luận án tiến sĩ nông nghiệp phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của mycoplasma gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn đoán(1)

Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 43 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của MG 2.1.2 Chế tạo và sử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN THÚ Y

ĐÀO THỊ HẢO

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG

NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2008

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN THÚ Y

ĐÀO THỊ HẢO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA MYCOPLASMA GALLISEPTICUM VÀ CHẾ KHÁNG

NGUYÊN, KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành công trình nghiên cứu khoa học này, cùng với sự nỗ lực

cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy PGS-TS Cù Hữu Phú và TS Nguyễn Ngọc Nhiên, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận Án

Tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Thú y, cùng các Phòng, Bộ môn, Cơ

sở Đào tạo sau đại học, đặc biệt là Bộ môn Vi trùng, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các đề tài khoa học và tiến hành các thí nghiệm liên quan đến Luận

Án

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS-TS Trương Văn Dung Giám đốc dự án Jica, GS Kanameda, M., Mr Kishima, M., Chuyên gia Dự án cũng như Mrs Imada,I., Viện Thú y Nhật Bản, đã tạo điều kiện cho tôi đến thực tập và triển khai nghiên cứu, chẩn đoán về Mycoplasma là nội dung chính của Luận Án

Tôi xin được chân thành cảm ơn tới GS-TS Phan Thanh Phượng, người thầy đã cho tôi những định hướng nghiên cứu đầu tiên của Luận Án

Tôi luôn ghi nhớ công ơn của cố PGS-TS Lê Văn Tạo, người thầy luôn quan tâm từng bước trong quá trình hoàn thành Luận Án

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo cùng cán bộ, nhân viên thuộc Trung tâm Nghiên cứu gia cầm, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Quốc gia, Trạm Nghiên cứu và thử nghiệm thúc ăn gia súc Viện Chăn nuôi, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các nội dung của Luận Án

Tôi xin cảm ơn tất cả các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp, gia đình

và bè bạn, đặc biệt là chồng và hai con tôi, đã luôn động viên giúp đỡ tôi hoàn thành Luận Án

Tác giả Luận Án

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là hoàn toàn trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu có sự hợp tác và giúp

đỡ của tập thể trong và ngoài cơ quan, tôi chưa hề sử dụng để bảo vệ một học

vị nào

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về số liệu trong bản luận án này

Hà Nội, ngày 04 tháng 06 năm 2008

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleic

Bp Base pair

CFU Colony Forming Unit

CRD Chronic Respiratory Disease

NDY Nitten Dry Yeast

OIE Office International des Epizooties

PBS Photsphat Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PPLO Pleuro - Pneumo Like - Organism

RFLP

RA

Restriction Flagment Length Polymorphism

Rapid Agglutination

RPA Rapid Plate Agglutination

RSA Rapid Slice Agglutination

WB Whole Blood Test

MỤC LỤC Trang phụ bìa

Lời cam đoan

B Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Ý nghĩa khoa học 2

Ý nghĩa thực tiễn 3

1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum(MG) 4

1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma 4

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG 10

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm 14

1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới 14

1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam 16

1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh 18

1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh 22

1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng tới dịch tễ 22

1.3.4 Triệu chứng của bệnh 23

1.3.6 Chẩn đoán 29 1.3.7 Điều trị 34 1.3.8 Biện pháp khống chế bệnh 35

1.4 Đặc tính miễn dịch của cơ thể gà trong bệnh do Mycoplasma 39

1.4.1 Đặc điểm về sự di truyền của các globulin miễn dịch từ mẹ

sang con

39

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự đáp ứng miễn dịch 41

Chương 2 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 43

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính

sinh vật hoá học của MG

2.1.2 Chế tạo và sử dụng kháng nguyên tự chế để xác định tỷ lệ

nhiễm bệnh Chronic Respiratory Disease (CRD) ở một số cơ sở

chăn nuôi gà công nghiệp

2.1.3 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán và ứng dụng xác định vi

khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG), Mycoplasma synoviae

2.2 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

43

43

2.2.2 Nguyên liệu

2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

44

45 2.3 Phương pháp nghiên cứu 45 2.3.1 Phương pháp lấy và xử lý mẫu 45

2.3.2 Phương pháp phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy,

2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 48

2.3.4 Phương pháp xác định kháng nguyên 49

2.3.5 Phương pháp phát hiện MG bằng phản ứng nhân gen

Polymerase Chain Reaction (PCR)

3.1 Kết quả phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính

sinh vật hoá học của vi khuẩn MG, MS

62

3.1.1 Xác định vi khuẩn MG, MS trên các mẫu bệnh phẩm 62

3.1.2 Giám định vi khuẩn MG, MS phân lập được 72

3.1.3 Gây nhiễm bằng MG trên gà để chọn chủng chế kháng nguyên 84

3.2 Chế kháng nguyên MG và đánh giá chất lượng kháng nguyên MG 89

3.2.2 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 92

3.2.3 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng nguyên

của hãng Intervet- Hà Lan

93

3.2.4 Đánh giá chất lượng của kháng nguyên MG tự chế, so sánh

với kháng nguyên của hãng Intervet- Hà Lan

3.3.1 Chế kháng huyết thanh chẩn đoán 106

3.3.2 Ứng dụng kháng huyết thanh tự chế để xác định vi khuẩn

Tài liệu tham khảo 114

Phụ lục 133

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các đặc điểm phân biệt của giống Mycoplasma 7

