luận án tiến sĩ nông nghiệp phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của mycoplasma gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn đoán(1)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN THÚ Y ĐÀO THỊ HẢO PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN THÚ Y ĐÀO THỊ HẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 62 42 50 10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS-TS. CÙ HỮU PHÚ TS. NGUYỄN NGỌC NHIÊN HÀ NỘI - 2008 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy PGS-TS Cù Hữu Phú và TS Nguyễn Ngọc Nhiên, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận Án. Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Thú y, cùng các Phòng, Bộ môn, Cơ sở Đào tạo sau đại học, đặc biệt là Bộ môn Vi trùng, đã tạ o điều kiện cho tôi thực hiện các đề tài khoa học và tiến hành các thí nghiệm liên quan đến Luận Án. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS-TS Trương Văn Dung Giám đốc dự án Jica, GS Kanameda, M., Mr. Kishima, M., Chuyên gia Dự án cũng như Mrs. Imada,I., Viện Thú y Nhật Bản, đã tạo điều kiện cho tôi đến thực tập và triển khai nghiên cứu, chẩn đoán về Mycoplasma là nội dung chính của Luận Án. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới GS-TS Phan Thanh Ph ượng, người thầy đã cho tôi những định hướng nghiên cứu đầu tiên của Luận Án. Tôi luôn ghi nhớ công ơn của cố PGS-TS Lê Văn Tạo, người thầy luôn quan tâm từng bước trong quá trình hoàn thành Luận Án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo cùng cán bộ, nhân viên thuộc Trung tâm Nghiên cứu gia cầm, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Quốc gia, Trạm Nghiên cứu và thử nghiệm thúc ăn gia súc Viện Chăn nuôi, đã tạo điều kiện cho tôi th ực hiện các nội dung của Luận Án. Tôi xin cảm ơn tất cả các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp, gia đình và bè bạn, đặc biệt là chồng và hai con tôi, đã luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành Luận Án. Tác giả Luận Án LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu có sự hợp tác và giúp đỡ của tập thể trong và ngoài cơ quan, tôi chưa hề sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu trong bản luận án này Hà Nội, ngày 04 tháng 06 năm 2008 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic Bp Base pair CFU Colony Forming Unit CRD Chronic Respiratory Disease cs Cộng sự GI Growth Inhibition HA Haemagglutination HI HT Haemagglutination inhibition Huyết thanh IFA Indirect Fluorescent Antibody IP Immunoperoxydase IS Infectious Sinusitis hay IS KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên MA Mycoplasma Agar MB Mycoplasma Broth MG Mycoplasma gallisepticum MI Mycoplasma ioawe MIT Metabolism Inhibiton Test MM Mycoplasma meleagridis MS Mycoplasma synoviae NDY Nitten Dry Yeast OIE Office International des Epizooties PBS Photsphat Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PPLO Pleuro - Pneumo Like - Organism RFLP RA Restriction Flagment Length Polymorphism Rapid Agglutination RPA Rapid Plate Agglutination RSA Rapid Slice Agglutination WB Whole Blood Test MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục ảnh Danh mục bảng Phần mở đầu 1 A. Tính cấp thiết của đề tài 1 B. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 Ý nghĩa khoa học 2 Ý nghĩa thực tiễn 3 C. Những đóng góp mới của luận án 3 Phần nội dung 4 Chương 1. Tổng quan tài liệu 4 1.1 Nhữ ng nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum(MG) 4 1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma 4 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG 10 1.1.3 Đặc tính nuôi cấy của MG 11 1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG 11 1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG 12 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm 14 1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới 14 1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam 16 1.3 Bệnh do Mycoplasma ở gà 18 1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 18 1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh 22 1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng tới dịch tễ 22 1.3.4 Triệu chứng của bệnh 23 1.3.5 Bệnh tích 26 1.3.6 Chẩn đoán 29 1.3.7 Điều trị 34 1.3.8 Biện pháp khống chế bệnh 35 1.4 Đặc tính miễn dịch của cơ thể gà trong bệnh do Mycoplasma 39 1.4.1 Đặc đ iểm về sự di truyền của các globulin miễn dịch từ mẹ sang con 39 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch 41 Chương 2. Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 43 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 2.1.2 Chế tạo và sử dụng kháng nguyên tự chế để xác định tỷ lệ nhiễm b ệnh Chronic Respiratory Disease (CRD) ở một số cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp 2.1.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae (MS) phân lập được 43 43 43 43 2.2 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 43 43 2.2.2 Nguyên liệu 2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 44 45 2.3 Phương pháp nghiên cứu 45 2.3.1 Phương pháp lấy và xử lý mẫu 45 2.3.2 Phương pháp phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 45 2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 48 2.3.4 Phương pháp xác định kháng nguyên 49 2.3.5 Phương pháp phát hiện MG bằng phản ứng nhân gen Polymerase Chain Reaction (PCR) 51 2.3.6 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà 54 2.3.7 Phương pháp chế kháng nguyên MG 57 2.3.8 Phương pháp chế kháng huyết thanh tối miễn dị ch qua thỏ 59 2.3.9 Các phương pháp xử lý số liệu 61 Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 62 3.1 Kết quả phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn MG, MS 62 3.1.1 Xác định vi khuẩn MG, MS trên các mẫu bệnh phẩm 62 3.1.2 Giám định vi khuẩn MG, MS phân lập được 72 3.1.3 Gây nhiễm bằng MG trên gà để chọn chủng chế kháng nguyên 84 3.2 Chế kháng nguyên MG và đánh giá chất lượng kháng nguyên MG 89 3.2.1 Kết quả chế kháng nguyên 89 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 92 3.2.3 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan 93 3.2.4 Đánh giá chất lượng của kháng nguyên MG tự chế, so sánh với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan 94 3.2.5 Xác định tỷ lệ nhiễm MG ở một số giống gà bằng kháng nguyên tự chế 101 3.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi khuẩn MG, MS phân lập được 106 3.3.1 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán 106 3.3.2 Ứng dụng kháng huyết thanh tự chế để xác định vi khuẩn MG, MS phân lập được 110 Kế t luận và đề nghị 112 I. Kết luận 112 II. Đề nghị 112 Các công trình liên quan 113 Tài liệu tham khảo 114 Phụ lục 133 DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG SỐ TÊN BẢNG TRANG 1.1 Các đặc điểm phân biệt của giống Mycoplasma 7 1.2 Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật 8 1.3 Các loài Mycoplasma phân lập từ gia cầm 9 1.4 Đặc điểm và tính chất của các serotype Mycoplasma ở gia cầm 15 1.5 Tính chất sinh hoá của Mycoplasma ở gia cầm 16 2.1 Thành phần các chất trong phản ứng PCR xác định MG, MS 53 2.2 Điều kiện trong phản ứng PCR xác định MG, MS 53 2.3 Gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà 55 2.4 Quy trình gây miễn dịch trên thỏ 60 3.1 Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng theo lứa tuổi 63 3.2 Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng ở các cơ sở chăn nuôi 67 3.3 Phân lập vi khuẩn MG, MS từ mẫu phổi 70 3.4 Kiểm tra một số đặc tính sinh hoá và khả năng lên men đường của các chủng MG, MS phân lập được 76 3.5 Giám định các chủng MG, MS phân lập bằng phương pháp phát hiện kháng thể 77 3.6 Giám định các chủng MG, MS phân lập bằng phương pháp xác định kháng nguyên 78 3.7 Giám định vi khuẩn phân lập được bằng phản ứng PCR 81 3.8 Kết quả giám định serotype của các chủng MG phân lập 83 [...]