng d−ợc lý

và độc tính của quả nhàu Việt nam

Bộ Y Tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu thành phần hoá học, tác dụng dược lý

và độc tính của quả nhàu Việt nam

Chủ nhiệm đề tài:

TS Nguyễn Trọng Thông

Cơ quan chủ trì đề tài:

Trường Đại học Y Hà Nội

Cấp quản lý đề tài:

C¸c ch÷ viÕt t¾t

BCMTT : B¹ch cÇu mói trung tÝnh

CQN : Cao qu¶ nhµu

NMR : Nuclear magnetic resonance

SKLM : S¾c ký líp máng

TBTHHMC : TÕ bµo t¹o hoa hång mÉn c¶m

TBTQDH : TÕ bµo t¹o quÇng dung huyÕt

TCVN : Tiªu chuÈn ViÖt Nam

UV : Untraviolet spectroscopy

A Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài

1 Kết quả nổi bật của đề tài

1.1 Đóng góp mới của đề tài

Từ kết quả nghiên cứu thành phần hoá học và nghiên cứu độc tính, tác dụng dược lý cho thấy quả nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch, chống viêm, giảm

đau, hạ huyết áp, không có độc tính cấp và bán trường diễn Kết quả này khẳng

định tác dụng của quả nhàu đã được nhân dân ta sử dụng để điều trị đau xương khớp, cao huyết áp, bồi dưỡng sức khoẻ và cũng đã khẳng định không chỉ rễ nhàu có tác dụng kích thích miễn dịch, chống viêm, giảm đau, hạ huyết áp mà quả nhàu cũng có tác dụng kích thích miễn dịch, chống viêm, giảm đau và hạ huyết áp

Với kết quả này hy vọng quả nhàu được bào chế thành dạng thuốc phù hợp

để đưa vào sử dụng trên lâm sàng phục vụ cho công tác chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân

1.2 Kết quả cụ thể (các sản phẩm cụ thể của đề tài)

Chiết xuất bằng các dung môi khác nhau và thông qua sắc ký lớp mỏng và phương pháp phổ IR, UV, MS, DEPT, COSY, HMQ cho thấy:

Trong quả nhàu có anthraglycosid, flavonoid, coumarin, triterpennoid, saponin, polyphenol, dầu béo, alkaloid, tinh dầu, acid hữu cơ, đường khử, acid uronic

Anthraquinon trong quả non 0,56%, quả già 0,55% và trong quả chín 0,39

% Đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất: soranjidiol, 1- methoxy 2-methyl hydroxyanthraquinon, scopoletin là coumarin không màu hình kim, 11 acid béo trong đó acid béo chưa no chiếm 68,85 %(acid linoleic 50,27%, acid oleic 17,79

3-% còn lại là acid linolenic và palmitoleic).Trong quả nhàu còn có 1 alcol acid no

11 carbon với một chức rượu bậc nhất nhưng chúng tôi chưa xác định chính xác

được cấu trúc

Trong một gam cao quả nhàu chứa 0,0025 mmol natri; 0,00125 mmol kali; 0,00313 mmol calci; 0,00004 mmol clo; 0,081- 0,098 ppm selen; 1.07- 1,45 ppm Co; 3,02- 4,94 ppm Cu; 35,8-154 ppm Mn; 206-283 ppm Fe

Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu quả nhàu: miếng mỏng khô, hơi cứng, màu nâu sẫm, mùi đặc biệt, vị hơi đắng, độ ẩm không quá 10%, tro toàn phần không quá 6 %, tro không tan trong acid HCL không quá 0,5%, định tính cho phản ứng dương của anthranoid, trên sắc ký lớp mỏng có 2 vết màu đỏ sáng và 1 vết màu đỏ đậm anthraquinon, hàm lượng anthraquinon toàn phần không thấp hơn 0,5%

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao quả nhàu: thể chất mềm, đồng nhất, màu nâu sẫm, mùi đặc biệt quả nhàu, vị hơi đắng, độ ẩm không quá 20%, cắn không tan không quá 15 %, pH 3,5 – 5,5, tro toàn phần không quá 20%, tro không tan trong acid HCL không quá 2%, định tính cho phản ứng dương của anthranoid, trên sắc ký lớp mỏng có 2 vết màu đỏ sáng và 1 vết màu đỏ đậm anthraquinon, hàm lượng anthraquinon toàn phần không thấp hơn 1%

Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của cao quả nhàu: kết quả cho thấy cao quả nhàu uống với liều 300 g/kg thể trọng cao gấp 375 lần liều dùng cho người không gây chết chuột trong vòng 72 giờ và không có biểu hiện độc tính của thuốc trong vòng 7 ngày theo dõi Trên thỏ uống cao quả nhàu liên tục trong 30 ngày với liều 6g/kg và 12g/kg thể trọng cao gấp 10 và 20 lần liều dùng cho người không thấy có sự thay đổi tình trạng chung, thểtrọng, số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, kích thước hồng cầu, số lượng hemoglobin, công thức bạch cầu, hematocrit, hoạt độ ALT, AST, hàm lượng albumin, cholesterol, bilirubin, creatinin máu cũng như hình thái đại thể, và vi thể gan, thận

Trên 2 mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid và tia xạ cao quả nhàu liều 6g/kg thể trọng uống liên tục 5 ngày liền và 9 ngày liền đã làm cải thiện rõ rệt các chỉ số đánh giá chức năng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cũng như các chỉ số đánh giá tình trạng chung miễn dịch như: trọng lượng lách và tuyến ức tương đối và số lượng bạch cầu

Cao quả nhàu có tác dụng giảm đau ở liều 24g/Kg trên mô hình gây quặn

đau bằng acid acetic, tác dụng tương đương với aspirin 100 mg/Kg thể trọng Cao quả nhàu có tác dụng chống viêm cấp, mạn tính và chống oxyhóa: sau

nên, giảm thể tích dịch và số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm và giảm trọng lượng u hạt Tác dụng này tương đương với aspirin liều150 mg/kg Trên mô hình gây tổn thương tế bào làm tăng gốc tự do bằng tia xạ cao quả nhàu uống liều 5g

và 25g/kg thể trọng liên tục 9 ngày làm giảm rõ rệt hàm lượng MDA, tăng hoạt

độ các enzym chống oxyhoá SOD, GPx, GR và khả năng chống oxyhoá toàn phần của cơ thể (TAS)

Cao quả nhàu có tác dụng hạ huyết áp Với liều 1,5 g/kg thể trọng, cao quả nhàu làm hạ huyết áp chó 20- 26 % so với huyết áp ban đầu Tác dụng này phụ thuộc liều lượng, liều càng cao tác dụng hạ huyết áp càng mạnh Tác dụng hạ huyết áp xuất hiện sau khi uống 30 phút và kéo dài hơn 5 giờ

2 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương đã được duyệt

2.1 Tiến độ

Theo đề cương được duyệt đề tài được thực hiện trong vòng 24 tháng kể từ ngày24 tháng 4 năm 2002 đến ngày 24 tháng 4 năm 2004 Nhưng do vì đúng vào thời kỳ dịch viêm đường hô hấp cấp do vius bùng nổ việc chăn nuôi súc vật gặp khó khăn nên Bộ Y tế đã cho phép gia hạn thực hiện đề tài đến hết 2005

2.2 Thực hiện mục tiêu nghiên cứu

Chúng tôi đã hoàn thành đầy đủ các nội dung nghiên cứu theo mục tiêu trong đề cương đã được hội đồng duyệt:

