và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối t−ợng nghiên cứu
- Chim, gà cảnh nuôi tại v−ờn thú Hà Nội.
- Vi khuẩn P.multocida gây bệnh Tụ huyết trùng cho Chim và gà cảnh nuôi tại V−ờn thú Hà Nội.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trên đàn chim và gà cảnh thuộc họ trĩ (phasianidae) nuôi tại V−ờn Thú Hà Nội
3.2. Xác định các đặc tính sinh vật hoá hóa của các chủng P.multocida gây bệnh phân lập đ−ợc.
3.3. Xác định serotype, độc lực vi khuẩn P.multocida phân lập đ−ợc.
3.4. Chọn chủng vi khuẩn P.multocida để chế thử vacxin.
3.5. Chế tạo và thử nghiệm vacxin phòng bệnh Tụ huyết trùng cho đàn chim và gà tại v−ờn thú Hà Nội trên động vật thí nghiệm và trên gà thả v−ờn.
3.3. Nguyên liệu
3.3.1. Địa điểm nghiên cứu
- V−ờn Thú Hà Nội. - Viện Thú y
3.3.2. Nguyên liệu nghiên cứu: 3.3.2.1. Bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm là máu tim, phủ tạng (Gan, lách, phổi), x−ơng ống của chim, gà cảnh ốm hoặc chết có triệu chứng, bệnh tích nghi bệnh Tụ huyết trùng, các bệnh phẩm đ−ợc bao gói cẩn thận trong hộp kín giữ trong tủ lạnh 4-
100C (Chuyển nhanh tới phòng thí nghiệm), hoặc giữ trong môi tr−ờng bảo quản bằng dung dịch Glycerin 50% trong n−ớc sinh lý.
3.3.2.2. Động vật thí nghiệm:
- Chuột bạch có trọng l−ợng 18-20 gam.
- Một số cá thể chim, gà cảnh đ−ợc nhân nuôi phục vụ cho công tác thí nghiệm.
- Gà thả v−ờn (gà ta): trọng l−ợng từ 1,5- 2kg.
3.3.3. Môi tr−ờng nuôi cấy, phân lập, bảo quản vi khuẩn.
Các loại môi tr−ờng do hung Oxoid (Anh) sản xuất. Các môi tr−ờng đ−ợc chế sẵn ở dạng bột, khi cần dùng chỉ cần pha theo chỉ dẫn. Môi tr−ờng ở dạng khô nên bảo quản tốt ở điều kiện khô và nhiệt độ thấp hơn 250C. Các môi tr−ờng khi chế thì giữ ở nhiệt độ 2- 80C. Môi tr−ờng dùng là môi tr−ờng do hung Oxoid (Anh), Merck (Pháp) sản xuất gồm:
- Môi tr−ờng n−ớc thịt
- Môi tr−ờng BHI (Brain Heart Infusion) - Môi tr−ờng thạch th−ờng
- Môi tr−ờng thạch máu - Môi tr−ờng MacConkey - Môi tr−ờng Gelatin
- Môi tr−ờng các loại đ−ờng:
Pha các dung dịch đ−ờng: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Dulcitol, Galactose, Fructose... thành dung dịch 10% hoặc 20%, pha xong đem lọc và hấp ở 1100C trong vòng 20- 30 phút hay hấp cách quung 1000C trong 30 phút, hấp 3 ngày liền. Mỗi ống peptone cho vào một loại đ−ờng theo tỷ lệ 0,5%
3.3.4. Hoá chất
- Dung dịch PBS (Phosphat Buffer Solution):
- Giấy thử Oxidase: 1% dung dịch Tetramethy-p-Phenylendiamine dihydrochloride để ở nhiệt độ phòng. Giấy lọc đ−ợc cắt thành dải nhúng vào dung dịch để khô và giữ ở nhiệt độ 40C.
- Thuốc thử phản ứng Catalase: Dung dịch H2O2 3% - Dung dịch Kovac’s:
Paradimetyl amino benzaldehyt : 5 g Cồn Butylic hoặc Izoamylic : 75 ml
HCl đặc : 25 ml
- Dung dịch thuốc nhuộm gram: Dung dịch tím Genxian Dung dịch đỏ Fucxin Dung dịch cồn Acetol Dung dịch Lugol
Hoá chất dùng để thử phản ứng hoàn nguyên Nitrat.
* Dung dịch A:0,8% axitsulphanilic trong dung dịch axit axetic 5N * Dung dịch B:0,5% Alpha- napthylamine trong dung dịch axit axetic 5N.
3.3.5 Giống vi khuẩn - dụng cụ - máy móc
- Giống vi khuẩn P.multocida type A, B, D chuẩn do úc và Nhật Bản cung cấp.
- Kháng huyết thanh chuẩn dùng định type vi khuẩn Pasteurella multocida A, B, D của úc và Nhật Bản.
- Primer và hóa chất dùng trong ph−ơng pháp PCR để định type vi khuẩn P. multocida.
- Các dụng cụ máy móc trang thiết bị trong phòng thí nghiệm, các hoá chất dùng để sát trùng, tiêu độc rửa dụng cụ vv..
3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1.Ph−ơng pháp phân lập, xác định vi khuẩn.
- Lấy mẫu để phân lập vi khuẩn:
Lấy máu tim, cơ quan phủ tạng, gan lách, x−ơng ống dài của những cá thể thuộc chim họ trĩ ốm hoặc chết, có triệu chứng bệnh tích điển hình của bệnh Tụ huyết trùng: Bao tim tích n−ớc vàng, mỡ vành tim xuất huyết, phổi xuất huyết, gan có điểm hoại tử trắng bằng đầu đinh ghim, hoặc dựa trên triệu chứng lâm sàng các mẫu ta có thể chuyển nguyên mẫu đến phòng thí nghiệm sau đó tiến hành mổ khám xét nghiệm.
Phết kính kiểm tra hình thái:
- Từ bệnh phẩm là máu tim thì tiến hành nhuộm Giemsa - Từ môi tr−ờng nuôi cấy thì tiến hành nhuộm Gram. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn P.multocida:
Các mẫu bệnh phẩm (máu tim, gan, tuỷ x−ơng) đ−ợc cấy trên các môi tr−ờng thông th−ờng và môi tr−ờng phân lập bao gồm: môi tr−ờng BHI, môi tr−ờng thạch máu, môi tr−ờng Mac Conkey.
Môi tr−ờng đu cấy đ−ợc đặt vào tủ ấm 370C trong 24h, căn cứ vào tính chất mọc của khuẩn lạc trên các môi tr−ờng và từ đó xác định khuẩn lạc Pasteurella multocida dựa trên tiêu chuẩn của Carter (1984).
Vi khuẩn P.multocida mọc tốt trên môi tr−ờng thạch máu và không dung huyết, không mọc trên môi tr−ờng Mac Conkey. Các phản ứng Indol d−ơng tính, Oxydaza, Catalaza d−ơng tính, không di động.
Sơ đồ phân lập vi khuẩn
Bệnh phẩm (phủ tạng) chim gà chết nghi tụ huyết trùng
Nuôi cấy trên các môi tr−ờng: BHI, thạch máu, thạch MacConkey,
Phân lập, thuần khiết từng loại khuẩn lạc
Nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn
Giám định vi khuẩn qua các đặc tính sinh hoá và lên men đ−ờng
3.4.2. Xác định tính chất sinh hoá của các chủng P. multocia phân lập đ−ợc 3.4.2.1. Phản ứng Oxidasa
Tiến hành trên giấy đ−ợc thấm 1% dung dịch Tetrametyl-p- Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi tr−ờng thạch bôi lên trên mặt giấy đu thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen sau 30 giây là phản ứng d−ơng tính. Nếu không thấy xuất hiện màu tím đen hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính.
3.4.2.2 Phản ứng Catalasa
Thử độc lực Định type
Dùng phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên trên, rồi dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi tr−ờng thạch trộn đều với giọt H2O2 3%, nếu có hiện t−ợng sủi bọt là phản ứng d−ơng tính.
3.4.2.3. Thử phản ứng sinh Indol:
Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào ống môi tr−ờng BHI. Để tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 0,5 ml dung dịch Kovac’s vào, phản ứng d−ơng tính khi quan sát thấy một vòng màu đỏ trên mặt môi tr−ờng.
3.4.2.4 Phản ứng lên men đ−ờng:
Chủng vi khuẩn đ−ợc thử cấy vào ống môi tr−ờng pepton để tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau đó nhỏ 0,2ml canh khuẩn vào dung dịch đ−ờng đu chuẩn bị tr−ớc. Cho vào tủ ấm 370C trong 24 giờ, quan sát thấy màu của môi tr−ờng thay đổi thành mầu đỏ là d−ơng tính, nếu vi khuẩn có sinh hơi thì thấy hơi trong ống Durham và đẩy mực n−ớc trong ống Durham xuống.
3.4.3. Xác định serotype của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập đ−ợc: 3.4.3.1. Ph−ơng pháp ng−ng kết với kháng huyết thanh chuẩn:
+ Chuẩn bị kháng huyết thanh: Kháng huyết thanh chuẩn P. multocida các serotype A, B, D đ−ợc pha loung theo cơ số 2 thành: 1/2, 1/4, 1/8.
+ Chuẩn bị kháng nguyên: Cấy vi khuẩn trên môi tr−ờng thạch máu, thạch BHI trong thời gian 18 giờ, sau đó thu hoạch với n−ớc sinh lý.
+ Tiến hành: Lấy 10à kháng huyết thanh chuẩn hòa lẫn với 10à kháng nguyên, trộn đều trong vòng khoảng 5 giây.
+ Kết quả: Xuất hiện phản ứng ng−ng kết lên bông thì phản ứng d−ơng tính, không xuất hiện ng−ng kết thì phản ứng âm tính.
3.4.3.2. Xác định serotype của vi khuẩn Pasteurella multocida bằng kỹ thuật PCR:
Trong chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng và định type kháng nguyên vi khuẩn P. multocida, kỹ thuật PCR đu đ−ợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng. Kỹ thuật này cho phép khuyếch đại một số l−ợng lớn bản sao DNA có mặt trong
Trong kỹ thuật PCR, trình tự mồi đ−ợc thiết kế để nhận biết một cách đặc hiệu với mầm bệnh có liên quan.
Kỹ thuật PCR dùng để xác định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida đ−ợc tiến hành dựa trên ph−ơng pháp Multiplex PCR, tức là sử dụng nhiều loại mồi khác nhau trong cùng một phản ứng.
Chuẩn bị: Các chủng vi khuẩn P. multocida chuẩn typ A, B, D dùng làm đối chứng d−ơng do Viện Thú Y, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Quốc gia và Viện Thú y Quốc gia Nhật bản (Tsukuba) cung cấp. Các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập đ−ợc ở chim và gà cảnh tại v−ờn thú Hà Nội. - DNA mẫu cần xác định đ−ợc lấy trực tiếp từ khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đu đ−ợc nuôi cấy 37oC/24h trên môi tr−ờng thạch máu.
Tiến hành: phản ứng PCR đ−ợc tiến hành nhờ Taq ADN polymease và sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho các type A, B, D
CAPA-F CAPA-R CAPB-F CAPB-R CAPD-F CAPD-R
5'-TGC CAA AAT CGC AGT GAG-3' 5'-TTC CCA TCA TTG TCA GTG-3' 5'-CAT TTA TCC AAG CTC CAC C -3'
5'-GCC CGA GAG TTT CAA TCC - 3'
5'-TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC-3' 5'-CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG -3'
Phản ứng PCR gồm có các giai đoạn: tiền biến tính ở 94oC/3 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94oC/1 phút, ủ bắt cặp 55oC/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng 72oC/7 phút.
Quá trình điện di đ−ợc thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel đ−ợc nhuộm trong dung dich EDTA đu bổ xung 1% ethidium bromide, sau 15 phút tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA đ−ợc đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng d−ơng.
3.4.4 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập trên động vật thí nghiệm:
tiêm cho chuột bạch của Sawada (1985).