... khuẩn, xác định các đặc tính gây bệnh của mầm bệnh, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của Mycoplasma gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn đoán” B Ý nghĩa khoa học và thực... thanh cho chẩn đoán bệnh 3 2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: - Đưa ra các phương pháp chẩn đoán và giám định Mycoplasma, có thể xây dựng thành quy trình thường quy - Chế tạo thành công chế phẩm kháng nguyên và kháng huyết thanh giúp cho việc chẩn đoán Mycoplasmosis nhanh và chi phÝ giảm so với việc sử dụng các chế phẩm tương tự ngoại nhập C Những đóng góp mới của luận án: Luận án đã có một số đóng góp... ở một số giống gà 101 3.21 Kết quả kiểm tra tỷ lệ nhiễm CRD bằng KN tự chế và xác định vi khuẩn MG từ dịch họng bằng phương pháp PCR 102 3.22 Kết quả xác định kháng thể trong máu của gà được tiêm vacxin Nobilis® MGINAC 103 3.23 Thu hoạch kháng huyết thanh 107 3.24 Kiểm tra chất lượng kháng huyết thanh bằng phản ứng ngưng kết nhanh 107 3.25 Xác định hiệu giá ngưng kết của kháng huyết thanh 108 3.26 Xác. .. nguyên tự chế với kháng nguyên Intervet 94 3.16 So sánh sự ngưng kết giữa các lô KN tự chế và KN Intervet bằng phản ứng ngưng kết toàn huyết 95 3.17 So sánh sự ngưng kết giữa KN tự chế và KN Intervet bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh nhanh 96 3.18 Xác định nồng độ tối ưu của KN tự chế với huyết thanh dương tính 98 3.19 Xác định hiệu giá ngưng kết của huyết thanh dương tính bằng KN tự chế và KN Intervet-... pháp chẩn đoán khác nhau sau gây nhiễm MG 85 3.10 Đánh giá kết quả của các phương pháp sau 35 ngày gây nhiễm 86 3.11 Kết quả giám định vi khuẩn 88 3.12 Xác định độ thuần khiết, vô trùng của canh khuẩn chế kháng nguyên 91 3.13 Kết quả xác định khả năng ngưng kết ở các lô KN trước và sau khi bảo quản trong tủ lạnh 92 3.14 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 93 3.15 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế. .. Mycoplasma có xu hướng khá đặc trưng cho từng loài vật chủ, phân bố của bệnh trên toàn thế giới, có nhiều loài phân lập được từ chim và động 9 vật mà tình trạng bệnh hiện tại chưa xác định được Mycoplasma thường bám chắc vào các màng nhầy của vật chủ và một số khác cố định vào các tế bào bằng cấu trúc đặc hiệu Vi khuẩn sống ngoài tế bào, sản sinh ra hemolysine, và một số yếu tố độc tố dẫn tới gây chết... - S M synoviae + + + + - + + Dựa vào các đặc tính sinh hoá và gây bệnh của mầm bệnh, người ta đã phân biệt được các loài Mycoplasma gây bệnh cho gia cầm ở các mức độ khác nhau Các đặc tính sinh hoá và gây bệnh của các loài Mycoplasma được tóm 16 tắt nêu như bảng 1.5 Bảng 1.5: Tính chất sinh hoá của Mycoplasma ở gia cầm (Theo Razin và cs, 1998) [123] Loài Mycoplasma M gallisepticum M synoviae M gallinarum... sau: - Phân lập và xác định được các chủng Mycoplasma phổ biến gây bệnh trên đàn gà nuôi tại Việt Nam - Kết quả nghiên cứu là cơ sở để xây dựng phương pháp thường quy chẩn đoán bệnh do Mycoplasma - Lần đầu tiên nghiên cứu chế tạo được kháng nguyên và kháng huyết thanh phục vụ chẩn đoán bệnh do Mycoplasma ở gà tại nước ta 4 PHẦN NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma. .. các loài Mycoplasma gây bệnh đường hô hấp mãn tính ở gà đều thuộc týp huyết thanh A, đặc trưng là chủng S6 (Zander, 1961)[160] Nhưng theo Adler và cs (1958)[24] cho rằng có ít nhất hai týp huyết thanh ở gà và gà tây Cho đến năm 1964 đã phát hiện ra 12 týp huyết thanh khác nhau của các mầm bệnh và được đặt theo thứ tự ABC tới L Theo Yoder, (1990)[157], đặc điểm và tính chất týp huyết thanh của MG được... trên sự sụt giảm pH của môi trường nuôi cấy là đủ Tuy nhiên trong một số trường hợp các Mycoplasma phát triển chậm hoặc một số ít trường hợp các Mycoplasma vừa có khả năng phân hoá glucoza vừa có khả năng thuỷ phân Arginine, phải tiến hành những test cụ thể hơn về sự chuyển hoá glucoza (Edward và Moore, 1974)[50] 1.1.5.2 Xác định khả năng thuỷ phân Arginine Một số loài Mycoplasma thuỷ phân Arginine nhờ . ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC THÚ. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN THÚ Y ĐÀO THỊ HẢO PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH. cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: " ;Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của Mycoplasma gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn