Xác Định Một Số Đặc Tính Sinh Học Của Vi Khuẩn Pasteurella Multocida Gây Bệnh Tụ Huyết Trùng Trâu, Bò Tại Cao Bằng Và Lựa Chọn Vắc Xin Phòng Bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN --- ĐẶNG NGỌC LƯƠNG XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI CAO BẰNG VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

-

ĐẶNG NGỌC LƯƠNG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU,

BÒ TẠI CAO BẰNG VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Thú y

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đặng Xuân Bình

THÁI NGUYÊN - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng:

- Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi trực tiếp nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đặng Xuân Bình, và sự giúp đỡ của cán bộ Trung tâm chẩn đoán thú y - Cục Thú y

- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, khách quan, được rút ra từ tình hình thực tế của Cao Bằng trong những năm qua và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2012

Tác giả

Đặng Ngọc Lương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt 2 năm học tập, với nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã được hoàn thành Nhân dịp này, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới:

- PGS.TS Đặng Xuân Bình - Giám đốc trung tâm liên kết đào tạo quốc

tế - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Người thầy uyên bác, mẫu mực, tận tình và chu đáo đã luôn cổ vũ tinh thần, động viên, hướng dẫn và chỉ bảo cho

tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

- Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa Sau

Đại học, khoa Chăn nuôi - Thú y, các thầy cô giáo đã giúp đỡ, tạo điều kiện

để tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học

- Các cán bộ chi cục thú y tỉnh Cao Bằng, cán bộ thú y các trạm thú y huyện trong tỉnh Cao Bằng, đặc biệt là cán bộ thú y - trạm thú y huyện Hòa An

- Cán bộ trung tâm chẩn đoán thú y - Cục thú y Việt Nam

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân cùng bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2011

Tác giả

Đặng Ngọc Lương

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

4 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA

ĐỀ TÀI 4

1.1 Tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc 4

1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.2 Ở Việt Nam 5

1.2 Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng 7

1.2.1 Nguồn bệnh và phương thức lây lan 7

1.2.2 Loài mắc bệnh 7

1.2.3 Tuổi mắc bệnh 8

1.2.4 Mùa vụ phát bệnh 9

1.2.5 Vùng phát bệnh 10

1.3 Đặc tính sinh học của mầm bệnh 11

1.3.1 Phân loại 11

1.3.2 Hình thái và đặc tính nuôi cấy 11

1.3.3 Đặc tính sinh hóa 15

1.3.4 Kháng nguyên của vi khuẩn 16

1.3.5 Độc lực của vi khuẩn P multocida 19

1.3.6 Sức đề kháng 20

1.4 Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 21

1.4.1 Cơ chế sinh bệnh 22

1.4.2 Biểu hiện đặc trưng của trâu bò mắc bệnh tụ huyết trùng 22

1.5 Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh 24

Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nội dung nghiên cứu 26

2.1.1 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng 26

2.1.2 Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng 26

2.1.3 Đánh giá hiệu lực bảo hộ của một số loại vắc xin phòng bệnh tụ huyết trung trâu, bò trên thực địa 27

2.1.4 Lựa chọn vắc xin và đề xuất biện pháp khống chế bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng 27

2.2 Vật liệu dùng cho nghiên cứu 27

2.2.1 Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn 27

2.2.2 Động vật thí nghiệm 27

2.2.3 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 27

2.2.3.1 Hóa chất thí nghiệm 27

2.2.3.2 Dụng cụ thí nghiệm 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 29

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P multocida 30

2.3.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập 30

2.3.2.2 Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của P multocida 30 2.3.2.3 Phương pháp xác định serotype kháng nguyên của vi khuẩn P multocida 32

2.3.3 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn P.multocida phân lập được 32

2.3.3.1 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên chuột bạch 32

2.3.3.2 Phương pháp kháng sinh đồ 34

2.3.3.3 Xác định tình trạng miễn dịch của trâu, bò khỏe trong các ổ dịch cũ bằng phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) 34

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 35

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng 36

3.1.1 Tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, lợn trên địa bàn tỉnh Cao Bằng từ năm 2008 - 2011 36

3.1.2 Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của đàn trâu bò tại Cao Bằng từ năm 2008 đến năm 2011 38

3.1.3 Tần suất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại các huyện từ năm 2008 - 2011 39

3.1.4 Kết quả điều tra trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng theo mùa vụ tại Cao Bằng 41

3.2 Triệu chứng, bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn tỉnh

Cao Bằng 44

3.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ tại Cao Bằng 46

3.2.2 Tỷ lệ mang trùng Pasteurella của trâu, bò khỏe theo tính biệt trên địa

bàn tỉnh Cao Bằng 48

3.2.3 Tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở trâu, bò khỏe theo theo lứa tuổi trên

địa bàn tỉnh Cao Bằng 49

3.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella từ bệnh phẩm gia súc nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Cao Bằng 50

3.2.5 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật - hoá học của các chủng

vi khuẩn Pasteurella phân lập được 51

3.2.6 Xác định serotype kháng nguyên của các chủng P multcida phân lập được 52 3.2.7 Xác định độc lực của các chủng P multocida phân lập được 53

3.2.8 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn P multocida phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược 55

3.3 Kiểm tra an toàn của hai loại vắc xin trên chuột thí nghiệm 57

3.4 Xác định tình trạng miễn dịch chủ động tự nhiên đối với bệnh tụ huyết trùng của trâu, bò trong ổ dịch cũ 58

3.5 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng 1 tháng; 2 tháng; 4 tháng và 6 tháng 60

3.6 Lựa chọn vắc xin và đề xuất biện pháp khống chế bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

1 Kết luận 67

2 Đề nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

I Tài Liệu tham khảo trong nước 70

II Tài liệu tham khảo ngoài nước 74

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả điều tra tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng

từ năm 2008 - 2011 36 Bảng 3.2 Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng của đàn trâu bò tại Cao Bằng từ

năm 2008 đến năm 2011 38 Bảng 3.3 Tần xuất xuất hiện dịch tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng 40 Bảng 3.4 Kết quả xác định tỷ lệ trâu bò mắc bệnh, chết do bệnh tụ huyết

trùng theo mùa vụ tại Cao Bằng 41 Bảng 3.5 Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh 45 Bảng 3.6 Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi

của trâu bò khoẻ 46 Bảng 3.7 Tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở trâu, bò khỏe theo tính biệt trên địa

bàn tỉnh Cao Bằng 48 Bảng 3.8 Tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở trâu, bò khỏe theo tuổi trên địa bàn

tỉnh Cao Bằng 49 Bảng 3.9 Kết quả phân lập Pasteurella từ bệnh phẩm gia súc nghi mắc bệnh

tụ huyết trùng 50 Bảng 3.10 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn

Pasteurella phân lập được từ dịch ngoáy mũi 51 Bảng 3.11 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn

Pasteurella phân lập được từ bệnh phẩm 51 Bảng 3.12 Kết quả xác định serotype kháng nguyên của các chủng P

multocida phân lập được 52 Bảng 3.13 Kết quả thử độc lực của các chủng P multocida phân lập được từ

dịch ngoáy mũi 53

Bảng 3.14 Kết quả thử độc lực của các chủng P multocida phân lập được từ

bệnh phẩm 53 Bảng 3.15 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P

multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi 55 Bảng 3.16 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P

multocida phân lập từ bệnh phẩm 56 Bảng 3.17 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực của các loại vắc xin sử dụng

57 Bảng 3.18 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò

tiêm vắc xin tụ huyết trùng sau 1 tháng 59 Bảng 3.19 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò

tiêm vắc xin tụ huyết trùng sau 1 tháng 61 Bảng 3.20 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò

tiêm vắc xin tụ huyết trùng sau 2 tháng 62 Bảng 3.21 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò

tiêm vắc xin tụ huyết trùng sau 4 tháng 63 Bảng 3.22 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của trâu, bò

tiêm vắc xin tụ huyết trùng sau 6 tháng 64

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi trâu bò ở Việt Nam trong những năm qua đã có những bước phát triển đáng kể nhằm cung cấp thịt sữa cho nhu cầu thực phẩm của người dân; sức kéo cho nhu cầu sản xuất nông nghiệp, tiểu thủ công nghiệp và cung cấp nguyên vật liệu cho công nghiệp chế biến, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã hội Bên cạnh sự phát triển đó, ngành chăn nuôi trâu bò luôn phải

đối mặt với các bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng, trong đó có bệnh

Hà Giang năm 2008 đã có 276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng; tương

tự như vậy, tại tỉnh Cao Bằng trong năm 2008 đã có 455 trâu, bò chết và năm

2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng

Để khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết

trùng trâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, chế tạo, sử dụng để tiêm phòng cho trâu, bò nhưng bênh vẫn liên tục xảy ra, đặc biệt trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc Đinh Duy Kháng và cs (2000) [14] cho biết: Việc tiếp tục

phân lập xác định vi khuẩn Pasteurella là cần thiết để làm rõ đặc điểm dịch tễ

của bệnh để tìm ra quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất

và ứng dụng vắc xin phù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh Lê Văn Tạo và cs (1998)[32] cũng khuyến cáo: Nên tiêm phòng bệnh tụ

huyết trùng trâu bò đạt tỷ lệ cao bằng vắc xin tương đồng kháng nguyên với

chủng vi khuẩn Pasteurella gây bệnh ở địa phương

Về đáp ứng miễn dịch của một số loại vắc xin hiện đang được sử dụng

để phòng bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở nước ta, Hoàng Xuân Nghinh và cs

(2004) [22] trao đổi: Hiện nay ở Việt Nam có hai loại vắc xin sản xuất trong nước được các địa phương sử dụng Tuy nhiên tỷ lệ trâu bò mắc bệnh và chết vẫn không ngừng gia tăng dẫn tới chúng ta phải suy nghĩ xem có phải chất lượng kháng nguyên trong vắc xin chưa được chuẩn hoá hay đặc tính kháng

nguyên của vi khuẩn Pasteurella ở mỗi vùng có sự khác nhau

Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, căn cứ vào cơ sở khoa học

và năng lực của cơ quan nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Xác định

một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại các huyện, thị xã thuộc tỉnh Cao Bằng

- Khảo sát sự lưu hành vi khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò khỏe

và trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng

- Giám định đặc tính sinh vật hóa học, yếu tố gây bệnh và serotype

kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được

- Đánh giá mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng

bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella phân lập

được ở trên thực địa

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

* Ý nghĩa khoa học:

- Bổ sung tư liệu về đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

- Bổ sung tư liệu về kết quả phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa

học, yếu tố độc lực và kết quả xác định serotype kháng nguyên của vi khuẩn

Pasteurella multocida phân lập được bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain

Reaction)

* Ý nghĩa thực tiễn:

- Cung cấp tư liệu thực tế về serotype kháng nguyên vi khuẩn

Pasteurella multocida trên thực địa tại Cao Bằng

- Cơ sở để lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò có khả năng bảo hộ cao

- Góp phần khống chế bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò Cao Bằng và trên

địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc

* Những điểm mới của đề tài

- Bổ sung một số đặc điểm dịch tễ về sự lưu hành của vi khuẩn

Pasteurella ở trâu, bò khỏe; xây dựng bản đồ dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trên

địa bàn tỉnh Cao Bằng

- Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ những trâu, bò mắc bệnh tụ

huyết trùng, so sánh tự tương đồng về kháng nguyên với trâu bò khỏe mang trùng

- Xác định tình trạng miễn dịch chủ động tự nhiên đối với kháng

nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida của trâu, bò trong ổ dịch

- Đánh giá sự an toàn và khả năng đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm một số loại vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò đang lưu hành tại Việt Nam

4 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Trâu, bò ở mọi lứa tuổi, vi khuẩn Pasteurella

multocida

- Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại tỉnh Cao Bằng, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện KHSS - Đại học Thái Nguyên, Viện Thú y quốc gia, Trung tâm chẩn đoán thú y - Cục thú y Việt Nam

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc

1.1.1 Trên thế giới

Bệnh tụ huyết trùng được Bollinger phát hiện lần đầu tiên trên bò năm

1878 ở Munich (Đức) Những năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở khắp mọi nơi trên thế giới, trên nhiều loài gia súc, gia cầm Năm 1885, Kitt đã phân lập

được vi khuẩn Khi nghiên cứu vi khuẩn tụ huyết trùng gây bệnh ở các loài

gia súc, các nhà khoa học thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh, tương

đồng kháng nguyên, nhưng khác nhau về tính gây bệnh cho các loài vật Năm

1887, Trevisan đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ công

lao của Louis Pasteur, người có nhiều đóng góp nghiên cứu phát hiện ra loại

vi khuẩn này (De Alwis, 1992) [50]

Vi khuẩn pasteurella gây bệnh cho nhiều loài gia súc nên tên của chúng

được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh:

Pasteurella suiseptica gây bệnh ở lợn Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò

Pasteurella oviseptica gây bệnh ở dê, cừu

Pasteurella aviseptica gây bệnh ở gà…

Đến năm 1939, Rosenbush và Merchant [79] đã đề nghị đặt tên cho vi

khuẩn này là Pasteurella multocida, để chỉ khả năng gây bệnh cho nhiều loài

vật của chúng, tên này đã được công nhận chính thức trên thế giới và sử dụng cho đến ngày nay

Lignieres (1900)[62] cho rằng: bệnh tụ huyết trùng có ít nhất ở 6 loài

vật nuôi khác nhau Hai thuật ngữ chỉ bệnh là Haemorrhagic septicaemia và

Pasteurellosis được xem là đồng nghĩa Tuy nhiên, gần đây theo qui ước của

tổ chức FAO (FAO/WHO/CIF, 1970), trong các tài liệu quốc tế về súc sản,

hai thuật ngữ này được dùng phân biệt, Haemorrhagic septicaemia dùng chỉ bệnh do P multocida thuộc serotype I Roberts gây ra, còn Pasteurellosis dùng chỉ bệnh do vi khuẩn Pasteurella gây ra

Ở Châu Á, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò do P multocida gây ra thường

ở hai thể chủ yếu: Nhiễm trùng máu - xuất huyết (Haemorrhagic septicaemia

- HS) và viêm phổi ở bò (Bovine pneumonic pasteurellosis)

Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu, P

multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh tụ huyết trùng cho nhiều loài gia súc

gia cầm Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau, nhưng

P multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau

1.1.2 Ở Việt Nam

Bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam được phát hiện vào những năm cuối thế

kỷ 19: Cudamie thông báo về bệnh ở trâu thuộc tỉnh Bà Rịa và Long Thành năm 1868, sau đó Gemain (1869) phát hiện bệnh ở Gò Công, Yersin phát hiện bệnh ở ở các tỉnh miền Trung vào các năm 1889-1895 Năm (1901) Shein bằng phương pháp phân lập và tiêm truyền qua động vật thí nghiệm đã xác nhận ổ

dịch ở trâu, bò xảy ra ở Tây Ninh là do vi khuẩn P multocida (Phan Đình Đỗ

và Trịnh Văn Thịnh, 1958) [4])

Theo Đoàn Thị Băng Tâm (1987)[31], tại Việt Nam bệnh thường xảy ra

ở Nam bộ và đặc biệt ở miền tây Nam bộ, vào những năm 1910, 1919, 1920,

1933, 1935 dịch xảy ra rất lớn và mạnh Bệnh gây thiệt hại và lây lan nhiều hơn ở những vùng đất trũng, thấp, khí hậu ẩm ướt Bùi Quý Huy (1998) [11] cũng cho biết: Trước đây bệnh tụ huyết trùng xảy ra mạnh ở các tỉnh phía Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phía Bắc Trong những năm 70 có 80% số ổ dịch tụ huyết trùng và 84% số thiệt hại gia súc do bệnh tụ huyết trùng thuộc

về các tỉnh ở phía Nam Đến những năm 90 phân bố địa lý của bệnh nghiêng

về các tỉnh phía Bắc, số địa phương có dịch tụ huyết trùng cũng tăng lên nhiều, hàng năm có 20 - 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành

Ở nước ta khí hậu nóng ẩm, mỗi miền Bắc - Trung - Nam có điều kiện

khí hậu và hệ sinh thái khác nhau Các tác giả (Nguyễn Vĩnh Phước (1978)[25], Nguyễn Ngã (1996)[21], Nguyễn Thiên Thu (1996)[34]) đã nhận

định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thường trùng với những cơn mưa ở

từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa

Nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu đặc tính sinh vật hoá học của

vi khuẩn P multocida, phương pháp chẩn đoán, phân lập và chế tạo vắc xin

phòng bệnh

Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007)[8] tiến hành nghiên cứu một

số đặc tính của vi khuẩn P multocida phân lập từ trâu, bò, lợn

Phan Thanh Phượng (1986 - 1990)[28] đã nghiên cứu, chế tạo và sử

dụng vắc xin nhũ hoá bằng công nghệ lên men sục khí để phòng chống bệnh

tụ huyết trùng trâu, bò, lợn và gia cầm có nhiều ưu việt hơn vắc xin cũ

Dương Thế Long (1995)[18] đã phân lập được vi khuẩn P multocida

gây bệnh cho các loài vật nuôi (trâu, bò, lợn và gà) tại tỉnh Sơn La

Nguyễn Ngã (1996)[21], Nguyễn Thiên Thu (1996)[34] đã phân lập

được vi khuẩn P multocida từ trâu, bò mang trùng ở khu vực miền Trung và

xác định tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập

được với chủng vắc xin Iran

Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng như Bùi văn Dũng (2000) [3] nghiên cứu tình hình bệnh tụ huyết trùng

và vi khuẩn P multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe ở tỉnh Lai

Châu Hoàng Đăng Huyến (2004) [12] nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu

tố ảnh hưởng đến bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Bắc Giang Nguyễn Đăng Minh (2005) [20] nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh THT và xác định

tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở đàn trâu, bò tỉnh Hà Tây Đỗ Ngọc Thúy và cs

(2007) [35] đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định Type các chủng vi khuẩn

P multocida phân lập từ vật nuôi

1.2 Dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng

1.2.1 Nguồn bệnh và phương thức lây lan

Nguồn lây bệnh tụ huyết trùng là những trâu, bò, lợn và gia cầm bị bệnh và mang trùng

Trong cơ thể gia súc khỏe mạnh, P multocida ở một điều kiện nhất

định, vi khuẩn thường tồn tại ở đường hô hấp trên của vật chủ, đây không

phải là quan hệ cộng sinh Khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn tăng

độc lực và tác động gây bệnh

Cho đến nay không rõ là vi khuẩn tồn tại bằng cách truyền lần lượt trong một số dãy cá thể của một quần thể hay nó còn tồn tại lâu dài một số con Có nhiều cách lây bệnh khác nhau: Nhiễm qua đường hô hấp, đường tiêu hóa, qua vết xước trên da, bệnh có thể lây từ con ốm sang con khỏe qua tiếp xúc Bệnh lây lan do việc giết mổ gia súc ốm, chó mèo và một số côn trùng hút máu như ruồi, mòng… cũng có thể là vật môi giới truyền mầm bệnh đi xa (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [25] Trong giai đoạn đầu của bệnh, khi con vật còn đi lại được, vi khuẩn từ nước dãi, phân, nước tiểu được bài ra xung quanh Ổ dịch rộng hay hẹp tùy theo điều kiện tồn tại của vi khuẩn và sức miễn dịch của đàn (Phan Thanh Phượng, 1994) [29]

1.2.2 Loài mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú và loài chim

đều mẫn cảm với bệnh Theo Lignieres (1900) [62] ít nhất có 6 dạng bệnh tụ

huyết trùng khác nhau: Ở gà, trâu, bò, lợn, cừu, dê, ngựa và chó, cả 6 dạng bệnh này đều thấy ở thỏ Bệnh thấy ở trâu, bò, lợn, thỏ, chó, mèo, hươu, ngựa, chồn, khỉ, dê và cừu (Carter, 1959[44]) Bệnh còn thấy ở bò rừng, nai, sơn

dương, lợn rừng, thỏ rừng, voi, lạc đà và báo tuyết ở Hymalaya (De Alwis, 1982[48]) Nhiều tác giả đã khẳng định: Nơi nào có bệnh tụ huyết trùng trâu,

bò thì ở đó người ta cũng phát hiện bệnh này ở động vật hoang dã

De Alwis (1982) [48] cho rằng loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu, bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò Tỷ lệ mắc bệnh

và tỷ lệ chết của các loài vật với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như mức độ cảm nhiễm của vùng, mức độ bùng nổ của các vụ dịch trước đó, mức độ miễn dịch toàn đàn, đặc biệt phụ thuộc vào lứa tuổi mắc bệnh

Ở Việt Nam, trâu dễ bị nhiễm và mắc bệnh nặng hơn bò Trâu, bò rừng

cũng mắc bệnh (Đoàn Thị Băng Tâm, 1987) [31] Trâu thường chết khi gặp thể quá cấp hoặc cấp tính

1.2.3 Tuổi mắc bệnh

De Alwis (1984)[49] cho biết mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnh hơn động vật già, kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy ở bò và trâu tỷ lệ mắc bệnh ở lứa tuổi dưới 6 tháng là 3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng

đến 2 năm là 30 - 32%, ngược lại trâu, bò trên 2 năm tuổi tỷ lệ mắc bệnh chiếm

từ 3 - 5% toàn đàn Nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ chết của trâu, bò trong mỗi ổ dịch là 84 và 91% tập trung vào lứa tuổi 6 tháng đến 18 tháng

Bệnh xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi, những con đang bú mẹ ít mắc hơn những con trưởng thành Trâu, bò 1-3 tuổi dễ mắc hơn trâu bò già và khi mắc thì tỷ lệ chết cao hơn Trâu bò càng béo, khỏe, trẻ càng dễ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao Bê, nghé dưới 6 tháng tuổi ít mắc bệnh (Bùi Quý Huy, 1998) [11] Cao Văn Hồng (2002) [9] tại Đắk Lắk cũng cho thấy lứa tuổi cảm nhiễm với bệnh nhất là dưới 36 tháng tuổi Hoàng Đăng Huyến (2004) [12] cho biết tại Bắc Giang trâu, bò nhỏ hơn 2 năm tuổi mẫn cảm với bệnh nhất

1.2.4 Mùa vụ phát bệnh

Bệnh tụ huyết trùng phụ thuộc rất lớn vào thời tiết, khí hậu Mustafa và

cs (1978)[64 ] nghiên cứu về ảnh hưởng của mùa vụ tới bệnh tụ huyết trùng

đã nhận xét bệnh thường liên quan tới điều kiện khí hậu ẩm ướt

Theo Yeo và Mukhtar (1992)[83] khi nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng phải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng vì những yếu tố này ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của mầm bệnh trong môi trường sinh sống của động vật cảm nhiễm

Mùa phát bệnh tụ huyết trùng ở các nước Châu Á tập trung vào các tháng và mùa khác nhau trong năm Ở Lào bệnh phát ra từ tháng 4 đến tháng 8; Ở Pakistan bệnh xảy ra rải rác quanh năm song thường ở tháng 4 đến tháng

6 hàng năm (FAO, 1991[54]) Ở đảo Java (Indonesia) bệnh xuất hiện vào cuối mùa khô, đầu mùa mưa (Natalia và cs, 1992[71]), bệnh xảy ra các tháng 8, 9

ở Malaysia (Yeo và Mukhtar, 1992[83])

Yeo và Mukhtar (1992)[83] theo dõi dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu,

bò ở đảo Sabah Malaysia từ 1983 - 1991 cho biết số lượng ổ dịch và số lượng trâu, bò chết hàng năm ở các huyện rất khác nhau: Một số huyện xảy ra dịch

từ tháng giêng đến tháng 3, trong khi phần lớn lại xảy ra dịch từ tháng 7 đến tháng 11 Từ số liệu theo dõi của mình, tác giả đã so sánh giữa 2 vùng trong cùng một đất nước về loài vật mắc bệnh, tuổi mắc bệnh, thời gian xảy ra bệnh

và cho rằng sở dĩ có sự khác nhau này là do điều kiện thời tiết khí hậu có sự khác nhau giữa 2 vùng, đồng thời phương thức chăn nuôi giữa 2 vùng cũng khác nhau Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy tại từng địa phương, từng quốc gia khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phải quan tâm đến điều kiện thời tiết, khí hậu và địa lý của từng vùng, vì những yếu tố này ảnh hưởng tới sự tồn tại, phát triển của mầm bệnh trong môi trường sinh sống của động vật cảm nhiễm

Ở nước ta bệnh xuất hiện ở khắp nơi, có khi chỉ là những ổ dịch nhỏ, lẻ

tẻ nhưng bắt đầu vào mùa mưa, khí hậu nóng ẩm thì bệnh lây lan thành dịch, bởi nhiệt độ ẩm của mùa mưa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của mầm bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [25] Bùi Quý Huy (1998) [11] cho biết ở miền Bắc bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào các tháng mưa nhiều từ tháng 7 đến tháng 9, ở miền Nam bệnh xảy ra mạnh sau khi mưa và nắng từ tháng 4 đến tháng 10 Theo Nguyễn Đăng Minh (2005) [20] bệnh tụ huyết trùng xảy ra rải rác quanh năm tập trung từ tháng 3 đến tháng 8, vào các tháng đầu mùa mưa của vụ hè thu, cao nhất là tháng 5, 6 vì đây là các tháng nắng nóng, nhiệt độ cao, ẩm độ cao

1.2.5 Vùng phát bệnh

Các nghiên cứu đều cho thấy bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra ở những vùng đất trũng, khí hậu nóng và ẩm ướt Theo Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh (1958)[4] bệnh thường xảy ra ở vùng ẩm thấp, khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, đặc biệt là đầu mùa mưa Điều kiện tự nhiên, khí hậu và phương thức chăn nuôi cũng ảnh hưởng đến quá trình lây lan và phát sinh bệnh Đặc biệt ở những vùng đất trũng, ẩm thấp, lầy lội, bị ngập lụt, có nhiều ruộng nước, nhiều kênh rạch, bệnh thường xảy ra và lây lan mạnh làm chết nhiều gia súc (Đoàn Thị Băng Tâm, 1987[31]) Năm 1990 riêng ba tỉnh Sơn La, Hoàng Liên Sơn, Bắc Thái số ở dịch tụ huyết trùng gia súc chiếm 60% và trong đó có tới 70% số gia súc chết so với toàn miền Bắc (Bùi Quý Huy, 1998[11]) Đỗ Văn Được (2003)[6] cho biết ở Lạng Sơn vùng núi đất, có độ dốc lớn, nhiệt độ thấp, ẩm độ cao, tập quán chăn nuôi còn lạc hậu, chăn thả tự do thì tỷ lệ bị nhiễm bệnh và chết cao Theo Hoàng Đăng Huyến (2004) [12] ở Bắc Giang những vùng đồi núi thấp tỷ lệ mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng cao Nguyễn Văn Minh (2005)[20] thông báo ở Hà Tây tỷ lệ trâu, bò ốm chết vì bênh tụ huyết trùng ở vùng đồi, bán sơn địa cao hơn so với vùng chiêm trũng và vùng đồng bằng

Ở những vùng mà phương thức chăn nuôi còn thả rông, không có

người chăm sóc, không làm chuồng nuôi nhốt, để gia súc ở những nơi bùn lầy, ngập nước, vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng kém thì khả năng xảy ra bệnh cao Ngoài ra, trình độ dân trí thấp, nhận thức của người dân về công tác phòng chống bệnh chưa cao, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào việc phòng chống dịch bệnh còn nhiều khó khăn… cũng không tránh khỏi việc dịch bệnh thường xuyên xảy ra

1.3 Đặc tính sinh học của mầm bệnh

1.3.1 Phân loại

Giống Pasteurella có nhiều loài, căn cứ vào tính chất gây bệnh cho các loài động vật, người ta chia giống Pasteurella thành 3 loài, trong đó loài gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là Pasteurella multocida và với

từng giống gia súc, gia cầm khác nhau bệnh tụ huyết trùng lại do các serotype khác nhau gây ra

Theo phân loại của Bergey (1994) [41 ], Pasteurella spp thuộc:

- Bộ (order) Eubacteriales

- Họ (family) Parvobacteriaceae

- Tộc (tribe) Pasteurellceae

- Giống (genus) Pasteurella

1.3.2 Hình thái và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn P multocida có dạng cầu -trực khuẩn, bắt màu Gram âm (-),

kích thước 0,25-0,4 × 0,4-1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không có lông, không di

động, bắt màu lưỡng cực (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [33]

Theo Carter (1967)[46] có mối liên quan về tính đa dạng của vi khuẩn khi phát triển trong điều kiện thiếu O2 Vi khuẩn thường đồng nhất trong máu

động vật Trong môi trường nhân tạo vi khuẩn thường đa hình dạng, hình

trứng, hình cầu Tác giả còn nhận thấy khi nuôi cấy nhiều lần trong môi trường nhân tạo, chiều dài của vi khuẩn tăng lên