Tiêm truyền cho động vật thí nghiệm. Động vật thí nghiệm đ−ợc dùng là chuột bạch có trọng l−ợng 18-20 g/con, khỏe mạnh.
Các chủng vi khuẩn cần xác định độc lực đ−ợc ria cấy trên môi tr−ờng thạch máu, chọn khuẩn lạc điển hình đứng riêng lẻ. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi tr−ờng BHI, bồi d−ỡng 18 -20 giờ ở nhiệt độ 370 C. Mỗi chủng vi khuẩn tiêm cho 2 chuột bạch, liều tiêm cho mỗi con chuột 0,2 ml canh trùng đu chuẩn bị tiêm vào xoang phúc mạc. Sau khi tiêm theo dõi thời gian chết chuột và số chuột chết của từng chủng vi khuẩn kiểm tra. Chuột chết đ−ợc mổ khám, lấy máu tim nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn để xác định chuột chết do chủng vi khuẩn ban đầu.
3.4.5. Xác định liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập đ−ợc.
Để đánh giá cụ thể độc lực của một chủng vi sinh vật hay độc tố của nó ng−ời ta th−ờng dùng liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal Dosis 50 = LD50). LD50 là liều vi sinh vật hay độc tố làm chết 50% động vật thí nghiệm.
+ Ph−ơng pháp tiến hành: Chủng vi khuẩn đ−ợc nuôi cấy trong môi tr−ờng n−ớc thịt BHI ở 370C/18- 24 giờ. Canh trùng đ−ợc đếm số để xác định số l−ợng của vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn. Pha loung canh trùng theo bậc cơ số 10 từ 10-1cho đến 10-9, cấy 0,1 ml canh khuẩn pha loung ở mỗi nồng độ trên thạch máu đĩa, bồi d−ỡng ở 370C trong 24h, rồi đếm số khuẩn lạc mọc trên môi tr−ờng. Số l−ợng vi khuẩn đ−ợc tính trong 1ml canh khuẩn đ−ợc tính theo công thức sau:
X= a x N x 10
X: Số l−ợng vi khuẩn trong một ml canh khuẩn . a: Số vi khuẩn có trong 0,1 ml canh khuẩn pha loung N: Hệ số pha loung
nghiệm theo công thức Reed - Muench:
Lg LD50 = Lg A + a-50 x d a- b
Trong đó: A: là liều giới hạn trên 50% ( liều chết trên gần nhất). a: là tỉ lệ chết do liều A (%).
b: là tỉ lệ chết do liều B (%)- liều giới hạn sát d−ới 50% d: là log của bậc pha loung.
3.4.6. Ph−ơng pháp sản xuất vacxin:
Vacxin đ−ợc chế dạng vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn bằng các chủng phân lập đ−ợc, theo ph−ơng pháp th−ờng quy.
B−ớc 1: Chủng Pasteurella multocida phân lập đ−ợc cấy vào 3 -5 ống thạch máu cừu. Bồi d−ỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Với mỗi ống thạch máu dùng khoảng 2,5 -3ml môi tr−ờng BHI để rửa mặt thạch. Sau đó đem huyễn dịch này đổ trở lại các bình đựng môi tr−ờng BHI với thể tích 150- 200ml. Bồi d−ỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ, cứ 4 -6 giờ lắc 1 lần, hoắc sử dụng tủ ấm có lắc nuôi cấy 20- 24 giờ.
B−ớc 2: Kiểm tra thuần khiết và cấy giống lớn
Với mỗi bình canh trùng nhỏ đều làm tiêu bản để kiểm tra thuần khiết. Sau đó nếu thuần khiết, mỗi bình nhỏ này đ−ợc chuyển vào một bình lớn (bình sản xuất vacxin, dung tích 5 lít, chứa 1,5 lít môi tr−ờng) theo tỷ lệ 1/10, bồi d−ỡng ở 370C trong 20 giờ có lắc, độ pH cần thiết 7,2- 7,4.
B−ớc 3: Kiểm tra thuần khiết ở bình lớn: Kiểm tra trên các môi tr−ờng và phiết kính:
+ Môi tr−ờng n−ớc thịt: 2 ống + Môi tr−ờng thạch th−ờng 2 ống + Môi tr−ờng thạch máu ống 2 ống + Môi tr−ờng nuôi cấy nấm 2 ống
bồi d−ỡng ở 370C trong 24 giờ
Kết quả d−ơng tính chỉ có duy nhất P. multocida mọc thuần khiết
B−ớc 4: Xác định đậm độ vi khuẩn trong môi tr−ờng nuôi cấy: Đếm số l−ợng vi khuẩn trên đĩa thạch theo ph−ơng pháp th−ờng quy
B−ớc 5: Xử lý Formol
Khi kiểm tra thấy số l−ợng vi khuẩn trong 1 ml canh trùng đạt yêu cầu thì tiến hành vô hoạt vi khuẩn bằng Formol theo tỷ lệ 0,3%, để ở tủ ấm 370C trong 24 giờ, 6 giờ lắc 1 lần.
B−ớc 6: Kiểm tra vô trùng trên các môi tr−ờng cơ bản: Thạch máu: 2 ống
N−ớc thịt: 2 ống
N−ớc thịt gan yếm khí: 2 ống
Thạch th−ờng: 2 ống
Thạch Saboraud: 2 ống
Dùng Pipet vô trùng nhỏ vào mỗi ống 0,1ml canh khuẩn (đu diệt khuẩn bằng formon) để tủ ấm 370C trong 24 giờ. Tiêu chuẩn vô trùng khi không có vi khuẩn mọc.
B−ớc 7: Bổ sung keo phèn và ra chai
Sau khi đu vô hoạt bằng Formon, tập chung canh khuẩn đu vô hoạt vào bình lớn 10 lít. Bổ sung keo phèn đu hấp vô trùng theo tỷ lệ 1/5 lắc đều (300- 500 vòng/ phút trong 3-4 giờ) ta thu đ−ợc bán thành phẩm. Sau đó các bán thành phẩm này đ−ợc tiến hành ra chai, đóng vào chai hoặc lọ 20ml gắn Paraphin, dán nhun.
B−ớc 8: Kiểm tra vacxin: Theo “Quy trình kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y” do Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y nhà n−ớc ban hành năm 1994 vacxin phải đảm bảo: An toàn, vô trùng và hiệu lực.
Qui trình sản xuất Vacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn
Giống vi khuẩn đ−ợc chọn sản xuất vacxin
Cấy giống nhỏ trong môi tr−ờng BHI bồi d−ỡng 370C/ 20 giờ
Kiểm tra thuần khiết trên các loại môi tr−ờng và phiết kính
Cấy vào bình môi tr−ờng BHI tỷ lệ 1/10
(bình 5 lít chứa 1,5 lit môi tr−ờng) bồi d−ỡng ở 370C/20 giờ có lắc)
Đếm số l−ợng vi khuẩn trong 1ml canh trùng
Kiểm tra thuần khiết (nh− kiểm tra giống nhỏ) Xử lý Formol nồng độ 0,3% để 370C/24 giờ
(6 giờ lắc 1 lần)
Kiểm tra vô trùng trên thạch máu, n−ớc thịt BHI, thạch th−ờng, thạch Saboraud
Bổ xung keo phèn tỷ lệ 1/5, lắc đều, ra chai vacxin
Kiểm tra vacxin
3.4.7. Kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên động vật thí nghiệm
3.4.7.1 Kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên trên chuột bạch:
Kiểm tra an toàn: Tiêm phúc xoang cho 10 chuột nhắt trắng, với liều 0,5 ml sau thời gian 10 ngày theo dõi số chuột phải sống khoẻ mạnh.
Kiểm tra hiệu lực: Tiêm miễn dịch cho 10 chuột khoẻ mạnh, với liều 0,2 ml vacxin/con với đ−ờng tiêm d−ới da. Sau 21 ngày các chuột đu đ−ợc gây miễn dịch. Lô đối chứng 5 chuột không tiêm vacxin. Tiến hành thử thách c−ờng độc với chủng vi khuẩn t−ơng ứng với liều 10 lần LD50 cho 1 chuột vào