1.2 Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật 8

1.3 Các loài Mycoplasma phân lập từ gia cầm 9

1.4 Đặc điểm và tính chất của các serotype Mycoplasma

2.2 Điều kiện trong phản ứng PCR xác định MG, MS 53

2.3 Gây nhiễm thực nghiệm MG trên gà 55

3.1 Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng theo

3.2 Xác định vi khuẩn MG, MS từ máu và dịch họng ở

các cơ sở chăn nuôi

67

3.4 Kiểm tra một số đặc tính sinh hoá và khả năng lên

men đường của các chủng MG, MS phân lập được

3.7 Giám định vi khuẩn phân lập được bằng phản ứng PCR 81

3.8 Kết quả giám định serotype của các chủng MG phân lập 83

3.9 Ứng dụng các phương pháp chẩn đoán khác nhau sau

3.13 Kết quả xác định khả năng ngưng kết ở các lô KN

trước và sau khi bảo quản trong tủ lạnh

92

3.14 Xác định độ đặc hiệu của kháng nguyên 93

3.15 So sánh độ nhạy của kháng nguyên tự chế với kháng

nguyên Intervet

94

3.16 So sánh sự ngưng kết giữa các lô KN tự chế và KN

Intervet bằng phản ứng ngưng kết toàn huyết

95

3.17 So sánh sự ngưng kết giữa KN tự chế và KN Intervet

bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh nhanh 96

3.18 Xác định nồng độ tối ưu của KN tự chế với huyết

3.22 Kết quả xác định kháng thể trong máu của gà được

tiêm vacxin Nobilis® MGINAC 103

3.23 Thu hoạch kháng huyết thanh 107

3.24 Kiểm tra chất lượng kháng huyết thanh bằng phản

3.25 Xác định hiệu giá ngưng kết của kháng huyết thanh 108 3.26 Xác định kháng huyết thanh bằng phản ứng kết tủa

3.27 Ứng dụng KHT MG, KHT MS tự chế để xác định

các chủng Mycoplasma phân lập được

110

3.4 Giám định MG, MS phân lập bằng phương pháp PCR 82

3.5 Khuẩn lạc MG, MS nhuộm Immunoperoxidaza 133

3.6 Phản ứng lên men đường 134 3.7 Phản ứng khuếch tán trên thạch 134

3.9 Huyết thanh làm phản ứng ngưng kết nhanh 135

3.10 Phản ứng ngưng kết và ức chế ngưng kết hồng cầu 135

3.12 Giết thỏ thu hoạch kháng huyết thanh 136

3.13 Chuẩn bị cấy chuyển giống chế kháng nguyên 136

3.14 Kiểm tra giống trên môi trường MA 137

3.15 Kết quả phản ứng ngưng kết khi pha loãng kháng nguyên 137

3.16 Sản phẩm kháng nguyên MG tự chế 137

PHẦN MỞ ĐẦU

A Tính cấp thiết của đề tài

Trong sự phát triển kinh tế xã hội và tiêu dùng, với khoảng trên dưới

250 triệu gia cầm hàng năm, ngành chăn nuôi gia cầm đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm ở nước ta

Chính sách kinh tế thị trường mở cửa đã góp phần thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng, cũng như sự cạnh tranh mãnh liệt về mọi mặt trong ngành chăn nuôi gia cầm, nhưng sự thiếu kiểm soát chặt chẽ việc vận chuyển động vật và sản phẩm động vật xuyên biên giới hay từ vùng này sang vùng khác, đã dẫn đến việc du nhập và xuất hiện nhiều loại bệnh mới ở nước ta Bệnh dịch

đã làm ảnh hưởng rất lớn và nhiều mặt đối với sự phát triển kinh tế xã hội, hoạt động thương mại và sức khỏe con người

Chính vì thế, công tác kiểm dịch và phòng chống bệnh ngày càng được quan tâm Bên cạnh việc tập trung kiểm soát và khống chế các bệnh mới xuất hiện như dịch cúm gia cầm, nổ ra từ cuối năm 2003, các bệnh truyền nhiễm như hội chứng giảm đẻ ở gà (Egg Drop Syndrome), bệnh viêm khí quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis), bệnh viêm sổ mũi truyền nhiễm (Infectious Coryza) … cũng dần được khống chế Song, vì nhiều lí do khác nhau, việc nghiên cứu chuyên sâu một số bệnh vẫn còn hạn chế, trong đó có

bệnh do Mycoplasma ở gia cầm, nguyên nhân chính là Mycoplasma gallisepticum (MG) gây ra

Bệnh làm giảm sức đề kháng của gà, giảm chất lượng và tỷ lệ thịt xẻ của đàn gà thịt Trong đàn mái đẻ, bệnh ở dạng ẩn tính làm giảm tỷ lệ trứng, tăng tỷ lệ chết phôi trong quá trình ấp nở hoặc gà con nở ra không khoẻ mạnh Đối với gà con, bệnh gây chết tỷ lệ không cao, chủ yếu là giảm khả năng sinh trưởng làm cho gà kém phát triển và tiêu tốn nhiều thức ăn trong chăn nuôi,

tạo cơ hội cho các bệnh khác phát triển

Với các trại gà lớn, việc chẩn đoán chủ yếu dựa vào triệu chứng và bệnh tích mà triệu chứng của bệnh chủ yếu ở dạng ẩn tính, biểu hiện không rõ ràng nên gây nhiều khó khăn cho người làm công tác thú y

Ở một số trại gà giống, việc chẩn đoán bằng phản ứng ngưng kết nhanh

đã được thực hiện, nhưng kháng nguyên Mycoplasma dùng để chẩn đoán vẫn

phải nhập từ nước ngoài với giá thành cao nên ảnh hưởng đến lợi ích kinh tế cho người chăn nuôi

Bên cạnh đó, các loại kháng huyết thanh dùng để định týp vi khuẩn trong phòng thí nghiệm cũng phải nhập ngoại nên không được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm

Trong công tác chẩn đoán, việc phân lập ra vi khuẩn, xác định các đặc tính gây bệnh của mầm bệnh, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài:

"Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học của Mycoplasma gallisepticum và chế kháng nguyên, kháng huyết thanh chẩn đoán”

B Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1 Kết quả nghiên cứu của đề tài có những ý nghĩa khoa học sau đây:

- Bổ sung những tư liệu về bệnh do Mycoplasma ở gà trong điều kiện

chăn nuôi hiÖn nay ở Việt Nam

- Xác định được các chủng Mycoplasma phổ biến gây bệnh trên đàn gà

chăn nuôi cụ thể ở Việt Nam và vai trò của chúng trong hội chứng bệnh đường hô hấp của gà

- Nghiên cứu được quy trình chế tạo kháng nguyên, kháng huyết thanh cho chẩn đoán bệnh

2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

- Đưa ra các phương pháp chẩn đoán và giám định Mycoplasma, có thể

xây dựng thành quy trình thường quy

- Chế tạo thành công chế phẩm kháng nguyên và kháng huyết thanh giúp cho việc chẩn đoán Mycoplasmosis nhanh và chi phÝ giảm so với việc sử dụng các chế phẩm tương tự ngoại nhập

C Những đóng góp mới của luận án:

Luận án đã có một số đóng góp mới sau:

- Phân lập và xác định được các chủng Mycoplasma phổ biến gây bệnh

trên đàn gà nuôi tại Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu là cơ sở để xây dựng phương pháp thường quy

chẩn đoán bệnh do Mycoplasma

- Lần đầu tiên nghiên cứu chế tạo được kháng nguyên và kháng huyết

thanh phục vụ chẩn đoán bệnh do Mycoplasma ở gà tại nước ta

PHẦN NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nghiên cứu về mầm bệnh Mycoplasma gallisepticum (MG)

1.1.1 Một số điểm khái quát về Mycoplasma

Trong phân loại học, Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes (Mollis có

nghĩa là mềm, cutes có nghĩa là vỏ bọc, da) Lớp vi khuẩn này có khoảng 176 loài, chúng phân bố rộng trong tự nhiên gây bệnh ở động vật có vú, chim, bò sát, chân đốt, thực vật và cá (Dybvig và Voelker, 1996)[48]

Hệ thống phân loại của Mycoplasma trong lớp Mollicutes được xác

định như sau ( Razin và cs, 1998)[123] (xem sơ đồ trang bên)

Theo phân loại, Mycoplasma là vi sinh vật có vị trí xếp giữa vi khuẩn

và virus Mycoplasma là vi thể sống có thành tế bào không ổn định, chúng

được bao bọc bởi màng Plasma gồm các thành phần protein, glycoprotein, glycolipit và phospholipit, hình dạng lúc là hình cầu, hình xoắn, lúc là hình sợi hoặc vòng, kích thước tối thiểu có đường kính 0,3 μm nhưng do hình

dạng luôn thay đổi nên có thể qua lọc màng lọc 0,22 μm, Mycoplasma là vi

trùng có khả năng tự nhân đôi với kích thước nhỏ nhất (Yoder và Hofstad, 1964)[154], (Razin, 1992)[122]

Mycoplasma không giống với virus ở chỗ chúng có thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường nhân tạo không có tế bào Trước kia, Mycoplasma

thường bị nhầm với vi khuẩn dạng L (L-form bacteria), dạng vi khuẩn không

có thành tế bào, nhưng vi khuẩn dạng L không có sterols ở trong màng nguyên sinh và chúng có thể chuyển thành dạng có thành tế bào khi thay đổi môi trường sống

Để phân biệt giữa vi khuẩn dạng L-form với Mycoplasma có thể làm

như sau:

Mesoplasma

(12 loài)

Spiroplasma (33 loài)

Ureaplasma (6 loài)

- Cấy chuyển vi khuẩn nghi dạng L-form sang môi trường không có kháng sinh, vi khuẩn L-form sẽ trở lại khuẩn lạc bình thường có thể qua 5 lần cấy chuyển

- Nhuộm khuẩn lạc với thuốc nhuộm để nhận biết vi khuẩn và phân

biệt Mycoplasma với vi khuẩn dạng L-form, khuẩn lạc Mycoplasma giữ màu

thuốc nhuộm, khuẩn lạc vi khuẩn dạng L-form làm mất màu thuốc nhuộm

Mycoplasma có khả năng kháng lại những kháng sinh ức chế tổng hợp

thành tế bào, nhạy cảm với các chất tẩy, cồn, kháng thể, bổ thể (Maniloff và

cs, 1992)[98] Mycoplasma đòi hỏi thành phần dinh dưỡng khá nghiêm ngặt

trong quá trình nuôi cấy, có xu hướng thâm nhập và phát triển sâu vào trong môi trường thạch

Ảnh minh hoạ: Khuẩn lạc Mycoplasma

Không có bất cứ một loại môi trường nào có thể phù hợp với tất cả các

Mycoplasma, nhưng hầu hết các môi trường nuôi cấy Mycoplasma đều được

chuẩn bị từ các thành phần chính là nước chiết tim bê, péptôn, chất chiết nấm men, huyết thanh và các thành phần khác Nhu cầu cholesterol trong thành

phần môi trường nuôi cấy là một đặc điểm để phân loại Mycoplasma (Bảng

pH 7.5

Một số gắn với bệnh tật pH 6.0 Sản sinh Urea

thải Sống hoại sinh

động

Anaeroplasma v Dạ cỏ cừu và trâu bò Sống hội sinh, kỵ khí

(+): Cần Cholesterol; (-): Không cần Cholesterol;

v= Thay đổi về nhu cầu Cholesterol ĐV: Động vật TV: Thực vật

Các loài Mycoplasma gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp của người và

động vật, chúng tập trung ở niêm mạc, màng nhầy của vật chủ, trong khi đó

các giống Ureaplasma gây bệnh cho người và động vật chủ yếu ở đường tiết niệu và trong quá trình trao đổi chất, chúng cần urea, các giống Spiroplasma gây bệnh trên thực vật và côn trùng, còn các giống Acholeplasma gây bệnh

chủ yếu cho động vật, một số ít gây bệnh cho thực vật và côn trùng, ngoài ra chúng còn được tìm thấy ở ngoài tự nhiên như trong phân, nước cống

Cùng với khả năng gây bệnh trên người và động vật, Mycoplasma còn

có trong các chế phẩm sinh học như vacxin, môi trường nuôi cấy tế bào và gây ra những khó khăn rất lớn trong nghiên cứu cũng như trong công nghệ sinh học sử dụng tế bào nuôi

Các đại diện Mycoplasma gây bệnh ở một số động vật được trình bày ở

bảng 1.2

Viêm phổi M.mycoides,M.bovis, M.dispa Ureaplasmas

Viêm khớp M.bovis, M.bovigenitalium

Viêm vú M.bovis, M.canifornicum

Sảy thai M.bovis

Viêm âm đạo Ureaplasmas, M.bovigenitalium

Chưa xác định rõ M.bovirhinis M.alkalescens, M.arginini,

M.modicum, M.ladlawii, M.bovoculi, M.verecundum, M.canadense, Malvi

Lợn

Viêm phổi M.hyopneumoniae

Viêm khớp M.hyorhinis, M.hyosynoviae

Chưa xác định M.flocculare, M.suali, A.axanthum,

Agranulaeum, M.hyopharyngis,

Dê và cừu

Viêm phổi M.ovipneumoniae

Viêm phổi, viêm khớp, viêm vú M.mycoides, Loài phụ, Capi, M.mycoides, Loài phụ mycoide, Magalactiae, M.putrefaciens

Viêm màng kết viêm phổi, viêm

khớp, viêm vú

M.conjunctivae, M.capricolum

Chưa rõ M.arginini, M.oculi

Ngựa Chưa rõ M.equigentalum, M.equirhinis, M.subdolum

M.felis, M.arginini, M,salivrum, A.equifetable, Ahippikon, A.laidlawii

Viêm khớp M.arthitidis Rối loạn thần kinh M.neurolyticum

Chuột

lang

Chưa rõ M.caviae

Chó Viêm phổi M.cynos

Chưa rõ M.spumans, M.maculosum, M.edwardii,

M.molare, M.canis, M.opalescens

Mèo Viêm phổi M.felis, M.feliminutum, M.gateae

Các Mycoplasma có xu hướng khá đặc trưng cho từng loài vật chủ, phân

bố của bệnh trên toàn thế giới, có nhiều loài phân lập được từ chim và động

vật mà tình trạng bệnh hiện tại chưa xác định được Mycoplasma thường bám chắc vào các màng nhầy của vật chủ và một số khác cố định vào các tế bào bằng cấu trúc đặc hiệu Vi khuẩn sống ngoài tế bào, sản sinh ra hemolysine,

và một số yếu tố độc tố dẫn tới gây chết tế bào vật chủ hay gây nên bệnh mãn tính Đường hô hấp và phổi thường là nơi bị nhiễm trùng, Mycoplasma có khả năng phá huỷ các lông nhung ở đường hô hấp tạo điều kiện cho vi khuẩn kế phát xâm nhập Sự lây truyền bệnh thường qua giao phối, mẹ sang con hoặc qua không khí và rất quan trọng đối với gia cầm là truyền lây qua trứng Việc

xác định tương quan giữa vật chủ và Mycoplasma là mối quan tâm của nhiều

nhà nghiên cứu nhằm tạo ra hướng phòng trị bệnh có hiệu quả (Rosengarten, 2001)[131]

Giống Mycoplasma có nhiều loài, trên gia cầm 16 loài Mycoplasma

được phân lập từ gà và gà tây, 7 loài được phân lập từ ngỗng và vịt, một vài

loài được phân lập từ bồ câu (Stipkovits và Kempf, 1996)[139] (Bảng 1.3)

Bảng 1.3: Các loài Mycoplasma phân lập từ gia cầm

(Stipkovits và Kempf, 1996)[139]

Loài Vật chủ Loài Vật chủ

M gal li septicum Gà, gà tây, vịt A laidlawii Gia cầm, tự nhiên

M synoviae Gà, gà tây, chim M cloacale Nhiều vật chủ

M meleagridis Gà, gà tây U gallorale Gà, gà tây

M gallopavonis Gà tây M glycophilum Vịt, ngỗng

M pullorum Gà, gà tây M columbinum Bồ câu

A equifetale Gia cầm M columbinasale Bồ câu

A axanthum Vịt, ngỗng M columborale Bồ câu

Trong các loài Mycoplasma đã được phân lập, MG là loài gây bệnh chủ

yếu cho gà và bệnh do MG ở gia cầm được xếp vào danh sách B của các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia cầm do Tổ chức Dịch tễ Thế giới OIE (2000) [112] đánh giá Theo Yoder năm 1990[157], MG thuộc týp huyết thanh A

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc và huyết thanh học của MG

- Hình thái:

Mycoplasma là loại vi sinh vật đa hình thái, có hình sợi, hình nhẫn, kích

thước xấp xỉ 0,1 µm ÷ 0,8 µm Vi khuẩn MG có kích thước nhỏ 0,25 µm ÷ 0,5 µm, thành tế bào không ổn định, bắt mầu tốt với thuốc nhuộm Giemsa Hai hình dạng thường thấy nhất là hình quả lê và hình chai với cấu trúc đầu chóp trên có các cơ quan bám dính giúp MG có khả năng bám vào thành tế bào vật chủ (Razin, 1992)[122], (Razin và cs, 1998)[123]

- Cấu tạo:

Trong cấu tạo của MG người ta thấy các chất đặc trưng đối với các tế bào vi khuẩn (các mucotit) Lớp vỏ ngoài cùng của MG chỉ là màng nguyên sinh chất dài 75A0 ÷ 100A0 Trong tế bào MG có thể tìm thấy hạt Riboxom có đường kính 0,2 µm và các sợi nhân Đây là vi sinh vật có khả năng tự nhân đôi có kích thước nhỏ nhất

Hai đặc điểm của MG khác biệt với các vi khuẩn khác là kích thước genome và thành phần các bazơ nitơ của ADN, MG có cả ADN và ARN, nó mang bộ gen nhỏ nhất trong tất cả các cơ thể sống tự do Chủng R(low) của

MG có kích thước toàn bộ là 996422 bp (Papazisi và cs, 2003)[117] Các cơ thể sống của lớp này có ít hơn 300 gen, tổng thành phần Guanine (G) và Cystosine trong ADN thấp và tỉ lệ đó phân bố không đều trên bộ gen (Marois

và cs, 2001)[104], có vùng rất cao lại có vùng rất thấp Một cơ thể sống có kích thước và số lượng nhỏ như vậy nhưng nó cũng thể hiện là một mầm bệnh tương đối hoàn chỉnh và thực hiện rất nhiều chức năng của một cơ thể sống

chứng tỏ tính tổ chức và sự điều hành của bộ gen của MG khá hoàn chỉnh

Hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng các loài Mycoplasma gây

bệnh đường hô hấp mãn tính ở gà đều thuộc týp huyết thanh A, đặc trưng là chủng S6 (Zander, 1961)[160] Nhưng theo Adler và cs (1958)[24] cho rằng

có ít nhất hai týp huyết thanh ở gà và gà tây Cho đến năm 1964 đã phát hiện

ra 12 týp huyết thanh khác nhau của các mầm bệnh và được đặt theo thứ tự ABC tới L Theo Yoder, (1990)[157], đặc điểm và tính chất týp huyết thanh của MG được thể hiện như sau:

Týp huyết thanh: A Lên men Glucoza: +

Giống, loài: MG Đòi hỏi huyết thanh: +

HA: + Chuyển hoá Arginine: -

Gây bệnh: Gà và gà tây

1.1.3 Đặc tính nuôi cấy của MG

MG có thể mọc tốt trên môi trường thạch giàu huyết thanh có từ 10% ÷ 20% huyết thanh ngựa hoặc lợn, hình thái các khuẩn lạc nhỏ có dạng trứng ốp lếp đặc trưng Trong môi trường lỏng, MG làm môi trường vẩn đục nhẹ

Để có thể phân lập và tạo thành dòng phân lập thuần khiết, trước hết phải nuôi cấy lặp lại nhiều lần trên môi trường thạch, chọn ra một khuẩn lạc thuần, đặc trưng, sau đó nuôi cấy trong môi trường nước thịt để làm các phản ứng tiếp theo

Môi trường nước thịt thường được sử dụng nuôi cấy MG để sản xuất kháng nguyên (Capenter và cs, 1981)[38]

MG làm tan hồng cầu ngựa hoàn toàn trong môi trường đặc và gây ngưng kết hồng cầu gà, gà tây MG cũng có thể nuôi cấy trên phôi gà (Zain và Bradbury, 1996)[159]

1.1.4 Đặc tính gây bệnh của MG

Mầm bệnh MG có thành tế bào không ổn định nên hình dạng của nó rất

dễ bị biến đổi, nó có thể có dạng hình cầu đến hình sợi mảnh, có cơ quan bám dính ở một đầu, cơ quan này có hình cầu, nhô ra và được gọi là “bleds” Khi mầm bệnh xâm nhập vào vật chủ, nó chui vào giữa các nhung mao niêm mạc đường hô hấp hoặc đường sinh dục Phần bleds của vi khuẩn bám vào phần đuôi sialic của thụ quan sialoglycoprotein hoặc sialoglycolipit của tế bào vật chủ Sự bám dính này đủ chắc để nó không bị đào thải ra ngoài bởi nhu động

và quá trình tiết dịch của niêm mạc MG có thành tế bào không ổn định nên cũng có hiện tượng hoà nhập giữa màng tế bào vật chủ và màng nguyên sinh của vi khuẩn, các enzym thuỷ phân, neuraminidase, peroxidaza heamolysin và các loại độc tố khác được đưa vào tế bào vật chủ Những tác động đó có thể dẫn tới tế bào bị tổn thương, thoái hoá và cơ thể có thể có những đáp ứng miễn dịch và sốt Hơn nữa, do có sự xâm nhập của tế bào đơn nhân tới phần

mô bào của lớp dưới niêm mạc, do một số lượng lớn tế bào lympho và đại thực bào thẩm xuất dẫn tới sự dày lên của phần tổ chức bị tấn công Mầm bệnh gây tổn thương các cơ quan hô hấp, tuần hoàn ở phổi làm rối loạn toàn

bộ cơ thể gà bệnh Mầm bệnh có thể kết hợp với một số vi khuẩn, virus khác làm tổn thương niêm mạc đường hô hấp, con vật gầy sút nhanh rồi chết (Archibald, 1944)[28]

1.1.5 Đặc tính sinh hoá của MG

1.1.5.1 Phản ứng lên men đường glucoza

Các vi khuẩn thuộc lớp Mollicutes được phân làm hai nhóm lớn là

Mycoplasma lên men glucoza và không lên men glucoza Vì vậy, phản ứng

chuyển hoá glucoza là một trong những phản ứng bắt buộc trong quá trình xác

định Mycoplasma

Những kỹ thuật để xác định khả năng lên men đường glucoza dựa trên

sự giảm pH của môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển của vi khuẩn với điều kiện có glucoza hoặc dựa trên các biện pháp kiểm tra trực tiếp như:

sự biến mất của glucoza, xác định sản phẩm lên men axit của nó hoặc hoạt tính hexokinase, một enzym quan trọng trong việc phân giải glycogen

Với hầu hết các Mycoplasma lên men đường, phản ứng thử đơn giản

dựa trên sự sụt giảm pH của môi trường nuôi cấy là đủ Tuy nhiên trong một

số trường hợp các Mycoplasma phát triển chậm hoặc một số ít trường hợp các Mycoplasma vừa có khả năng phân hoá glucoza vừa có khả năng thuỷ phân

Arginine, phải tiến hành những test cụ thể hơn về sự chuyển hoá glucoza (Edward và Moore, 1974)[50]

1.1.5.2 Xác định khả năng thuỷ phân Arginine

Một số loài Mycoplasma thuỷ phân Arginine nhờ ba enzyme gồm:

Arginine deiminase (EC 3.5.3.6), Ornithine carbamoyl transferase (Ornithine transcarbamylase, EC 2.1.3.3) và carbamate kinase (EC 2.7.2.2) Arginine thuỷ phân được chuyển hoá thành Citrulline và sau Ornithine + Carbamoyl phosphate, chất này tiếp tục được thuỷ phân thành NH3 và CO2 với sự giải phóng ATP (Schimke và Barile, 1963)[134] theo sơ đồ sau:

(1) Arginine + H2O Arginine deiminase Citrulline + NH3

(2) Citrulline + Pi Ornithine Carbamoyl transferase Ornithine + Carbamoyl phosphate

(3) Carbamoyl phosphate + H2O + ADP Carbamate kinase NH3 +

CO2 + ATP

Khả năng thuỷ phân Arginine cũng được phát hiện thấy ở loài Streptococci (Hills, 1940)[65], ở một vài loài vi khuẩn khác (Cohen và

Brown, 1960)[43] và một chủng Mycoplasma có ở đường dẫn nước tiểu của

người (Smith, 1955)[135] Để xác định khả năng thuỷ phân Arginine của vi khuẩn người ta xác định men Arginine hydrodaza Hai phương pháp xác định hoạt tính Arginine hydrodaza sẽ được thực hiện là:

a) Phương pháp xác định hoạt tính Arginine hydrodaza trong môi trường

nuôi cấy nước thịt

Phương pháp nuôi cấy đơn giản này dựa trên sự giải phóng NH3 từ sự thuỷ phân Arginine, do đó gây ra sự thay đổi pH kiềm trong môi trường nuôi

cấy Mycoplasma Chất chỉ thị màu pH (Phenol red) được thêm vào môi

trường cho thấy một sự thay đổi màu từ vàng tới hồng trong môi trường nuôi

cấy Mycoplasma dương tính với Arginine

b) Phản ứng Arginine Deiminase

Hoạt tính Arginine deiminase được xác định bởi sự hình thành Citrulline từ Arginine ở pH 6.5 Sự hình thành Citrulline được đo bằng phương pháp so màu của Archibald, (1944)[28]

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm

1.2.1 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới

Mặc dù với số lượng lớn các loài Mycoplasma đã được phân lập nhưng

chỉ một số nhỏ trong số chúng gây bệnh cho gia cầm Các nhà chăn nuôi

thường chỉ quan tâm đến những loài Mycoplasma có khả năng gây bệnh cho gia cầm đó là: Mycoplasma gallisepticum(MG), Mycoplasma synoviae (MS), Mycoplasma meleagridis (MM) và Mycoplasma iowae (MI) Trong đó, đối

với chăn nuôi gà công nghiệp, hai loài MG và MS là đáng quan tâm nhất Đặc điểm của bệnh là gây rối loạn hô hấp, khó thở và thở khò khè, con vật bị viêm xoang, chảy nước mũi, hắt hơi và viêm kết mạc mắt, đặc biệt là ở

gà tây và chim cảnh Bệnh làm giảm sức sản xuất, giảm chất lượng thịt và sản lượng trứng (Yoder, 1979)[155]

Mầm bệnh Mycoplasma ở gia cầm được Dodd mô tả lần đầu tại Anh

năm 1905 trên gà tây, sau đó được Nelsol phân lập năm 1935 là những thể cầu trực khuẩn Năm 1943, Delaplane và Stuart phân lập từ gà con có triệu chứng viêm cơ quan hô hấp và bệnh được gọi là viêm đường hô hấp mãn tính (Ley và Yoder, 1997)[91]

Mycoplasma đã được phân lập từ gà và gà tây, (Stipkovits và Kempf, 1996)[139] Các týp huyết thanh của các loài Mycoplasma được thể hiện

trong bảng 1.4

Bảng 1.4: Đặc điểm và tính chất của các týp huyết thanh Mycoplasma ở

gia cầm (Theo Yoder, 1990) [157]

za

Đòi hỏi huyết thanh

Đòi hỏi NAD

Chuyển hoá Arginine

Gây bệnh

Gà Gà tây

Dựa vào các đặc tính sinh hoá và gây bệnh của mầm bệnh, người ta đã

phân biệt được các loài Mycoplasma gây bệnh cho gia cầm ở các mức độ khác

nhau

Các đặc tính sinh hoá và gây bệnh của các loài Mycoplasma được tóm

Thuỷ phân Arginine

F/S: Film & spot PHO: Phosphatase TTC: Tetrazolium trichloride

Hiện nay, kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR được áp dụng khá phổ biến để

phát hiện các nguyên nhân gây bệnh do Mycoplasma ở gia cầm, chủ yếu là vi

khuẩn MG và MS (Wrinack và Snoeyenbos, (1976)[148], (Stipkovits và Kempf, 1996)[139], (Razin, 2002)[124]

1.2.2 Tình hình bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh do Mycoplasma trên gà công nghiệp được phát hiện

đầu tiên vào năm 1972, (Đào Trọng Đạt và cs, 1978)[7] Cho đến nay, đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về bệnh này: Phan Lục và cs, (1994)[15], Nguyễn Thị Kim Oanh và cs, (1997)[16], Nguyễn Hữu Vũ (1998)[22], Phạm Văn Đông

và Vũ Đạt (2001)[8], Phạm Văn Đông (2002)[9], Nhữ Văn Thụ (2006)[21]

Các tác giả đều khẳng định rằng bệnh do Mycoplasma ở Việt Nam chủ

yếu đều do loài MG gây ra Sự có mặt của mầm bệnh MG trong đàn gà nuôi công nghiệp là khá phổ biến do điều kiện chăn nuôi thiếu thốn, điều kiện vệ sinh, chăm sóc còn chưa đảm bảo, điều kiện thời tiết nóng ẩm và thay đổi thường xuyên

Kết quả kiểm tra cho thấy tình hình nhiễm Mycoplasma khác nhau theo

lứa tuổi, mùa vụ, phương thức quản lý chăm sóc, giống gà Phạm Thị Thu Lan và cs, 1988)[10], Nguyễn Vĩnh Phước và Nguyễn Như Nguyên (1985)[17] đã điều tra cơ bản bệnh hô hấp mãn tính (CRD) trên đàn gà công nghiệp ở các tỉnh phía Nam, Hoàng Xuân Nghinh và cs, (1999)[13] đã nghiên cứu biến đổi bệnh lý trong đường hô hấp của gà.…

Nguyễn Hoài Nam (1999)[11] nghiên cứu bệnh CRD cho thấy: Tỷ lệ nhiễm CRD tổng đàn ở 3 cơ sở nuôi gà tập trung tại Hoà Bình và Hà Nội dao động từ 3,26% ÷ 5,28% Tỷ lệ nhiễm CRD ở đàn gà bệnh là 61,64%, và ở đàn

gà không có bệnh là 4,59% Tỷ lệ tử vong chung tổng đàn trung bình/năm dao động từ 30,37% ÷ 48,88% và tỷ lệ tử vong ở gà con mắc bệnh CRD cao hơn

gà lớn là 2,8 lần, tỷ lệ phân lập vi khuẩn Mycoplasma từ gà có triệu chứng

bệnh là 43,77% ÷ 57,83%

Theo tác giả Phạm Văn Đông và Vũ Đạt (2001)[8], Phạm Văn Đông (2002)[9] kết quả điều tra các đàn gà giống và thương phẩm của 4 trại chăn

nuôi ở phía Bắc, cho thấy tỷ lệ nhiễm Mycoplasma dao động từ 8,96% ÷

38,27% Khi phân lập trên môi trường Mycoplasma Broth (MB) và Mycoplasma Agar (MA) từ các mẫu bệnh phẩm tỷ lệ phân lập MG là 54,79%

÷ 45,2% Tác giả Phan Lục và cs, (1994)[15], cho biết tỷ lệ nhiễm MG ở đàn giống dao động từ 0,82% ÷ 11,97%, trên đàn thương phẩm tỷ lệ nhiễm bệnh

là 51,5% (Nguyễn Hữu Vũ, 1998)[22]

Các công trình nghiên cứu đều cho thấy tỷ lệ nhiễm Mycoplasma theo

giống, tuổi, mùa vụ là khác nhau, tỷ lệ nhiễm cao nhất là lứa tuổi gà trên 180 ngày, đàn gà giống thương phẩm có tỷ lệ nhiễm là 40,05% (Phạm Văn Đông, 2002)[9]

Theo tác giả Nhữ Văn Thụ (2006)[21], dùng phản ứng Multiplex PCR xác định tỷ lệ nhiễm bệnh CRD trên gà với kết quả MG 42,5%, MS 81,1% (đối với đàn gà đẻ) Đây là một yếu tố gây tổn thất nghiêm trọng đối với chăn nuôi gà công nghiệp

1.3 Bệnh do Mycoplasma ở gà

1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh

1.3.1.1 Mycoplasma gallisepticum (MG)

MG là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở

gà (CRD) và gây bệnh viêm xoang truyền nhiễm của gà tây (Infectious Sinusitis hay IS), gà lôi, gà gô (Bradbury và cs, 2001)[34] cũng có biểu hiện bệnh, ngoài ra còn phát hiện được bệnh này ở công, trĩ, chim sẻ, chim cút, gà tây hoang dã, vịt, đà điểu (Ley và Yoder, 1997)[91], (Stipkovits và Kempf, 1996)[139], (Roberts, 2001)[126]

Biểu hiện của bệnh là ho, chảy nước mũi, viêm xoang và những tổn thương rất nặng ở túi khí (Ley, 2003)[94] Tổn thất do bệnh gây ra có thể rất lớn, giảm 23% ÷ 30% tăng trọng đối với gà thịt, giảm hiệu quả chuyển hoá thức ăn khoảng 10% ÷ 20%, tỷ lệ chết từ 5% ÷ 10%, giảm 10% ÷ 20% sản lượng trứng, tỷ lệ chết phôi tăng 5% ÷ 10% (Ley và Yoder, 1997)[91], (Sato, 1996)[133], (Stipkovits và Kempf, 1996)[139], bệnh do MG còn làm giảm màu sáng của chim sẻ đực (Paul và cs, 2004)[115]

MG đề kháng rất yếu với hoá chất và các nhân tố vật lí Các loại hoá chất sát trùng thông thường có thể tiêu diệt mầm bệnh nhanh chóng MG mẫn cảm với phenol, formalin, merthiolate nhưng đề kháng với penicillin và thallium acetate, chỉ cần 1:4000 thallium acetate cho thêm vào môi trường

Thời gian tồn tại của mầm bệnh trong lòng trắng trứng là 3 tuần ở điều kiện 5oC, 4 ngày ở tủ ấp, 6 ngày ở nhiệt độ phòng

MG có thể truyền lây qua trứng, ở giai đoạn cấp tính, MG dễ dàng tiến đến buồng trứng, tử cung và định cư ở đó, trứng đẻ ra sẽ bị nhiễm mầm bệnh Mầm bệnh trong trứng gà bị diệt ở 45oC trong thời gian 12 ÷ 14 giờ (Yoder, 1979)[155]

Trong môi trường nước thịt nuôi cấy Mycoplasma bảo quản ở -30oC, mầm bệnh MG sống được 2 ÷ 4 năm (Yoder và Hofstad, 1964)[154], trong môi trường nước thịt rồi đông khô ở 4oC, MG sống được ít nhất 7 năm Khi bảo quản ở 37oC, MG chỉ ổn định trong dung dịch PBS khoảng 24 giờ

1.3.1.2 Mycoplasma meleagridis (MM)

MM gây bệnh cho gà tây do sự lây nhiễm qua trứng, chủ yếu gây viêm túi khí cho con non, làm giảm khả năng sử dụng thức ăn, giảm tốc độ sinh trưởng, ấp nở, xương phát triển chậm và không bình thường (Adler và cs, 1958)[24], (Yamamoto và Ghazikhanian, 1997)[153] Gần đây người ta còn phát hiện thấy MM gây bệnh cho chim cút, bồ câu và ở cả chim săn mồi (Lierz và cs, 2000)[95]

MM là loại yếm khí tuỳ tiện, mọc tốt ở nhiệt độ 37oC ÷ 38oC và mọc kém ở nhiệt độ 40oC ÷ 42oC

Trong canh trùng nước thịt khi nhuộm Giemsa thấy MM có những thể hình cầu, đường kính khoảng 400 nm, giống như MG

Dưới kính hiển vi điện tử MM không có cấu trúc hạt điển hình như MG

Trong môi trường thạch có nước thịt gà tây, cho thêm 2% hồng cầu ngựa thì MM gây dung huyết hồng cầu ngựa

1.3.1.3 Mycoplasma synoviae (MS)

MS thường gây các triệu chứng lâm sàng ở đường hô hấp trên của gà và

gà tây, MS cũng có thể gây bệnh viêm khớp truyền nhiễm Khi MS kết hợp với các virus gây bệnh khác như Newcastle (NCX), viêm khí quản truyền nhiễm (IB) hoặc cả 2 sẽ gây nên viêm túi khí (Kleven, 1997)[83], (Stipkovits