Trong cơ thể gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh hoặc máu vỡ, vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khi nhuộm khó

thấy Khi nhuộm tiêu bản bệnh phẩm, Pasteurella multocida bắt màu sẫm ở

hai đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu nên

người ta gọi Pasteurella multocida là vi khuẩn lưỡng cực Nguyên nhân này

là do nguyên sinh chất của vi khuẩn dồn về 2 đầu

Trong canh khuẩn vi khuẩn có hình trứng, hình cầu đứng riêng lẻ hay thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già vi khuẩn suy yếu, biến dạng thay đổi hình thái như hình gậy dài, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường có khi dài 2-3µm Vi khuẩn không có lông, không di động không hình thành nha bào

Pasteurella dễ nhuộm với thuốc nhuộm thông thường như anilin,

Methylen Bleu, Fuchsine và Giemsa

Vi khuẩn P multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường

như: Môi trường nước thịt, môi trường thạch thường Theo (Seleim R S

(2005) [80], để vi khuẩn P multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo

cần thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối

vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường Trong đó leucin tác dụng kích thích tăng trưởng Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém, vi khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường nuôi cấy có

bổ sung 5-10% huyết thanh hoặc máu động vật

P multocida là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, ưa kiềm nhẹ,

pH=7,2-7,4, có thể nuôi cấy ở nhiệt độ từ 130C đến 380C, thích hợp nhất là 370C

Trên các môi trường nuôi cấy thông thường vi khuẩn phát triển kém Vi khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 5-10 % huyết thanh hoặc máu động vật

Trên môi trường nước thịt: Sau khi cấy 24h ở nhiệt độ 37oC vi khuẩn làm đục môi trường, đáy ống có cặn nhày, lắc có hiện tượng vẩn như sương

mù rồi lại mất, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi trường Môi trường có mùi đặc biệt giống mùi tanh của nước dãi khô Theo Carter, (1952)[42] mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở pha phát triển nhanh, để lâu mùi tanh

giảm dần (trong môi trường nước thịt P multocida phát triển theo 4 pha: Pha

chậm, pha phát triển nhanh, pha cân bằng và pha suy thoái)

Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng Nuôi cấy lau khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường

Theo Carter (1955)[43], Namioka và Murata (1961a, b)[67], [68] trên

môi trường thạch P multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:

+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và có độc lực mạnh

+ Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): Nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, độc lực trung bình

+ Khuẩn lạc R (Rough): Có rìa xù xì, thường không có dung quang,

độc lực yếu

Tính biến dạng của vi khuẩn này rất lớn khi cấy chuyển qua môi trường dinh dưỡng nhiều lần hoặc tiêm qua động vật Từ dạng S chúng có thể chuyển sang dạng R hoặc M và ngược lại Tính biến dạng này đặc biệt rõ khi nuôi cấy

vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng có các loại đường mà chúng lên men Trong những môi trường đó chúng xếp thành từng chuỗi

Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: Vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước

dãi khô rất đặc trưng cho vi khuẩn tụ huyết trùng Đặc điểm này rất dễ nhận ra

và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán

Theo Namioka và murata (1961c)[69] YPC (Yeast extract Pepton- Cystin) có thêm Sucrose và sodium sulfite là môi trường nuôi cấy tốt nhất cho

L-vi khuẩn P multocida, môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của L-vi khuẩn

và cũng là môi trường phân lập, giữ giống và nhân giống

Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: Đây là môi trường đặc biệt dùng để phân lập, giám định và xác định độc lực của vi khuẩn

Pasteurella Trên môi trường này vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc

đặc biệt, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển

vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp (khoảng 20 lần) và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o Những khuẩn lạc dạng S từ canh trùng thường mới có tính dung quang Khuẩn lạc dạng M và R không có đặc điểm nói trên

Tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau:

+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: Khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent)

+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: Khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent)

+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: Khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent) Khuẩn lạc nhỏ tròn trong

Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy sau 24h Nếu để lâu sau 72h thì huỳnh quang sẽ mất đi Theo Smith (1990)[81]

đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của vi khuẩn

tụ huyết trùng Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng tụ huyết trùng

có tính kháng nguyên và miễn dịch cao

Như vậy, vi khuẩn tụ huyết trùng có thể phát triển trên nhiều loại môi trường, song có một số loại môi trường được các tác giả cho là thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng, đó là: Môi trường YPC, môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến Cần lưu ý là khi cấy chuyển trên môi trường nhân tạo nhiều lần, vi khuẩn tụ huyết trùng có sự biến đổi về khả năng mọc, đặc điểm hình thái và giáp mô cũng như sự tạo khuẩn lạc, đồng thời có

sự thay đổi về độc lực, thay đổi về tính kháng nguyên của chủng nuôi cấy

1.3.3 Đặc tính sinh hóa

Lignière đã phát hiện một số đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn tụ huyết trùng từ những năm đầu của thế kỷ XX Theo thời gian, nhiều công trình

nghiên cứu về đặc tính sinh hoá của vi khuẩn P multocida đã được công bố

Các tác giả thống nhất về một số đặc tính sinh hoá cơ bản của vi khuẩn tụ huyết trùng như sau:

- Dương tính trong các phản ứng indole, khử nitrat, catalase, Oxidase

- Phân giải lên men các loại đường glucose, galactose, saccarose, mannose và levulose

- Không lên men đường lactose, maltose, ducitol và rafinose

Rosenbusch và Merchant (1939) [79] nghiên cứu 113 chủng tụ huyết trùng về các phản ứng phân giải arabinose, xylose và ducitol, chia vi khuẩn thành 3 nhóm

- Nhóm 1: Gồm các vi khuẩn phân giải arabinose và ducitol, không phân giải Xylose Những chủng này phân lập từ gia cầm

- Nhóm 2: Gồm những chủng phân giải xylose, không phân giải arabinose và ducitol Những chủng này phân lập từ động vật có vú

- Nhóm 3: Gồm những chủng lên men phân giải arabinose, ducitol và xylose Tác giả còn thấy khi nuôi cấy lâu trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn mất khả năng phân giải arabinose và xylose Tất cả các chủng được nghiên cứu ở trên đều sinh indol, không di động, không dung huyết và không phân hủy urea

Tác giả nhận thấy, những chủng phân lập từ gia cầm đều thuộc nhóm

1, những chủng phân lập từ động vật có vú đều thuộc nhóm 2

Ở Việt Nam cũng có khá nhiều tác giả nghiên cứu đặc tính sinh vật,

hoá học của P multocida như Nguyễn Xuân Bình (1996)[1] và Hoàng Đạo

Phấn (1996)[24]

1.3.4 Kháng nguyên của vi khuẩn

Kháng nguyên P multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng

nguyên cũng luôn thay đổi Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự

phân bố kháng nguyên P multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin

Khi nghiên cứu đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn P multocida Lignière (1900)[62] đã khẳng định các chủng P multocida phân lập từ các

loài vật mắc bệnh khác nhau có đặc tính huyết thanh không đồng nhất

Cho đến nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của

P.multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K, Kháng nguyên thân O, kháng

nguyên ngoại tế bào OMP (outer memmbrane protein)

Kháng nguyên vỏ (K): Chỉ có ở P multocida tạo khuẩn lạc dạng S,

không gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, che cho kháng nguyên O khỏi bị các phage tác

động, đồng thời ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O

Do đó, muốn phát hiện kháng nguyên O bị che lấp, người ta phải phá huỷ kháng nguyên K hoặc dùng phương pháp nuôi cấy không cho vi khuẩn hình

thành giáp mô Kháng nguyên K thu được qua chiết xuất từ canh khuẩn non, phát hiện được dễ dàng qua phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price G H và Smith (1966)[73] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccaride Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô)

có khả năng gây miễn dịch mạnh

Kháng nguyên K, đặc biệt là thành phần protein của kháng nguyên K

đóng vai trò tích cực trong quá trình hình thành miễn dịch

Kháng nguyên thân (O): Vi khuẩn P multocida có kháng nguyên thân

là phức hợp protein - lipid - polysaccaride chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch

Price G H và Smith (1966)[73] dùng phương pháp điện di miễn dịch trên máy lắc Mikle đã tách được 16 kháng nguyên O và kí hiệu từ 1 - 16 Sau khi nhuộm đỏ Thiazine, xử lý nhiệt và enzyme, tác giả xác định được 6 trong

16 kháng nguyên O là protein

Heddleston và cs (1966)[57] cho biết kháng nguyên lipopolysaccarid

(LPS) của P multocida gắn với protein một cách lỏng lẻo Qua ly tâm ở tốc

độ cao, những chủng vi khuẩn phân lập được ở gia cầm đã xác định được một

kháng nguyên gồm cả lipopolysaccarid và protein

Theo một số tác giả, các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O Những chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng: Kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng, 1994[29])

Kháng nguyên ngoại tế bào (Outer membrane proteins - OPM)

Thành phần của kháng nguyên protein ngoài màng tế bào rất phức tạp

có tới hơn 40 loại protein đã được xác định Mối quan hệ giữa các band protein khi tiến hành điện di và các serotype đã được nghiên cứu song không tìm thấy bất kỳ một loại protein duy nhất nào đặc trưng cho tất cả các chủng gây tụ huyết trùng

Kháng nguyên ngoại tế bào gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầu hết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó) Một trong những protein độc tính quan trọng của protein ngoại tế bào này là protein gắn huyết cầu tố (hemoglobin-binding protein), protein này

có một receptor đặc hiệu trên màng hemoglobin Đoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giải trình tự (Seleim, 2005[80])

Ba loại protein ngoại tế bào đã được phát hiện ở các chủng gây viêm

teo mũi được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III Sự khác biệt này được phân loại dựa trên cấu trúc chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (W) của kháng nguyên này, khối lượng phân tử dao động trong khoảng giữa

28 kDa và 40kDa Protein H của Pasteurella multocida có các đặc điểm tương tự protein xuyên màng của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae,

giống các peptidoglycane, kháng trypsine, kháng dung dịch SDS (sodium dodicyl sulphate) Hơn nữa protein H phức hợp với lipopolysaccharide khi gây đáp ứng miễn dịch Mặc dầu không thể phát hiện ra mối quan hệ giữa độc tính của các chủng với protein ngoại tế bào, song OMP type I có độc tính cao với lợn và gây ra viêm teo mũi truyền nhiễm ngược lại OMP type II và III ít

độc tính hơn Seleim (2005)[80] cho biết các chủng Pasteurella multocida có

khá tương đồng và ít có sự khác nhau về cấu trúc các protein ngoại bào

Tóm lại, kháng nguyên của P multocida rất phức tạp, còn nhiều vấn

đề chưa được sáng tỏ, đặc biệt là kháng nguyên thân O Xét về quan hệ hoá

học, các kháng nguyên protein và lipopolysaccarid của P multocida có vai trò

chính trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh và kháng nguyên là polysaccarid đóng vai trò hỗ trợ

1.3.5 Độc lực của vi khuẩn P multocida

Độc tố của canh trùng P multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế

kỷ 20, Baldrey đã nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có độc tính của lipopolysaccharide

Độc lực của P multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc

vào chủng vi khuẩn và loài vật kí sinh Giáp mô của P multocida là yếu tố

độc lực quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập và phát triển trong kí

chủ Đa phần những chủng P multocida có giáp mô thì độc lực cao, những chủng P multocida không có giáp mô thì độc lực yếu hoặc không có độc lực

Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp vi khuẩn này không có giáp mô nhưng vẫn có độc lực cao và một số chủng có giáp mô lại độc lực thấp Khi nuôi cấy

P multocida trong môi trường nhân tạo qua 24h thì giáp mô của vi khuẩn

phát triển đầy đủ, sau đó mất dần đi Một số tác giả còn cho rằng ở nhiều

chủng P multocida độc lực có thể phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp

mô hơn là sự có mặt của chúng

Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P multocida các tác giả cho thấy

ở những gia súc, gia cầm chết do P multocida gây ra người ta tìm thấy dấu

hiệu hoạt động của độc tố Nội độc tố được sinh ra bởi các loài P multocida,

kể cả chủng có độc lực và không có độc lực, Heddleston và cs (1972) [58] đã chứng minh nội độc tố được gắn kết lỏng lẻo và có thể rửa trôi khỏi tế bào vi

khuẩn P multocida bằng dung dịch nước muối có formalin và được làm lạnh Nội độc tố của P multocida có thể chiết xuất được bằng acid trichloroacetic

theo qui trình của Boivin

Phùng Duy Hồng Hà (1990)[7] thử nghiệm độc lực của 3 chủng P

multocida phân lập được tại các tỉnh phía nam là TG, V, HL trên chuột, gà và

vịt, kết quả cho thấy các chủng có dung quang màu vàng da cam có độc lực rất cao

Nghiên cứu Ramdani và cs (1990)[75] cho thấy một trong những

chủng P multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là chủng M1404

thuộc serotype B rất độc với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩn/con thì sau

18 giờ chuột đã có triệu chứng nhiễm trùng huyết

Vi khuẩn P multocida thuộc serotype D còn tạo ra dermanecrotic

toxin (DNT) là độc tố gây hoại tử biểu bì, độc tố này không bền với nhiệt Trọng lượng phân tử của dermanecrotic toxin khoảng 112 - 160 kDa và có thể

tách chiết trong canh trùng nuôi cấy, gen toxA qui định tổng hợp

dermanecrotic toxin có chiều dài 4,381 bp Nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30°C thì

hoạt tính của gene toxA này bị giảm nhiều và lượng độc tố DNT sinh ra cũng

Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm

thấy ở một số chủng P multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính

kháng nguyên của những độc tố này tương đối giống nhau Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có độc tố bản chất từ protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chất protein của serotype E

1.3.6 Sức đề kháng

Pasteurella dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất

sát trùng thông thường Vi khuẩn bị diệt khi đun ở 58oC trong 20 phút, 80oC

trong 10 phút, 100oC trong vài giây Trong các mô bào của cơ thể, ở nhiệt độ

80oC vi khuẩn giữ được độc lực trong vòng 15 - 20 ngày, ánh sáng mặt trời diệt vi khuẩn trong 12 giờ Trong xác xúc vật, vi khuẩn sống được từ 1 - 3 tháng Trong máu, mô bào, nước tiểu của súc vật chết, vi khuẩn giữ được độc lực trong vòng từ 5 - 9 ngày Trong tuỷ xương vi khuẩn giữ được độc lực ít nhất 8 ngày sau khi con vật chết Vì vậy, bệnh phẩm được gửi đi chẩn đoán tốt nhất là tuỷ xương

Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng như axit phenic 5% trong 1 phút, creolin 3%, crezyl 3%, nước vôi 1% trong 3-5 phút

Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong đất có nhiều nitrat và thiếu ánh sáng Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm Vi khuẩn trong da đun sấy khô từ từ có thể giữ độc lực 15 - 25 ngày, trong tổ chức thối nát vi khuẩn sống tương đối lâu hơn, từ 1 - 3 tháng nếu nhiệt độ dưới 20oC

1.4 Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

Bệnh do P multocida gây ra thường ở 2 thể chủ yếu: Nhiễm trùng

huyết, xuất huyết (Haemorrhagie septicaemia) và viêm phổi ở bò (Bovine pneumoniae Pasteurellosis) Thể nhiễm trùng huyết, xuất huyết được thấy ở

trâu bò các nước Châu Á và Châu Phi do P multocida Type B:2 và Type E:2

gây ra (Bain và cs, 1982) [38] Thể viêm phổi bò được thấy ở các nước Châu

Âu và Bắc Mỹ do P multocida Type A gây ra Cho đến nay đã xác định được

2 serotype gây bệnh chính cho trâu, bò là E:2 và B:2 Các nước Châu Á được ghi nhận chỉ có serotype B:2, các nước thuộc Châu Phi chỉ có serotype E:2 Nhưng một số nước khác như Ai Cập, Sudan đã được xác nhận có cả 2 serotype (Carter, 1967 [46])

1.4.1 Cơ chế sinh bệnh

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2008)[16] bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò phát triển như sau: Bệnh tụ huyết trùng phát sinh ở các vùng nóng ẩm Vào mùa mưa, vi khuẩn có sẵn trong đất, được nước mưa đưa lên mặt đất, dính vào rơm, cỏ và trôi vào các hồ, ao, mương, máng Trâu bò ăn phải rơm cỏ và uống nước có nhiễm khuẩn sẽ mắc bệnh

Bình thường một số trâu bò khỏe cũng mang vi khuẩn tụ huyết trùng trong hệ thống hô hấp và tiêu hóa Nhưng vi khuẩn không gây bệnh và súc vật

có sức đề kháng cao, giữa vi khuẩn và súc vật có sự cân bằng sinh học

Khi gặp các yếu tố ngoại cảnh bất lợi: Thiếu thức ăn, làm việc nặng, thời tiết thay đổi đột ngột, trâu bò bị giảm sức đề kháng, thế cân bằng sinh học bị phá vỡ và vi khuẩn trở nên cường độc, gây bệnh cho trâu bò

Sau khi vào đường tiêu hóa, vi khuẩn qua niêm mạc nhờ các vết xây xát nhỏ do rơm cỏ, xâm nhập vào máu, tiến đến hệ thống lâm ba ruột và hạch sau hầu Thường hạch sau hầu sưng rất to Từ đó vi khuẩn đi vào hệ thống hạch lâm ba trước vai, trước đùi làm cho những hạch này sưng và thủy thũng Bởi vậy ta thường thấy trâu, bò bị bệnh tụ huyết trùng có biểu hiện đặc trưng:

Sưng hầu mà nhân dân gọi là “bệnh trâu hai lưỡi”

Sự tồn tại của vi khuẩn ở đường hô hấp và tiêu hóa của gia súc khỏe, khi gia súc bị yếu vi khuẩn sẽ trỗi dậy và gây bệnh

1.4.2 Biểu hiện đặc trưng của trâu bò mắc bệnh tụ huyết trùng

+ Triệu chứng lâm sàng

Theo Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân (2002)[15] Trâu bò mắc bệnh

ở 3 thể: Thể ác tính (quá cấp tính), cấp tính (thường gặp) và thể mãn tính

- Thể ác tính (quá cấp tính): Thể này thường ít gặp Trâu bò phát bệnh

rất nhanh: Con vật đột nhiên lên cơn sốt cao (41 - 420C) và trở nên hung giữ,

điên loạn, đập đầu vào tường, có thể chết trong 24 giờ Ở một số ổ dịch, một

số bê nghé 3 - 18 tháng có triệu chứng thần kinh, dãy giụa, rồi ngã xuống đất chết; Có khi con vật đang ăn cỏ lồng lên, điên loạn, run rẩy, ngã xuống và lịm

đi Ở xã Tư Đình (Gia Lâm - Hà Nội) đã thấy bò sữa trong dân bị chết đột

to, làm cho con vật lè lưỡi ra, thở khó khăn, người ta thường gọi là “Bệnh lưỡi

đòng” hay bệnh trâu bò hai lưỡi Hạch lâm ba trước vai, trước đùi sưng, thủy

thũng làm cho con vật đi lại khó khăn

Vật bệnh thể hiện hội chứng hô hấp, thở mạnh và khó khăn do viêm màng phổi, tràn dịch màng phổi, có tụ huyết và viêm phổi cấp

Một số trâu bò bị bệnh thể đường ruột lúc đầu phân táo bón sau đó đi

ỉa chảy dữ dội, phân có lẫn máu và niêm mạc ruột Bụng con vật chướng to

viêm phúc mạc và có tương dịch trong xoang bụng

Lúc sắp chết, con vật nằm liệt, đái ra máu, thở rất khó khăn, có nhiều chấm xuất huyết đỏ sẫm ở các niêm mạc Bệnh tiến triển từ 3 - 5 ngày Tỷ lệ chết 90 - 100% Nếu bệnh chuyển sang nhiễm trùng máu thì con vật sẽ chết trong thời gian 24 - 36 giờ

- Thể mãn tính: Con vật giai đoạn đầu mắc bệnh thể cấp tính, nếu

không chết bệnh sẽ chuyển thành mãn tính, vật bệnh thể hiện viêm ruột mãn tính: lúc ỉa chảy, lúc táo bón, viêm khớp làm cho con vật đi lại khó khăn, viêm phế quản và viêm phổi mãn tính

Bệnh tiến triển trong vài tuần Con vật có thể khỏi bệnh, các triệu chứng nhẹ dần, nhưng thường con vật rạc và chết do kiệt sức

- Thịt màu tím hồng, thấm nhiều nước

- Hệ thống hạch lâm ba sưng to, thủy thũng và xuất huyết, rõ nhất là hạch lâm ba sau hầu, vai và trước đùi

- Tim sưng to, trong bao tim, màng phổi, xoang ngực và xoang bụng

đều có tương dịch

- Nếu con vật bị bệnh thể đường ruột thì thấy: chùm hạch ruột sưng to có xuất huyết, niêm mạc ruột tụ huyết, xuất huyết nặng và niêm mạc ruột bị tróc ra Theo một số tác giả khác thì bệnh tích của bệnh tụ huyết trùng trâu bò

có những biểu hiện cụ thể như sau:

- Bệnh tích chung: Tụ huyết, xuất huyết ở các tổ chức liên kết dưới da Bắp thịt và niêm mạc lấm tấm xuất huyết, màu hồng tím

- Bệnh tích ở ngực: Thủy thũng trong lồng ngực có nước vàng Màng phổi lấm tấm xuất huyết, viêm phổi, viêm ngoại tâm mạc có nước, viêm tim

1.5 Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh

Theo thuật ngữ của Louis Pasteur dùng từ năm 1885 thì “vắc xin” dùng

để chỉ một chế phẩm sinh học được chế từ vi sinh vật, để gây miễn dịch phòng

bệnh truyền nhiễm Ngày nay không chỉ có vắc xin phòng bệnh truyền nhiễm

mà còn có vắc xin phòng ký sinh trùng, vì vậy thuật ngữ vắc xin được hiểu rộng hơn, đó là một chế phẩm sinh học chứa vật chất của mầm bệnh gọi là

"kháng nguyên" khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra trạng thái miễn dịch giúp cơ thể chống lại mầm bệnh - tức kháng nguyên

Theo Van Oirchot (1993)[82], tiêu chí để chọn một vắc xin tốt phòng bệnh cho động vật cần phải đạt các yêu cầu sau đây:

- Không được gây phản ứng toàn thân Có thể gây phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện của phản ứng cục bộ phải biến mất 24 giờ sau khi tiêm phòng

- Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài

- Sử dụng và bảo quản dễ dàng

- Giá thành rẻ

Chương 2

NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu bò tại Cao Bằng

- Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại Cao Bằng từ năm 2008 - 2011

- Tần xuất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại Cao Bằng từ năm

2008 - 2011

- Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng ở loài gia súc,

mùa vụ, lứa tuổi, vùng địa lý

- Triệu chứng, bệnh tích đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng

- Nghiên cứu mối tương quan của thời tiết khí hậu của Cao Bằng đến tỷ

lệ mắc bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò

2.1.2 Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng

- Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P

multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe trong ổ dịch cũ

- Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P

multocida từ các mẫu bệnh phẩm của trâu, bò mắc bệnh

- Xác định serotype vi khuẩn P multocida phân lập được

- Xác định độc lực của các chủng P multocida phân lập được

- Thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hoá dược của vi khuẩn P

multocida phân lập được được

- Đánh giá mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng

bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn P multocida ở trên

thực địa

2.1.3 Đánh giá hiệu lực bảo hộ của một số loại vắc xin phòng bệnh tụ huyết trung trâu, bò trên thực địa

- Xác định tình trạng miễn dịch chủ động tự nhiên đối với kháng

nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida của trâu, bò trong ổ dịch cũ

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng nhũ hóa của Công ty Navetco

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng keo phèn Xí nghiệp Phùng

- So sánh sự an toàn và hiệu quả phòng bệnh của hai loại vắc xin nhũ hóa dầu và keo phèn trên thực địa

2.1.4 Lựa chọn vắc xin và đề xuất biện pháp khống chế bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng

2.2 Vật liệu dùng cho nghiên cứu

2.2.1 Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn

Dịch ngoáy mũi lấy từ trâu, bò khỏe mạnh không có triệu chứng lâm sàng Thu thập bệnh phẩm là máu tim, phổi, tủy xương trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng

2.2.2 Động vật thí nghiệm

- Chuột bạch khỏe mạnh, có trọng lượng từ 18-22 gam/con

- Trâu, bò khỏe mạnh không mắc bệnh tụ huyết trùng và chưa được tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng

2.2.3 Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

2.2.3.1 Hóa chất thí nghiệm

- Hóa chất dùng để nhuộm Gram

- Dung dịch tím tinh thể Crystal violet

- Dung dịch đỏ Fucshin

- Cồn Axeton

- Dung dịch Lugol

- Nước cất

- Hóa chất để thử phản ứng sinh hóa

- Thuốc thử phản ứng Indol (dung dịch Kowacs): 5 gam paramino demethyl bezada trộn với 75 ml cồn Butylic hoặc Izoamylie đặt vào nồi đun cách thủy 50-600C Sau đó cho từ từ từng giọt 25ml HCl đặc, để qua đêm đến khi xuất hiện màu vàng

- Thuốc thử phản ứng Catalasa: Dùng H2O2 3%

- Giấy thử Oxydase do Úc sản xuất: Dung dịch Phinylane diamine dihydrochloride 1%, để ở nhiệt độ phòng, giấy lọc được cắt thành giải, nhúng vào dung dịch để khô và giữ ở 400C

Tetramenthyip Các loại đường để thử phản ứng: Glucosa, Fructosa, Lactosa, Mannit, Dulciton, Manitol

- Giấy thử kháng sinh đồ: Giấy thử kháng sinh đồ của công ty Nam Khoa Thành phố Hồ Chí Minh

- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

- Môi trường thạch thường Plate Count Agar

- Môi trường thạch máu Blood base Agar

- Môi trường thạch MacConkey Agar

- Môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHI)

- Môi trường Nutrient broth

- Môi trường thạch nghiêng Triple sugar iron agar (TSI)

- Thạch Mueller Hilton Agar

2.2.3.2 Dụng cụ thí nghiệm

- Các trang thiết bị, máy móc có tại bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên; bộ môn vi trùng - Viện thú y Việt Nam và Trung tâm chẩn đoán thú y - Cục thú y Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

Phương pháp tính tỷ lệ và hệ số gia súc mắc bệnh

* Tỷ lệ mắc bệnh và chết trong năm nghiên cứu

- Tỷ lệ mắc bệnh chung (TLMBC)

Số động vật mắc bệnh TLMBC (%) = ×100

Tổng đàn loài động vật đó Thời kỳ là 1 tháng, 1 năm, 5 năm, 10 năm tùy theo năm nghiên cứu

- Tỷ lệ mắc bệnh ở đàn đe dọa

Số con mắc bệnh TLMB (%)= ×100

Tổng đàn bị đe dọa Tổng đàn đe dọa là tổng số vật nuôi trong phạm vi xã, huyện, tỉnh ở cùng thời kỳ nghiên cứu, kể cả những vật nuôi không mắc bệnh của vùng nghiên cứu nằm trong vùng chịu ảnh hưởng của dịch

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P multocida

2.3.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập

* Phương pháp lấy mẫu: Lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe

Dùng que đầu quấn bông thấm đã được hấp vô trùng ngoáy sâu vào mũi trâu, bò để thấm dịch tiết, cho que bông vào ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý 0,9% đã hấp vô trùng, đậy nút, ghi nhãn, đánh số thứ tự rồi đưa

về phòng thí nghiệm (mẫu được cho vào phích lạnh khi vận chuyển) Sau khi mang về phòng thí nghiệm, mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C

Bệnh phẩm: Lấy mẫu máu tim, gan, tủy xương trâu, bò nghi mắc bệnh

tụ huyết trùng, được bảo quản lạnh đem về phòng thí nghiệm

* Phương pháp nuôi cấy phân lập

Mẫu bệnh phẩm được ria cấy trực tiếp lên các môi trường thông thường

và đặc biệt như nước thịt, thạch máu, MacConkey, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn khuẩn lạc điển hình đem nuôi cấy lại trên các môi trường chon lọc để thuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi

khuẩn Khuẩn lạc của P multocida được xác định theo tiêu chuẩn của

Hedleston và cs (1966) [56]

2.3.2.2 Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của P multocida

* Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

- Cố định tiêu bản: Lấy một phiến kính sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dung que cấy lấy một khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọt nước sinh lý Sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm: Nhỏ một giọt tím tinh thể (crystian violet) để 1 phút, cố định màu bằng dung dịch lugol, để 1 phút, rửa nhanh bằng nước cất Nhuộm lại tiêu bản bằng dung dịch đỏ fucxin, để 2 phút Rửa nhanh bằng nước cất, để khô tự nhiên