Đã nghiên cứu phương pháp chiết xuất, thành phần hoá học trong cao quả nhàu

Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu và cao quả nhàu

Đã nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm cấp, mạn tính

Đã nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá ở mô hình gây tổn thương bằng tia xạ trên thỏ

Đã nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch trên hai mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng tia xạ và cyclophosphamid trên chuột nhắt trắng

Đã nghiên cứu tác dụng trên tim và huyết áp ở chó, trên cơ trơn thành mạch của tai thỏ cô lập và trên tim ếch cô lập

Đã nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt và bán trường diễn trên thỏ

2.3 Kết quả đào tạo

Kết hợp thực hiện nội dung nghiên cứu với đào tạo đề tài đã góp phần cho

sự đào tạo thành công 02 cao học (một ngành Y, 01 ngành D−ợc), 01 bác sỹ, 02 d−ợc sỹ đại học và 1 sinh viên Y6 chuẩn bị bảo vệ, 1 sinh viên đạt giải nhì Vifotec

Kết quả của đề tài đã đ−ợc đăng tải trong 9 bài báo ở tạp chí D−ợc học, tạp chí nghiên cứu Y học Đại học Y Hà Nội và tạp chí D−ợc liệu

2.4 Đánh giá về sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí đ−ợc duyệt: 150 triệu

- Kinh phí đ−ợc cấp: 130 triệu

- Kinh phí đ−ợc quyết toán: 130 triệu

Nhìn chung kinh phí ít so với nội dung đã thực hiên, các tác giả phải sử dụng thêm các nguồn kinh phí từ các đề tài khác

B Nội dung báo cáo kết quả đề tài

1 Đặt vấn đề

Cây nhàu (Morinda citrifolia L Rubiaceae), một trong những dược liệu

được nhân dân sử dụng lâu đời với mục đích nâng cao sức đề kháng của cơ thể,

rễ nhàu chữa bệnh tăng huyết áp, chống viêm [4, 37] Năm 1981, dịch chiết toàn phần rễ cây nhàu dạng sao và chưa sao đã được Đào Văn Phan và Nguyễn Trọng Thông nghiên cứu thấy có tác dụng giảm đau, chống viêm và hạ huyết áp trên súc vật thực nghiệm [49] Năm 1996, Phan Thị Phi Phi và cộng sự nghiên cứu trên invitro, invivo chứng minh là có tác dụng kích thích miễn dịch thông qua tác dụng kích thích hồi phục các chỉ số miễn dịch ở súc vật thực nghiệm, các

tế bào người nuôi cấy in vitro bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia gamma và tiêm cyclophosphamid Trần Ngọc Dung và cộng sự (2000) dùng viên M, chế phẩm từ dịch chiết rễ nhàu có tác dụng tốt cho bệnh nhân ung thư vòm họng sau xạ trị

Cây nhàu là cây lưu niên, thời gian trồng để cho thu hoạch rễ là sau 6-8 năm Như vậy muốn phát triển và nhân rộng nguồn dược liệu từ rễ nhàu làm thuốc sẽ gặp nhiều khó khăn về nguyên liệu vì trồng cây nhàu để khai thác rễ đòi hỏi phải cần nhiều năm.Trong khi đó kinh nghiệm dân gian không chỉ dùng rễ nhàu làm thuốc mà còn dùng quả nhàu làm thuốc bổ nâng cao sức đề kháng của cơ thể Đặc biệt gần đây nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu về quả nhàu trồng ở Hawaii và đưa ra nhiều nhận xét khả quan về tác dụng chống khối u

và tác dụng kích thích miễn dịch [61, 62, 70, 71, 72, 81, 82, 83, 84, 97, 105, 107] Tuy vậy, ở Việt Nam nghiên cứu khoa học chủ yếu tập trung vào rễ nhàu như về tác dụng dược lý, thành phần hoá học, độc tính của rễ nhàu [18, 25, 27,

35, 43, 45, 46, 49, 56, 57, 58] Trong khi đó nhân dân dùng rất nhiều các sản phẩm từ quả nhàu và thậm chí có xí nghiệp đã sản xuất thuốc từ quả nhàu nhưng chưa có tác giả nào nghiên cứu một cách tương đối toàn diện về quả nhàu Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với mong muốn xác

định tính khoa học các tác dụng và độc tính của quả nhàu Việt Nam đã được dân gian sử dụng với các mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Nghiên cứu thành phần hoá học của quả nhàu

2 Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cao quả nhàu

3 Nghiên cứu một số tác dụng dược lý của cao quả nhàu trên thực nghiệm

Chương 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Tổng quan về cây Nhàu

1.1.1 Đặc điểm nhận dạng

Cây nhàu còn gọi là cây ngao núi, nhầu núi, cây giầu, tên khoa học là

Morinda citrifolia L., họ cà phê Rubiaceae [4, 37, 51] Đây là cây lưu niên, mọc

tự nhiên ở những nơi ẩm thấp dọc bờ sông bờ suối ở Việt Nam cây mọc chủ yếu

ở miền Nam từ Quảng Bình trở vào, không thấy mọc tự nhiên ở miền Bắc Trên thế giới cây nhàu thấy có ở nhiều nước như Thái Lan, ấn Độ, Malaixia đặc biệt

được trồng rất nhiều ở quần đảo Tahiti thuộc các nước vùng Trung Mỹ [61, 62, 105]

Cây nhàu là cây thân mộc, cao từ 6-8 m, có nhiều cành to, lá mọc đối xứng nhau hình bầu dục, đỉnh lá nhọn, mép lá có răng cưa, phiến lá mỏng và dai,

có 6-7 gân lá, cuống dài 10-12mm Hoa nhàu hình ống loa kèn, màu trắng mọc thành chùm ở nách lá, nở vào tháng 12 Quả hình trứng, dài 4-5cm, mọc thành chùm, lúc còn non có mầu xanh, sau chín có mầu trắng hồng hoặc vàng, quả chín vào tháng 7-8

ảnh 2: Quả nhàu

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

* Nghiên cứu về rễ: cây nhàu được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm

Youngken (1957) đã xác định thành phần hoá học chính trong rễ nhàu là anthraglycosid, ngoài ra còn có alcaloid, flavonoid và một số thành phần khác [120]

Younos và cộng sự (1990) nghiên cứu chứng minh dịch chiết rễ cây nhàu

có tác dụng giảm đau, thông qua hệ thống thần kinh trung ương [121]

* Nghiên cứu về trái: bắt đầu từ những năm 1990, ở Mỹ nhiều công trình

nghiên cứu về cây nhàu đã được công bố, đặc biệt các công trình này tập trung nhiều về thành phần hoá học và tác dụng của trái cây nhàu trồng ở Hawaii

Theo Hirazumi và cộng sự (1994 - 1999) cho thấy dịch chiết quả nhàu có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm [80, 81, 82, 83, 84]

Mới đây, dịch chiết quả nhàu đã được nghiên cứu ở Mỹ tại Trường Đại học Stanford, California, Los Angeles và Trường Đại học Hawaii; ở Anh tại Trường Y Lon don; ở Pháp tại Trường Đại học Meets Nói chung, các kết quả thu được là phù hợp với nhau và đều kết luận là dịch chiết quả nhàu có tác dụng làm hạ huyết áp Các nhà nghiên cứu ở Hawaii lần đầu tiên đã chiết ra trong dịch

chiết chất scopoletin Chất này làm giãn những mạch máu bị co thắt, làm cho tim

không phải làm việc quá tải khi bơm máu vào hệ tuần hoàn, như vậy làm cho

huyết áp trở về bình thường [105, 115]

Dịch chiết quả nhàu được nghiên cứu làm thuốc chống ung thư, nhiều

công trình nghiên cứu quan trọng về tác dụng này của quả nhàu đã được trình

bày tại các Hội nghị thường niên của Hội Ung thư Mỹ lần thứ 83, 84, 85 Theo

các nhà nghiên cứu ở khoa Y John Burns Trường Đại học Hawaii cho thấy tác

dụng chống ung thư trên chuột nhắt cấy truyền ung thư ổ bụng thể hiện là thời

gian sống sót tăng 105 - 123% so với lô chuột chứng không ăn quả nhàu.Một hợp

chất mới được chiết trong dịch quả nhàu đã được công bố gọi là damnacanthal Chất

này có tác dụng chuyển hoá các tế bào tiền ung thư nuôi cấy invitro thành tế bào

bình thường [89, 106, 113] Sau đó Tomouri Hiramatsu và cộng sự đã công bố

trên tạp chí Cancer Letters một công trình khẳng định là damnacanthal trong quả

nhàu có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào tiền ung thư [79]

Theo Yudah Folkman ở Trường đại học Harvard thì dịch chiết quả nhàu

có tác dụng làm giảm lượng máu tới khối u giống như chất squalamin trong dầu

gan cá mập thông qua ức chế sự tạo tân mạch làm ngăn cản sự phát triển khối u

[105, 114, 115]

Dịch chiết quả nhàu còn được dùng trong các bệnh khác như làm giảm sự

tiết dịch của niêm mạc: viêm xoang, viêm phế quản, hen, hạ thấp sự tiết acid ở

dạ dày: loét dạ dày, tá tràng, trào ngược dịch dạ dày, các bệnh tự miễn: viêm

khớp dạng thấp, bệnh vẩy nến, bệnh tiểu đường týp 2, viêm tuyến giáp, bệnh

Crohn, bệnh luput ban đỏ, bệnh nhiễm khuẩn, nấm: Ecpet typ 1 và 2, viêm gan

mạn tính Sở dĩ dịch chiết quả nhàu có nhiều tác dụng như vậy vì trong dịch trái

có chất xeronin, một chất đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và hoạt động

của tất cả các tế bào trong cơ thể [105, 115]

Theo một số tác giả trên thế giới, trong quả nhàu có soranjidiol, 1- methoxy- 2 methyl- 3 anthraquinon; 1-oxy-2,3- dimethoxy anthraquinon;

2,6- dioxy-octanoyl (-β- d- glucopyranosyl); rutin, acid asperulosid; 7- sterol

còn có 32 yếu tố vi lượng trong đó có selen trong cùi quả và hạt <0,00014% [91,

92, 97, 100, 107, 112, 113]

*Nghiên cứu về lá: gần đây có một số công trình nghiên cứu về thành

phần hoá học và tác dụng dược lý của lá cây Theo Sang S và cộng sự (2001) trong lá nhàu có nhiều iridoid glycosid, chất này có tác dụng ức chế AP-1- một protein có hoạt tính quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh ung thư [101,

102, 103]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cây nhàu được quan tâm nghiên cứu từ những năm cuối thập niên 60 Các công trình nghiên cứu tập trung vào rễ cây

- Tác dụng trên huyết áp:

Đặng Vân Hồ ở Viện Bài Lao - Ngô Quyền (Sài Gòn cũ) là người đầu tiên quan tâm nghiên cứu rễ nhàu điều trị bệnh cao huyết áp Sau này Đặng Hồng Vân, Nguyễn Tường Vân, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1981) đã chứng minh dịch chiết rễ nhàu có tác dụng an thần, hạ huyết áp, giảm đau Cơ chế hạ huyết áp mạnh và kéo dài của cao rượu rễ nhàu được chứng minh là do hủy adrenalin, phong toả thần kinh thực vật và giãn mạch ngoại vi [49]

Dùng dịch chiết rễ nhàu cho các bệnh nhân cao huyết áp, Phạm Khuê và cộng sự đã chứng minh tác dụng hạ huyết áp rõ rệt ở người cao tuổi, hạ nhiều nhất từ 30-50 mmHg [35]

- Tác dụng trên miễn dịch:

Phan Thị Phi Phi, Phạm Huy Quyến và cộng sự (1996) đã xác định tác dụng KTMD của dịch chiết rễ cây nhàu toàn phần trên chuột nhắt và trên invitro Trần Ngọc Dung và cộng sự (2000) đã nghiên cứu ứng dụng về tác dụng KTMD của viên M chế từ dịch chiết cây nhàu để điều trị hỗ trợ cho bệnh nhân ung thư vòm họng sau xạ trị.Kết quả cho thấy viên M có tác dụng phục hồi số lượng các

tế bào miễn dịch và kéo dài đời sống của các bệnh nhân này so với đối chứng [18, 45, 46]

Đỗ Quốc Việt (2000) chứng minh damnacanthal có trong dịch chiết rễ nhàu có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm [57]

- Tác dụng giảm đau, chống viêm:

Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1981) đã chứng minh cao lỏng rễ nhàu có tác dụng giảm đau trên thực nghiệm [49] Trần Ngọc Ân và cộng sự đã ứng dụng điều trị cho những bệnh nhân mới bị viêm khớp thấy có tác dụng tốt, tuy nhiên đối với bệnh nhân ở giai đoạn II của bệnh, tác dụng của thuốc còn chưa mạnh

- Tác dụng hạ đường huyết:

Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hoà và CS (2002) thử tác dụng trên đường huyết của rễ nhàu liều 200mg, 300mg đường tiêm màng bụng và liều 1g, 1,5g

đường uống không làm hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng bình thường Tuy nhiên, trên chuột gây tăng đường huyết thấy thuốc có tác dụng làm hạ mức

đường huyết

- Nghiên cứu về thành phần hoá học

Theo Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thu Hằng [25], trong rễ nhàu chứa: anthraglycosid 0,35%-1,54%; ngoài ra trong thành phần của rễ nhàu còn chứa flavonoid, tanin Theo Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông và cộng sự, trong rễ nhàu có chứa selen [49]

Đỗ Thị Nguyệt Quế (1997) đã nghiên cứu thành phần hoá học trong thân cây nhàu, ứng dụng qui hoạch thực nghiệm chiết xuất tối ưu hoạt chất trong thân

và rễ để bào chế viên M chứa dịch chiết toàn phần thân và rễ cây nhàu [43]

Đỗ Quốc Việt và cộng sự (2000) đã phân lập và xác định cấu trúc hai

anthraglycosid là damnacanthal và nordamnacanthal từ thân cây nhàu [57]

-Nghiên cứu về độc tính:

Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1981) nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cao rượu rễ nhàu cho thấy với liều 0,2-8 g dược liệu khô/kg cân nặng chưa thấy có biểu hiện độc tính trên chuột và thỏ [49]

Theo nghiên cứu của Viện Dược liệu cho thấy với liều 300g/ ngày cao gấp

1000 lần liều dùng cho người dịch chiết rễ nhàu không gây độc tính cấp trên chuột Theo Đàm Trung Bảo, Phó Đức Thuần, LD50 trên chuột nhắt trắng theo

đường uống của dịch chiết rễ nhàu là 181,47g/kg cân nặng và với liều 0,5 ml dịch chiết 5%/kg dùng liên tục 30 ngày không có dấu hiệu độc [trích từ 45]

Về độc tính trên bộ máy di truyền, theo Trần Thanh Hương và cộng sự (1995) thấy dịch chiết rễ nhàu không thấy làm rối loạn số lượng, cấu trúc nhiễm

sắc thể ở liều điều trị và liều gấp 20 lần liều điều trị [27]

- Nghiên cứu về sản xuất:

Sau khi các công trình nghiên cứu khoa học về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của rễ nhàu được công bố, các xí nghiệp dược phẩm trong nước đã sản xuất các chế phẩm chứa dịch chiết rễ nhàu toàn phần dùng trong các bệnh tăng huyết áp, suy giảm miễn dịch sau xạ trị, bồi bổ sức khoẻ Trường Đại học Dược Hà Nội bào chế thuốc dạng viên nang 0,25g và viên bọc đường 0,15g đặt tên là M (viết tắt của chữ Morinda) Dự án KC 04 DA 04 giữa trường Đại học Y

Hà Nội và xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 sản xuất viên nang 0,5g chứa dịch chiết cây nhàu toàn phần đặt tên là Uphamorin, đặc biệt xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 sản xuất sản phẩm quả nhàu ngâm rượu đóng chai 750ml,

trà quả nhàu hoà tan gói 5g và 10g

được tiến hành tại Công ty Nacatifoods Cao quả nhàu toàn phần tỷ lệ 1:5, khi sử dụng được pha loãng bằng nước đến tỷ lệ thích hợp cho từng nghiên cứu

Trong nghiên cứu xác định thành phần tinh dầu chúng tôi dùng quả nhàu chín để chiết xuất

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng, cả hai giống, tuổi 6 tuần, nặng 20 ± 2 gam do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

- Chuột cống trắng cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 150-180g

- Thỏ chủng Orytolagus Cuniculus, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng

2 -2,5 kg do Trung tâm nghiên cứu dê và thỏ Sơn Tây cung cấp

- ếch cả hai giống khoẻ mạnh, cân nặng 100-120g

- Chó, cả 2 giống khoẻ mạnh, cân nặng 8-12kg

Súc vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lý, Trường đại học Y Hà Nội từ 3- 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu

2.2 Dụng cụ, hoá chất nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu hoá học

- Dung môi, hoá chất cần thiết cho nghiên cứu: ethanol dùng để chiết xuất,

Trung Quốc, loại PA; methanol, Prolabo, loại dùng cho HPLC; chloroform, Singapore, loại công nghiệp; chloroform, Trung Quốc; aceton, Singapore, loại công nghiệp; ethylacetat, Trung Quốc, loại PA; benzen, Trung Quốc, natri hydroxid, Trung Quốc

Các dung môi loại công nghiệp đều được chưng cất lại ở nhiệt độ thích hợp trước khi dùng

- Dụng cụ, thiết bị:

Kính hiển vi Olympus; tủ sấy Gallen Kamp; máy cô chân không (Rotavapor R - 3000 - Bchi); tủ sấy chân không SHELLAB (Mỹ); cân phân tích: Libror AEL - 40SM (Shimadzu, Japan); bản nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F 254 (20 x 20cm), (Merck, Art 5554)

Máy siêu âm Sonorex (Brandson) của Pháp

Máy cô quay Biichi chân không, đèn tử ngoại Camag ở bước sóng 254

Các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

2.2.2 Nghiên cứu về độc tính và tác dụng dược lý

- Hoá chất và máy huyết học tự động ABC (Animal Blood Counter) của hãng Ugo- Basile, Italy

- Hoá chất và máy xét nghiệm sinh hoá máu tự động Screenmaster của hãng Hospitex Diagnostic, Italy

* Nghiên cứu tác dụng chống viêm, giảm đau

- Aspegic gói 500mg (hãng Laboratoires Synthelabo)

- Hoá chất đủ tiêu chuẩn thí nghiệm: carrageenin, amiant, formaldehyd, natri clorid, acid acetic

- Phù kế Plethysmometer No 7280, Mâm nóng (hot plate) của hãng Ugo - Basile (Italy)

* Nghiên cứu tác dụng chống oxyhoá:

- Belaf: dạng viên nang mềm của Hàn Quốc, mỗi viên chứa selen 50mg, vitamin A 5000UI, vitamin C 500 mg, vitamin E 400 UI

- Hoá chất: acid thiobarbituric, KCl, heparin của Hãng Merck- Đức

Các kít định lượng SOD (superoxid dismutase), GPx (glutathion peroxidase), GR (glutathion reductase), TAS (total antioxidant status) của hãng Randox

* Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch:

- Nhũ dịch OA (Ovalbumin + Al(OH)3): dùng làm kháng nguyên gây mẫn cảm cho chuột

- Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin): nồng độ 1%, dùng làm kháng nguyên đối chứng để kiểm tra mức độ của phản ứng quá mẫn chậm của chuột với kháng nguyên OA đã mẫn cảm

- Hồng cầu cừu (HCC): máu tĩnh mạch cừu được lấy trong điều kiện vô trùng, bảo quản trong dung dịch Alsever (glucose 24,6g, natricitrat 9,6g, natriclorid 5,05g, nước cất vừa đủ 1200 ml, pH 6,1), ở nhiệt độ 40C, sử dụng trong thời hạn 2 tuần

- Cyclophosphamid: dạng thuốc bột, biệt dược Endoxan lọ 200 mg, lô sản xuất 2A510 của hãng ASTA Medica, Đức

- Levamisol dạng bột trắng, hàm lượng 98,6% do phòng Hoá lý I, Viện Kiểm nghiệm Trung ương, Bộ Y tế cung cấp

- Kính hiển vi quang học Olympus CH 20, Nhật

- Máy chiếu tia gamma: máy Chicobalt - Picker của Tiệp khắc, sử dụng nguồn cobalt 60

* Nghiên cứu tác dụng trên huyết áp, tim mạch:

- Các hoá chất: adrenalin, nicotin, acetylcholin của xí nghiệp Dược phẩm

- HA kế thuỷ ngân Ludwig

- Buồng nuôi cơ quan cô lập của hãng Ugo- Basile, Italy

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu thành phần hoá học

2.3.1.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ: Bột quả nhàu được chiết xuất theo

quy trình sau thu được các dịch chiết cho phản ứng với các thuốc thử đặc hiệu

theo phương pháp của trường Đại học Dược khoa Rumani để tìm các nhóm hoạt

chất

Bột dược liệu

Ether Lọc KOH10%

Bã Dịch A Cồn 90º

Lọc HCl H2O

Lọc H2SO4 Dịch B Cặn A1 Dịch A 2

Bã B1 B2 B3 B4 B5

Nước

HCL 10% Đun nóng, lọc Bã + Dịch C Thử với thuốc thử đặc hiệu

Bỏ đi

2.3.1.2 Khảo sát hợp chất Antharaquinon

a/ Định tính: trên bột dược liệu

* Soi kính hiển vi bột dược liệu : lấy một ít bột quả nhàu đã nghiền mịn

cho lên một lam kính Nhỏ một vài giọt NaOH 5% Soi kính hiển vi để quan sát

* Vi thăng hoa: lấy 2g bột dược liệu đã nghiền mịn cho vào chén sứ, nhỏ

một giọt H2SO4, trộn đều Đun cất cho bay hết hơi acid và nước Dùng một lam kính đậy lên chén sứ, mặt trên có bông gòn thấm nước và quan sát màu sắc của

mầu sắc lớp kiềm phía dưới

+ Bã dược liệu sau khi chiết hết dẫn chất quinon tự do bằng benzen, thêm

10 ml H2SO4 10% tiếp tục chiết với benzen bằng cách đun hồi lưu Dịch benzen

thêm 5 ml NaOH 10% lắc đều Để yên 5 phút, quan sát lớp kiềm ở phía dưới

- Phản ứng với Magnesi acetate

Lấy khoảng 10g bột dược liệu chiết với 50 ml cồn, dịch chiết cồn cô còn khoảng 5-6 ml Lấy khoảng 0,5 ml dịch lọc + 1 giọt magnesi acetate 1%, quan sát màu của dung dịch

• Sắc ký lớp mỏng

Dịch chấm sắc ký: anthraquinon hoà tan trong methanol

Bản mỏng: silicagel GF 254 tráng sẵn của Merck

Hệ dung môi: benzen- chloroform - acid acetic (9:1,5:0,5)

Phát hiện vết: soi đèn UV365nm và thuốc thử dung dịch NaOH 5% trong methanol

b/ Định lượng:

- Định lượng bằng phương pháp cân của có cải tiến:

Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu Đun cách thuỷ trong bình nón 250

ml trong 1 giờ với 100 ml benzen và 15 ml H2SO4 20%, lọc qua bông vào bình gạn, rữa bông với 5 ml benzen Thêm vào bã 50 ml benzen nữa và đem cách thuỷ sôi 30 phút, lọc chiết qua bông vào bình gạn nói trên Thêm vào bã 50 ml benzen

và tiếp tục như trên Thêm vào bình nón có bã dược liệu, hai lần, mỗi lần 20 ml benzen và lọc qua bông trên Sau đó, lắc dịch chiết benzene với 50 ml dung dịch amoniac trong 5 phút Sau khi để yên, tách lớp kiềm ở dưới, chiết lớp benzen còn lại bằng amoniac mỗi lần 30 ml đến khi lớp kiềm không mầu, tập trung các dịch nước kiềm và acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 10 % đến PH = 3 Dịch acid được lắc lại với benzen đến khi dịch benzen không mầu Dịch benzen được làm khan bằng Na2SO4 khan và bốc hơi hết benzen Sấy lúc đầu 600C sau 800C đến khi khối lượng không đổi

Hàm lượng anthraquinon có trong dược liệu: X (%) =

h m m

m

.

1 1

2

Trong đó:

m1: khối lượng dược liệu ban đầu (g)

m2: khối lượng cắn sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

h: độ ẩm của dược liệu (%)

Sau đó kiểm tra cắn định lượng bằng SKLM với

+ Điều kiện sắc ký như sau:

Chất hấp phụ: silicagel F245 sắc ký lớp mỏng tráng sẵn trên bảng nhôm (Merck)

Dịch chấm sắc ký: cắn định lượng dược liệu quả nhàu bằng phương pháp cân hoà trong benzen

Hệ dung môi: benzene- ethylacetat - acid formic (75: 25: 1)

Thuốc thử phát hiện: KOH 1% trong cồn và soi UV365 nm

• ChiÕt xuÊt vµ ph©n lËp c¸c hîp chÊt:

+ Ph−¬ng ph¸p 2:

Cao qu¶ nhµu 100g

Na2CO3 5%

Acid ho¸ = HCl 10%, pH3-4 Läc ch©n kh«ng lÊy tña

SKC

DM: Toluen-dichloromethan tû lÖ kh¸c nhau

Bèc h¬i dung m«i

* Nhận dạng các chất phân lập được:

Xác định cấu trúc và định danh các chất phân lập được từ quy trình chiết xuất, phân lập ở mục trên thông qua :

HPLC, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối

2.3.1.3 Nghiên cứu về tinh dầu

* Chiết xuất tinh dầu nhàu từ quả chín bằng phương pháp lôi cuốn từ hơi nước

* Xác định tính chất và một số hằng số vật lý của tinh dầu nhàu

đục trở lại thì xem là được và ghi lượng cồn đã dùng

+ Chỉ số khúc xạ

Đo bằng khúc xạ kế OPL No 119

* Định lượng tinh dầu:

Định lượng theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam III tập 3

trang 494

* Xác định thành phần hoá học trong tinh dầu:

Sử dụng sắc ký khí (skk) kết hợp với khối phổ để xác định thành phần hoá học của tinh dầu

Máy CTC/MIS GC 8000 series MD 800 Mode Fullscan FC43

Thời gian quét một scan 0,9 sec

Mass : 29 – 550 (đ.v.c)

2.3.1.4 Nghiên cứu chất béo

Xác định acid béo trong quả nhàu bằng phương pháp UV, HPLC, IR, NMR

2.3.1.5 Xác định một số nguyên tố vô cơ trong quả nhàu:

- Dùng phương pháp quang kế ngọn lửa để xác định ion Na, K, Ca , Clo

- Dùng phương pháp kích hoạt notron để xác định selen, Mn, Co, Fe

2.3.2 Nghiên cứu độc tính của cao quả nhàu

2.3.2.1 Nghiên cứu độc tính cấp [119]

Thử độc tính và xác định LD50 của cao quả nhàu trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp Litchfield - Wilcoxon Chuột nhắt trắng, nhịn đói 12 giờ,

được chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con, uống cao quả nhàu với liều tăng dần để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất gây chết 0% Chuột được theo dõi tình trạng chung trong suốt 7 ngày và tỷ lệ chết trong 72 giờ của từng lô sau khi uống thuốc

2.3.2.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn [119]

Thỏ thí nghiệm được chia thành 3 lô

- Lô chứng (n=10): uống dung môi là nước cất

- Lô trị 1 (n=10): uống cao quả nhàu liều 6g/kg trọng lượng thỏ, gấp 10 liều dùng trên người

- Lô trị 2 (n=10): uống cao quả nhàu liều 12g/kg trọng lượng thỏ, gấp 20 lần liều dùng trên người

Tất cả các thỏ được uống dung môi hoặc thuốc mỗi ngày một lần vào buổi sáng, với thể tích 3 ml/kg trọng lượng thỏ, liên tục trong 30 ngày

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:

* Tình trạng chung, thể trọng của thỏ

* Đánh giá chức phận tạo máu thông qua các chỉ số: số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu và hematocrit [32, 54, 55]

* Đánh giá chức năng gan mật thông qua định lượng một số enzym và một

số chất: AST (aspartat amino transferase), ALT (alanin amino transferase); bilirubin toàn phần, bilirubin trực tiếp, cholesterol và albumin [32, 59]

* Đánh giá chức năng thận bằng định lượng creatinin huyết thanh [32, 59]

* Cấu trúc đại thể và vi thể của gan và thận

Tất cả các xét nghiệm trên được đánh giá tại 3 thời điểm: trước uống thuốc, sau uống thuốc 15 ngày và 30 ngày Riêng về hình thái đại thể và các xét nghiệm về cấu trúc vi thể gan, thận được đánh giá tại 2 thời điểm: sau uống thuốc liên tục 30 ngày và sau khi ngừng uống thuốc hoàn toàn 30 ngày (đánh giá khả năng phục hồi)

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng dược lý của cao quả nhàu

2.3.3.1 Nghiên cứu về tác dụng chống viêm, giảm đau

* Gây phù chân chuột bằng carrageenin:

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 12 con

Lô 1 (chứng): uống NaCl 0,9%, 1,0ml/100g

Lô 2: uống aspirin 150 mg/kg

Lô 3: uống cao quả nhàu tương đương 12g dược liệu/kg

Lô 4: uống cao quả nhàu tương đương 24g dược liệu/kg

Chuột được uống thuốc 3 ngày liền trước khi gây viêm Ngày thứ 3, sau khi uống thuốc thử 1 giờ, gây viêm bằng cách tiêm carrageenin 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,05 ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột

Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt (phù kế Plethysmometer) vào các thời điểm: trước khi gây viêm và sau khi gây viêm 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 24 giờ

Kết quả được tính theo công thức của Fontaine

- Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:

∆V% =

0

0 tV

V

V ư

x 100

Trong đó: V0: thể tích chân chuột trước khi gây viêm

Vt: thể tích chân chuột sau khi gây viêm

- Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%)

I% =

%V

%V

%VC

t C

∆ : trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở lô uống thuốc (%)

* Gây viêm màng bụng chuột:

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 14 con Các lô chuột được uống NaCl 0,9% hoặc các thuốc thử với liều lượng và thời gian như trong thí nghiệm trên Gây viêm màng bụng chuột bằng dung dịch carrageenin 0,05g + formaldehyd 1,4 ml, pha vừa đủ trong 100ml nước muối sinh lý, với thể tích tiêm 2 ml vào khoang màng bụng mỗi chuột

Sau 24 giờ, mở ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm, đo thể tích và đếm số lượng bạch cầu/1ml dịch rỉ viêm Tác dụng chống viêm được đánh giá thông qua thể tích dịch rỉ viêm và số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm

* Gây u hạt thực nghiệm:

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên làm 4 lô, mỗi lô 10 con:

Lô 1 (lô chứng): uống NaCl 0.9%, 1,0ml/con

Lô 2: uống aspirin 150mg/kg

Lô 3: uống cao quả nhàu tương đương 12g dược liệu/kg

Lô 4: uống cao quả nhàu tương đương 24g dược liệu/kg

Gây u hạt thực nghiệm theo phương pháp của Ducrot, Julou và cộng sự trên chuột cống trắng Cấy sợi amiant đã được tiệt khuẩn và sấy khô vào dưới da chuột, sau đó cho chuột uống thuốc trong 5 ngày liền vào buổi sáng Đến ngày thứ 5, giết chuột, bóc tách khối u, đặt vào tủ sấy ở 560C trong 18 giờ Cân trọng lượng các khối u So sánh trọng lượng trung bình các khối u (đã trừ khối lượng sơi amiant) của nhóm uống thuốc với nhóm chứng Tác dụng chống viêm được

đánh giá thông qua tỉ lệ % giảm trọng lượng khối u

* Phương pháp gây quặn đau bằng acid acetic (phương pháp Koster)

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên làm 5 lô, mỗi lô 10 con

Lô 1 (lô chứng): uống NaCl 0,9%

Lô 2: uống aspirin 100 mg/kg

Lô 3: uống cao quả nhàu tương đương 6 g dược liệu/kg

Lô 4: uống cao quả nhàu tương đương 12 g dược liệu/kg

Lô 5: uống cao quả nhàu tương đương 24 g dược liệu/kg

Cho chuột uống thuốc thử 3 ngày liền Đến ngày thứ 3, sau khi cho chuột uống thuốc được 1 giờ, tiêm vào ổ bụng chuột acid acetic 1%, 0.2ml/con Đếm

số cơn quặn đau của chuột trong từng 5 phút một cho đến phút thứ 25

* Phương pháp “mâm nóng” (hot plate)

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên làm 5 lô, mỗi lô 10 con

Lô 1 (lô chứng): uống NaCl 0,9%

Lô 2: uống aspirin 100 mg/kg

Lô 3: uống cao quả nhàu tương đương 6 g dược liệu/kg

Lô 4: uống cao quả nhàu tương đương 12 g dược liệu/kg

Lô 5: uống cao quả nhàu tương đương 24 g dược liệu/kg

Thí nghiệm được tiến hành tại hai thời điểm: trước khi cho chuột uống thuốc và sau khi uống thuốc thử Đặt chuột lên một miếng kim loại luôn được duy trì ở 560c bằng bình ổn nhiệt.Tính thời gian từ lúc đặt chuột lên “mâm nóng” đến khi chuột có phản xạ liếm bàn chân sau Loại bỏ những chuột phản ứng trước 8 giây và sau 30 giây

2.3.3.2 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa

Thỏ được chia thành các lô, mỗi lô 7 con

Lô 1: thỏ không bị tác động gì

Lô 2, 3, 4, 5 được chiếu tia gamma ở liều duy nhất 5 Gy Sau khi bị chiếu xạ, hàng ngày thỏ được dùng thêm các thuốc sau:

- Lô 2: thỏ được uống nước cất

- Lô 3: thỏ được uống Belaf liều 0,1viên/kg (tương đương liều dùng cho người), liên tục trong 9 ngày

- Lô 4: thỏ được uống cao quả nhàu liều 5g dược liệu/kg, liên tục 9 ngày

- Lô 5: thỏ được uống cao quả nhàu liều 25g dược liệu/kg, liên tục 9 ngày Lấy máu tim thỏ ở các thời điểm trước chiếu xạ, sau chiếu xạ và uống thuốc 5 ngày và 9 ngày để định lượng các chỉ số huyết học, glucose máu, SOD,

GPx, GR, TAS và MDA

2.3.3.3 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch

Thí nghiệm được tiến hành trên hai mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng hoá chất và tia xạ

* Mô hình suy giảm miễn dịch bằng hoá chất trên chuột nhắt:

Tiêm màng bụng cyclophosphamid (CY), liều duy nhất 200mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch

Chuột thí nghiệm được chia thành 4 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1 (chứng sinh học): chuột không bị tác động gì

- Lô 2 (tiêm CY): chuột được tiêm CY, không điều trị

- Lô 3 (tiêm CY +levamisol): chuột được tiêm CY, được uống levamisol liều 100mg/kg

- Lô 4 (tiêm CY + nhàu): chuột được tiêm CY, được uống cao quả nhàu liều 6g dược liệu/kg

Sau khi tiêm cyclophosphamid, vào ngày thứ 2 các lô chuột được uống nước cất và các thuốc liên tục trong 5 ngày

• Mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng tia xạ trên chuột nhắt:

Dùng tia gamma, tia bức xạ điện từ chiếu toàn thân cho chuột để gây suy giảm miễn dịch Suất liều 100 rad/ ngày, liên tục trong 6 ngày, tổng liều xạ cho cả đợt là 600 rad (6 grey)

Chuột thí nghiệm đ−ợc chia thành 4 lô:

- Lô 1 (chứng sinh học): chuột không bị tác động gì (n = 10)

- Lô 2 (tia xạ): chuột bị chiếu tia xạ, không điều trị (n = 10)

- Lô 3 (tia xạ + levamisol): chuột bị chiếu tia xạ, đ−ợc uống levamisol liều 100mg/kg thể trọng (n = 10)

- Lô 4 (tia xạ + nhàu): chuột bị chiếu tia xạ, đ−ợc uống cao quả nhàu liều 6g d−ợc liệu/kg thể trọng (n = 15)

Ngày N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 - xét nghiệm

Lô 1: Chứng sinh học

Lô 2: Tiêm CY

Lô 3: Tiêm CY + levamisol

Lô 4: Tiêm CY + nhàu

Thêi gian uèng n−íc cÊt hoÆc c¸c thuèc liªn tôc trong 9 ngµy

L« 1: Chøng sinh häc

L« 2: Tia x¹

L« 3: Tia x¹ + levamisol

PH MC

Sơ đồ nghiên cứu dùng thuốc cách 2

Trên cả hai mô hình nghiên cứu đều phải trải qua ba giai đoạn: ức chế miễn dịch, mẫn cảm kháng nguyên và điều trị thuốc thử

Ghi chú: uống nước cất

- Tiêm CY: gây suy giảm miễn dịch dịch thể nhiều hơn miễn dịch tế bào,

đặc biệt thuốc làm ức chế khả năng tiết kháng thể đặc hiệu của các tế bào lympho B mẫn cảm, liều duy nhất 200 mg/kg thể trọng chuột, tiêm màng bụng

+ Mẫn cảm kháng nguyên

- Kháng nguyên OA tiêm mũi duy nhất dọc sống lưng chuột liều 0,1 ml/chuột và HCC dung dịch 5%, tiêm màng bụng, thể tích duy nhất 0,5 ml/ chuột (nhóm chứng dương)

- Tiêm phát hiện: Kháng nguyên OA và dung dịch làm chứng BSA được tiêm vào hai gan bàn chân chuột với thể tích 0,05ml một ngày trước khi giết chuột làm xét nghiệm

+ Điều trị cao quả nhàu

Chuột ở các lô 3 trong cả hai mô hình gây suy giảm miễn dịch, được uống levamisol liều 100mg/kg thể trọng chuột

Chuột ở các lô 4 trong cả hai mô hình gây suy giảm miễn dịch, được uống cao quả nhàu liều 6g/ kg thể trọng chuột Tuy nhiên, thời điểm dùng thuốc trong mô hình tia xạ khác nhau so với thời điểm chiếu tia

Thời gian uống thuốc thử:

- 5 ngày với mô hình tiêm CY

- 9 ngày với mô hình chiếu tia gamma

Xét nghiệm chức năng miễn dịch:

Chuột ở tất cả các lô được đánh giá thông qua các chỉ số

+ Các chỉ số chung:

- Trọng lượng lách, tuyến ức tương đối: được tính là trọng lượng lách, tuyến ức tương ứng với thể trọng chuột

Trọng lượng lách hoặc tuyến ức Trọng lượng lách hoặc

tuyến ức tương đối = Thể trọng chuột

Lấy toàn bộ lách và tuyến ức và ngâm ngay vào dung dịch nuôi tế bào Lọc sạch các tổ chức xung quanh, dùng gạc thấm khô rồi đem cân Ghi lại trọng lượng lách, tuyến ức của từng chuột Trọng lượng lách, tuyến ức tương đối bằng

tỷ lệ trọng lượng các cơ quan này so với trọng lượng của từng chuột tương ứng

- Số lượng bạch cầu chung, bạch cầu hạt trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu mônô và bạch cầu NK ở máu ngoại vi

+ Các thông số đánh giá ĐƯMD dịch thể:

- Tỷ lệ tế bào lympho lách tạo hoa hồng mẫn cảm với HCC (TBTHHMC):

ủ các tế bào lympho lách đã được mẫn cảm với kháng nguyên là HCC từ trước với HCC ở điều kiện thích hợp, ở 40C qua đêm Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu các tế bào lympho đã được mẫn cảm có các kháng thể bề mặt đặc hiệu với HCC sẽ gắn với các HCC vào xung quanh nó tạo nên hình ảnh giống hoa hồng

Đếm số lượng tế bào lympho tạo hoa hồng với HCC trong tổng số 100 tế bào lympho lách dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10 x 40 Từ đó tính được tỷ lệ phần trăm TBTHHMC trong các lô chuột thí nghiệm

- Tỷ lệ tế bào lympho của lách tạo quầng dung huyết:

Xác định tỷ lệ tế bào lympho lách tiết kháng thể kháng HCC theo kỹ thuật của Cuinningham Trộn các lympho bào của lách chuột đã được mẫn cảm với kháng nguyên là HCC từ trước với HCC theo tỷ lệ thích hợp kèm theo sự có mặt của bổ thể trong một buồng đếm gắn kín Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu, các tế bào lympho B đã biệt hoá thành các tương bào sẽ tiết kháng thể hoà tan vào môi trường xung quanh và những kháng thể này sẽ kết hợp với các kháng nguyên là HCC Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ hoạt hoábổ thể làm tan các HCC xung quanh các tế bào B tiết kháng thể, tạo ra vòng trắng không có HCC ở xung quanh các tế bào này Đây gọi là tế bào tạo quầng dung huyết (TBTQDH) Đếm các tế bào lympho tạo quầng dung huyết trong tổng số 100 tế bào lympho lách dưới kính hiển vi độ phóng đại 10 x 40 Từ đó tính được tỷ lệ phần trăm TBTQDH ở các lô chuột thí nghiệm

+ Các thông số đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào:

Đánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua phản ứng quá mẫn chậm ở gan bàn chân chuột với kháng nguyên OA Trước khi đo kết quả phản ứng quá mẫn chậm với kháng nguyên OA, tiêm 50 àl kháng nguyên OA (liều phát hiện) vào một bên gan bàn chân chuột, bên còn lại tiêm thể tích tương tự dung dịch BSA Sau 24 giờ tiêm kháng nguyên phát hiện, đo bề dày hai gan bàn chân chuột bằng thước palmer Lấy hiệu số bề dày phản ứng quá mẫn chậm của

chuột với kháng nguyên OA và BSA được chỉ số phản ứng với kháng nguyên

OA

2.3.3.4 Nghiên cứu tác dụng tác dụng trên tim mạch của quả nhàu

* ảnh hưởng của cao lỏng quả nhàu trên tim và HA chó

Chó được gây mê đường tĩnh mạch bằng thiopental dung dịch 5% với liều 0,02g/kg thể trọng

Ghi HA động mạch đùi qua HA kế thuỷ ngân Ludwig Thuốc thử được

đưa theo đường uống với các liều khác nhau từ 1,5g/kg thể trọng đến liều 2,25g/kg thể trọng Theo dõi sự thay đổi HA và tần số tim 30 phút/lần từ sau khi uống thuốc liên, tục trong 6 giờ

* Các thí nghiệm phân tích vị trí tác dụng của cao lỏng quả nhàu trên tim mạch

- Nghiên cứu ảnh hưởng của cao lỏng quả nhàu trên hệ hậu hạch giao cảm

và trên hạch thần kinh thực vật

Chó được gây mê và ghi HA như thí nghiệm trên Sau đó cho chó uống thuốc với liều 1,5g/kg thể trọng và theo dõi ảnh hưởng của thuốc đến tác dụng của adrenalin (0,02mg/kg thể trọng), nicotin (0,08mg/kg thể trọng) và acetylcholin (0,02mg/kg thể trọng) trên HA

- Nghiên cứu ảnh hưởng của cao lỏng quả nhàu trên tim ếch cô lập

Tim ếch được cô lập theo phương pháp Straub Mỗi tim ếch được nuôi dưỡng bằng 2ml dung dịch ringer lactat, cho thuốc với nồng độ xác định Theo dõi tần số và biên độ của tim ếch trước, sau khi dùng thuốc thử và ảnh hưởng của dung dịch cao quả nhàu đến tác dụng của adrenalin

- Nghiên cứu ảnh hưởng của cao quả nhàu trên cơ trơn thành mạch

Tai thỏ được cô lập theo phương pháp Kravkov Truyền dung dịch ringer ở

độ cao 100cm vào động mạch giữa Theo dõi số giọt dung dịch chảy ra ở hai tĩnh mạch vành tai trong một phút lúc trước và sau khi dùng thuốc thử và sự ảnh hưởng của thuốc thử đến tác dụng của adrenalin

Chương 3 Kết quả nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu về hoá học

3.1.1 Kết quả về định tính các nhóm chất hữu cơ

STT Nhóm hợp chất Dịch chiết ether Dịch chiết cồn Dịch chiết nước

Kết quả cho thấy dung môi chiết xuất khác nhau sẽ thu được hợp chất

khác nhau Khi chiết xuất bằng dung môi ether tìm thấy trong quả nhàu có chất

béo, tinh dầu, triterpenoid, coumarin và flavonoid và với dung môi là cồn tìm

thấy triterpenoid, coumarin, flavonoid, plolyphenol, saponin, acid hữu cơ, và

polyuronic.Trong dịch chiết nước tìm thấy các hợp chất gần giống trong dịch

chiết cồn nhưng có điểm khác cơ bản là trong dịch chiết nước còn tìm thấy có

anthraglycosid với tỷ lệ khá cao (++)

3.1.2 Kết quả nghiên cứu về nhóm anthraglycosid

3.1.2.1 Định tính

* Trên bột dược liệu

- Soi kính hiển vi: có các khóm màu đỏ nâu rải rác

- Vi thăng hoa: có khói màu vàng bám trên lam Soi kính hiển vi thấy có

những tinh thể hình kim màu vàng Các tinh thể này tan ra và chuyển thành màu hồng nếu nhỏ một giọt NaOH 5%

* Phản ứng với các thuốc thử hoá học

- Phản ứng Borntrager

+ Lớp kiềm ở phía dưới của Dịch chiết bột dược liệu có màu đỏ

+ Lớp kiềm ở phía dưới của có màu Bã dược liệu sau khi chiết có màu đỏ nhạt

- Phản ứng với Magnesi acetate

Dung dịch chiết bột dược liệu có màu nâu đỏ

Kết quả định lượng bằng phương pháp cân của Daels và Koeber cải tiến

được ghi trong bảng 3.1 cho thấy hàm lượng anthraquinon trong quả nhàu thay

đổi theo sự phát triển của quả Quả non và quả già có hàm luợng tương đương nhau 0,56; 0,55% Quả chín có hàm lượng thấp nhất 0,39%

3.1.2.3 Chiết xuất và phân lập

Qua nghiên cứu thăm dò dung môi chiết xuất để loại tạp, sau đó dùng sắc

ký lớp mỏng để đánh giá độ sạch và số lượng các chất Kết quả cho thấy khi chiết bằng N- hexan được dịch chiết có màu vàng, sáng và vết sạch; dịch chiết N- butanol có màu đỏ nâu trên trên sắc ký đồ sạch hơn nhưng số lượng vết ít hơn trên dịch chiết toàn phần

Khi chiết xuất dùng ethyl acetat được dịch chiết màu vàng sáng, rất sạch, có

số vết tương đương với số vết của dịch chiết cao toàn phần nhưng số lượng ít và tạo nhũ rất nhiều, khó phá nhũ

Khi chiết với dung môi là kiềm loãng sau đó acid hoá thu được tủa mầu nâu sẫm 100 g cao quả nhàu thu được 13,1 g tủa, có số lượng vết ít trên sắc ký đồ

Từ nghiên cứu sàng lọc, chúng tôi dùng phương pháp tách chiết bằng hexan và kiềm loãng để loại tạp tìm ra đơn chất để xác định cấu trúc

N-Qua thăm dò dung môi cho sắc ký lớp mỏng, chúng tôi thấy dung môi benzen – dicloromethan cho các vết tách rõ ràng, số lượng vết nhiều nhất và có

1050C Kết quả thu được 6 phân đoạn

Trong 6 phân đoạn thu được, có phân đoạn T3( 150 mg), T4(250 mg), số vết rõ ràng, do đó phân đoạn T3, T4 tiếp tục được tách chiết trên sắc ký cột với dung môi và kích thước cột nhất định Kết quả cho thấy, với dung môi toluen-ethyl acetat và kích thước cột 2 x 42cm từ cắn T3 thu được 2 hợp chất đặt tên là C2 và C3 Tương tự như vậy, chúng tôi cũng thu được từ phân đoạn T4 2 hợp chất đặt tên là C4, C5

3.1.2.4 Nhận dạng chất phân lập được

* Hợp chất C1:

- Trên phổ H-NMR cho thấy hợp chất rất sạch có tín hiệu proton thế hiện

có 1 nhóm - CH2- OH; 1- CH2, 1 H ( m )và1 H ( s ); 2 - CH3

- Trên phổ C - NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT cho thấy hợp chất C1 có

11 carbon, trong đó 1 carbon bậc IV(s); 1 carbon bậc II (d), 7 carbon bậc II(t), 2 carbon bậc I(q)1, có tín hiệu cộng hưởng tương ứng một nhóm acid, 1 nhóm -

CH2OH, 1 nhóm - CH không mang oxy

Với các cơ sở này chúng tôi chưa xác định được cấu trúc chính xác hợp chất C1 nhưng dự đoán là alcol acid no có 11 carbon với một chức rượu bậc I

Trên phổ (MS) cho thấy hợp chất C2 có phân tử lượng là 436 có tín hiệu của

2 chức C=O trong phân tử, có thể do 2 phân tử đơn 16 carbon tương ứng với 2 phân tử lượng flavonoid (200-240) Do điều kiện kinh phí nên chúng tôi chưa xác định được chính xác cấu trúc C2

* Hợp chất C3:

- Trên HPLC với cột LC18, 250 x 4,6nm, 5 àm với pha động methanol: nước (8:2), tốc độ dòng 0,9ml/phút cho thấy hợp chất C2 rất tinh khiết có thời gian lưu là 11 phút trùng với thời gian lưu của chất chuẩn soranjidiol

- Trên UV hợp chất C3 có 4 đỉnh cực đại ở 218, 240, 245 và 267nm trùng với phổ UV của soranjidiol

Trên phổ IR cho thấy hợp chất C3 có mang nhóm chức OH; C=O;

-CH3; - CH và C=C tương tự như kết quả của chất chuẩn soranjidiol trên phổ IR

Từ các kết quả trên cho thấy hợp chất C3 chính là soranjidiol

* Hợp chất C4:

Trên HPLC: phương pháp như khi xác định hợp chất C3 cho thấy trên sắc

ký đồ chỉ có 1 đỉnh với thời gian lưu 5,6 phút trùng với thời gian lưu của 1 - methoxy - 2 - methyl 3 - hydroxy anthraquinon

- Trên phổ UV: hợp chất C4 có đỉnh hấp thu cực đại ở 218, 240 và 273nm trùng với đỉnh của chất 1 - methoxy - 2 - methyl - 3 - hydroxy anthraquinon

- Trên phổ IR: hợp chất C4 có nhóm chức - OH; - C=O, - CH3; O Kết quả này phù hợp với chất chuẩn 1 - methoxy - 2 – methyl- 3 - hydroxy anthraquinon

Từ kết quả trên có thể khẳng định hợp chất C4 trong quả nhàu là:

1 - methoxy - 2 - methyl 3 - hydroxy anthraquinon

* Hợp chất C5:

- Trên HPLC: phương pháp như cách xác định hợp chất C3 Trên sắc ký đồ cho thấy hợp chất C5 rất tinh khiết, chỉ có một đỉnh với thời gian lưu là 7,41phút

- Trên UV: có 6 đỉnh hấp thu cực đại ở 205, 229, 259, 585, 364 và 359nm Các đỉnh này tương tự như của scopoletin trên phổ IR

Với kết quả trên phổ HPLC; UV; IR và sắc ký lớp mỏng khi soi có màu

xanh da trời có thể khẳng định hợp chất C5 là scopoletin

3.1.3 Kết quả nghiên cứu về tinh dầu