Khi nhuộm Giemsa, MS có hình cầu đa dạng, đường kính khoảng 0,2

µm ÷ 0,8 µm MS nằm ở lỗ hổng trong tế bào màng hoạt dịch MS có hình tròn hoặc quả lê, có các hạt ribosom Môi trường nuôi cấy MS cần bổ xung NAD (Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide) và cystein (Zain và Bradbury, 1995)[158] Môi trường thường được sử dụng nuôi cấy MS là môi trường Frey (OIE manual standards diagnosis and vaccine, 2000)[112], (2004)[113] Nhưng môi trường có huyết thanh lợn là thích hợp nhất cho MS phát triển và

nó mọc tốt ở 37oC, pH 7.8

1.3.1.4 Mycoplasma iowae (MI)

Bệnh do MI thường liên quan đến hiện tượng chết phôi, giảm tỷ lệ nở,

viêm túi khí dạng nhẹ và hiện tượng bất thường ở chân gà và gà tây MI thường gây chết phôi ở 10 ngày cuối, tập trung vào khoảng 18 ÷ 24 ngày, tỷ

lệ chết phôi cao, tỷ lệ nở giảm 2% ÷ 5% (Yamamoto và cs, 1997)[152]

MI mọc tốt ở môi trường có 0,5% ÷ 1% muối mật và đòi hỏi thành phần môi trường phải có chứa cholesterol (Yamamoto và Ghazikhanian, 1965)[153]

Khuẩn lạc MI hình trứng ốp lếp có kích thước 0,1 mm ÷ 0,3 mm, trên tế bào vi khuẩn MI có cấu trúc mấu lồi (bleds) như cơ quan bám dính ở MG (Kleven và Baxter-Jones, 1997)[82], (Ganapathy và cs,1999)[59]

1.3.1.5 Một số loài Mycoplasma khác ở gia cầm

Có hai loài Mycoplasma phổ biến trên gà và gà tây mà không được coi

là mầm bệnh, đó là M.gallinarum và M.gallinaceum

Hai loài này thường thu được trong quá trình phân lập các loài Mycoplasma gây bệnh (MG, MS, MM, MI) bởi chúng rất dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy Mycoplasma và chúng cũng có những hình dạng khuẩn lạc điển hình của Mycoplasma, có thể phân biệt được hai loài này bằng phương

pháp PCR (Fan, 1995)[54], (Stipkovits, 1988)[138], (Kleven, 1997)[83]

Mầm bệnh M.anseris, M.sp 1220 gây bệnh viêm túi khí, viêm phúc

mạc, chết phôi cho ngỗng (Stipkovits và Kempf, 1996)[139]

Mầm bệnh Ureaplasma gallorale gây bệnh cho gà và gà tây, tuy nhiên người ta còn biết ít về khả năng gây bệnh của loài này Ureaplasma có điểm khác biệt là khả năng thuỷ phân urea mà các loại Mycoplasma khác không có M.imitans có mối quan hệ gần gũi với MG, có tới 40% ÷ 46% ADN của

hai loài giống hệt nhau Hai loài có rất nhiều đặc tính chung như các phản ứng sinh hoá học, phản ứng hấp phụ hồng cầu, ngưng kết hồng cầu và sự có mặt của cơ quan bám dính Có thể phân biệt được hai loài này bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang và ức chế sinh trưởng

Có ba loài Mycoplasma gây bệnh hô hấp cho bồ câu (Kleven, 1997)[81]

đó là: M.columbinasal, M.columborale, M.columbinum Khi điều trị bằng

Tylosin đem lại hiệu quả cao

1.3.2 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh

Trong thiên nhiên, nguồn bệnh chủ yếu là gà bệnh Sự lây nhiễm rất dễ dàng từ con này sang con khác thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc tiếp xúc gián tiếp

Gà mắc bệnh ở thể ẩn tính, mang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường, sự truyền lây phụ thuộc vào kích thước của vùng khu trú mầm bệnh,

số lượng cá thể mẫn cảm và khoảng cách giữa chúng Đường lây bệnh chủ yếu là đường hô hấp Trong nước mũi, miệng, mắt, khí quản, túi khí của gà chứa nhiều mầm bệnh, khi mầm bệnh vào không khí, gà lành hít phải sẽ mắc bệnh Ngoài phương thức lây lan mầm bệnh theo bụi, hơi nước trong không khí, bệnh còn lây lan do dụng cụ chăn nuôi, người chăn nuôi, gà khoẻ tiếp xúc với gà bệnh, các ổ dịch mang mầm bệnh

Ý nghĩa dịch tễ quan trọng ở bệnh do Mycoplasma gây ra là hiện tượng

truyền lây mầm bệnh qua trứng do vòi trứng và tinh dịch gà trống nhiễm bệnh, dẫn đến truyền lây qua thụ tinh nhân tạo và từ gà trống truyền cho gà mái (Yoder và Hofstad, 1964)[154]

Ngoài ra, bệnh còn có thể lây qua đường tiêu hóa nhưng không có ý nghĩa quan trọng Trong một số trường hợp cụ thể, sự lây nhiễm có thể xảy ra

do sử dụng vacxin virus, mà vacxin này không được chế tạo từ trứng sạch

mầm bệnh Mycoplasma

1.3.3 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng đến dịch tễ

Trong thiên nhiên, gà và gà tây là hai loài dễ mắc bệnh, tuy nhiên, người ta cũng phân lập được mầm bệnh từ gà lôi, gà gô (Bradbury và cs, 2001)[34], (Ley và cs, 1997)[92], công, trĩ, chim sẻ, chim cút, gà tây hoang

có tỷ lệ cao hơn khu vực chăn nuôi gia đình

Bệnh do Mycoplasma lây từ từ trong đàn và ở dạng mãn tính Một số

loài có khả năng lây truyền nhanh trong đàn qua tiếp xúc thông thường Gà

nhiễm Mycoplasma sau 4 tuần đã có đáp ứng miễn dịch Một số trường hợp,

cả đàn mắc bệnh chỉ sau 1 ÷ 2 tuần khi trong đàn có con xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên, trong khi đó có những đàn khác thì lây truyền chậm, những biểu hiện của bệnh là rất khác nhau Có trường hợp gà không có triệu chứng lâm sàng, nhưng chúng vẫn đang mang trùng và đây chính là nguồn lây lan bệnh Bệnh xuất hiện khi gặp các yếu tố bất lợi như: Mật độ gà cao, số lượng

gà lớn, điều kiện thông gió không đảm bảo Bệnh cũng có thể kết hợp với các mầm bệnh khác như virus NCX, Gumboro, virus cúm gà, virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm, Hemophilus paragallinarum, E.coli làm cho bệnh nặng thêm và tiến triển nhanh hơn

1.3.4 Triệu chứng của bệnh

Triệu chứng lâm sàng của bệnh do Mycoplasma có thể biểu hiện khác

nhau, tuỳ thuộc vào độc lực của mầm bệnh và sức đề kháng của cơ thể Có rất nhiều yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, độ thông thoáng, vệ sinh chuồng trại, stress, mật độ gà/m2, giống gà, tuổi gà hay việc sử dụng kháng sinh để phòng bệnh cũng ảnh hưởng đến thời gian nung bệnh

Trong tự nhiên, thời kỳ nung bệnh ở các đàn gà khác nhau từ 3 đến 38 tuần (Stipkovits và Kempf, 1996)[139]

1.3.4.1 Triệu chứng bệnh do M.gallisepticum

Bệnh thường xuất hiện sau khi nhiễm mầm bệnh từ 6 ÷ 21 ngày và kéo dài từ 4 ÷ 8 tuần hoặc hơn

Những triệu chứng chung nhất bao gồm: Dịch rỉ mũi, ho, sùi bọt, vẩy

mỏ, khò khè, con vật vẫn còn ăn được và đôi khi viêm kết mạc mắt (Ley, 2003)[94]

Một số trường hợp khác gà bị sưng khớp, què, mất điều hoà thần kinh, sưng đầu, kém ăn, mỏ và chân khô, chân kém bóng láng

Những dấu hiệu không đặc trưng phổ biến như: Giảm tốc độ sinh trưởng và năng suất đẻ trứng, giảm khả năng chuyển hoá thức ăn

Triệu chứng lâm sàng của những đàn bị nhiễm bệnh qua trứng khi chuyển thành bệnh thứ cấp CRD biểu hiện từ 3 ÷ 6 tuần tuổi, còn những trường hợp khác thì phát triển ở giai đoạn chuẩn bị sinh sản

Gà con mắc bệnh nặng hơn gà lớn và tỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ chết khoảng 5% ÷ 12% nhưng cũng có khi tỷ lệ chết lên tới 30% (Phạm Văn Đông, 2002)[9], gà bị bệnh chết rải rác trong các ngày

Gà lớn thường mắc bệnh ở thể ẩn tính, triệu chứng lâm sàng không rõ Bệnh xảy ra chậm và kéo dài nhiều tháng, dấu hiệu đặc trưng nhất ở gà lớn là khi thở có tiếng ran, thở khò khè, viêm mũi một bên hoặc hai bên Gà chảy nước mắt, nước mũi, vảy mỏ, tiêu hoá kém và gầy sút (Ley, 2003)[94]

Ở gà đẻ, sản lượng trứng giảm, một số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng nhưng vẫn thấy tăng tỷ lệ chết phôi và gà nở ra chậm lớn, đôi khi thấy có triệu chứng thần kinh

Trong một đàn triệu chứng lâm sàng thường biểu hiện nặng hơn ở những con trống, gà tây có biểu hiện nặng hơn, gà thịt thường mắc bệnh nặng

và hay kết hợp với các bệnh khác

Tuy nhiên, nhiều đàn gà có phản ứng huyết thanh học dương tính nhưng

không có triệu chứng lâm sàng, đặc biệt khi chúng nhiễm bệnh ở tuổi còn non

và cơ thể một phần đã hồi phục (Levisohn, 2000)[89]

Tỷ lệ chết ở đàn gà lớn không đáng kể, nhưng ảnh hưởng tới tăng trọng

và tỷ lệ đẻ Tỷ lệ chết ở gà thịt thấp nếu không kết hợp với các bệnh khác, chết nhiều nhất là 30% nếu có bệnh ghép và bệnh xảy ra vào những tháng thời tiết lạnh

Ở gà tây, lúc đầu thường thấy có dịch tiết của mắt và mũi, các gà khác

bị viêm xoang mũi nặng, nhiều con mắt sưng to đến nỗi không mở được gây khó khăn trong việc ăn uống Gà gầy sút nhanh, dịch dỉ mũi, dịch viêm chảy

ra ngoài đôi khi rất nhớt, tỷ lệ đẻ giảm nhiều

1.3.4.2 Triệu chứng bệnh do M.synoviae

MS gây bệnh cho gà, gà tây và gà con Thời gian ủ bệnh có sự khác nhau rõ rệt, phụ thuộc vào số lượng, đường lây nhiễm và độc lực của mầm bệnh: ở những gà bị nhiễm qua trứng khoảng 6 tuần, những gà bị nhiễm qua tiếp xúc, thời gian ủ bệnh khoảng 11 ÷ 12 ngày, ở gà nhiễm qua chân là 2 ÷

10 ngày, ở gà tiêm tĩnh mạch là 7 ÷ 10 ngày, qua màng kết mạc là 20 ngày (Kleven, 1997)[83], (Stipkovits và Kempf, 1996)[139] Bệnh thường gây thương tổn mô liên kết, viêm nhẹ đường hô hấp và viêm khớp Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở 2 dạng:

MM cùng với MI gây ra viêm túi khí nặng và kết hợp với MS gây triệu chứng viêm xoang mũi Khi đàn gà nhiễm MM và MS thì hiện tượng viêm xoang mũi chiếm khoáng 2,1% ở gà trống và 0,13% ở gà mái, đồng thời tỷ lệ

ấp nở của trứng cũng giảm đáng kể (Rhoades, 1977)[128] Triệu chứng ở con non thường nặng hơn những con trưởng thành

1.3.4.4 Triệu chứng bệnh do M.iowae

Những biểu hiện thường là lông không mượt, viêm gân bất bình thường

ở chân (loạn dưỡng xương, lệch ngón), có thể bị teo túi fabricius, thường không có những biểu hiện triệu chứng lâm sàng rõ rệt ở đàn gà trưởng thành

mà chủ yếu là ở phôi, phôi thường chết ở 10 ngày cuối (ngày 18 ÷ 24) tỷ lệ chết phôi cao, tỷ lệ nuôi sống gà con giảm 2% ÷ 5%

Đàn gà trưởng thành có triệu chứng nhẹ ở đường hô hấp, khớp và chân (Kleven và Baxter- Jones, 1997)[82]

Những trường hợp bệnh ghép, trên màng bao tim, gan, lách đều phủ lớp màng giả trắng đục Viêm bao tim, viêm gan và thỉnh thoảng có hiện tượng sưng, phù nề các khớp, xuất tiết dịch viêm ở khớp, thoái hoá bề mặt của khớp, viêm bao gân, ổ khớp và viêm màng hoạt dịch MG còn gây viêm ống dẫn trứng ở gà và gà tây (Domermuth và cs, 1967)[47]

* Bệnh tích vi thể:

Bệnh tích vi thể biểu hiện rõ ở khí quản và phổi

- Khí quản: Tăng sinh và tróc tế bào biểu mô, có sự thâm nhiễm các tế

bào đơn nhân và tăng sinh các tuyến nhầy Hình thành các vùng tăng sinh tế bào lympho dưới màng nhầy niêm mạc, các ống huyết dịch của biểu mô dài ra

rõ rệt

- Phổi: Có các vùng viêm, xuất hiện các nang lympho cũng như các tổn

thương dạng hạt Mô phổi có sự tăng sinh lympho dạng nang, có hiện tượng viêm phổi

1.3.5.2 Bệnh tích do M synoviae (MS)

* Bệnh tích đại thể:

Gà có biểu hiện sưng các khớp chân và cánh Trong ổ khớp có các chất dịch nhày nằm trong màng bao hoạt dịch, bề mặt ổ khớp bị lồi lõm không bằng phẳng Gan lách to hơn bình thường Thận sưng to và có các chất màu xanh xám Gà bị viêm túi khí và xuất huyết

* Bệnh tích vi thể:

Có hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu trung tính tại các ổ khớp, xuất hiện