Chẩn đoán nguyên nhân di truyền gây bệnh thoái hóa cơ tủy bằng kỹ thuật multiplex ligation‐dependent probe amplification

Bài viết Chẩn đoán nguyên nhân di truyền gây bệnh thoái hóa cơ tủy bằng kỹ thuật multiplex ligation‐dependent probe amplification có nội dung với mục tiêu nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1.

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  Nghiên cứu Y học CHẨN ĐỐN NGUN NHÂN DI TRUYỀN GÂY BỆNH THỐI HĨA   CƠ TỦY BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION‐DEPENDENT   PROBE AMPLIFICATION  Nguyễn Thị Băng Sương*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Dương Thị Huệ**, Lê Thị Khánh Vân***, Trần Diệp Tuấn*.  TĨM TẮT  Đặt  vấn  đề:  Bệnh thối hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy: SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm  trên nhiễm sắc thể thường. Khoảng 94 % trường hợp bệnh nhân SMA bị mất cả hai bản sao của gen SMN1 còn  6% bệnh nhân rơi vào trường hợp mang 1 allele SMN1 bị đột biến mất đoạn và 1 allele SMN1 bị đột biến điểm.  Mục  tiêu:  Nghiên  cứu  ứng  dụng  kĩ  thuật  MLPA  để  xác  định  đột  biến  mất  đoạn  exon  7  và  exon  8  của  gen  SMN1.   Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 50 bệnh nhi được chẩn đốn mắc bệnh SMA dựa vào các triệu  chứng lâm sàng điển hình, DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân. Thực hiện phản ứng MLPA  sử dụng kit SALSA MLPA P021‐A2 của Hà Lan để phát hiện đột biến mất đoạn gen SMN1.   Kết quả: Phát hiện được 33/50 (chiếm 66%) trường hợp bệnh nhi mang đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng  hợp tử, 08 trường hợp (chiếm 16%) mang đột biến mất đoạn gen SMN1 dị hợp tử.   Kết luận: Áp dụng thành cơng phương pháp MLPA trong xác định kiểu đột biến mất đoạn exon 7, exon 8  của gen SMN1 ở bệnh nhân được chẩn đốn SMA.   Từ khóa: MLPA, thối hóa cơ tủy SMA, đột biến gen SMN1, chẩn đốn trước sinh bệnh SMA.  ABSTRACT  DETECTION OF GENETIC MUTATION WHICH CAUSES SPINAL MUSCULAR ATROPHY DISEASE  BY MULTIPLEX LIGATION‐ DEPENDENT AMPLIFICATION PROBE METHODE  Nguyen Thi Bang Suong, Do Thi Thanh Thuy, Duong Thi Hue, Le Thi Khanh Van, Tran Diep Tuan.  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 36 ‐ 42  Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disorder, with an  incidence of about 1 in 10000 live births and with a carrier frequency of about 1 in 50. Approximately 94% of  SMA patients have a homozygote deletion of exon 7 in the SMN1 gene. The remaining 6% of patients have a  point mutations in one allele and a deletion in the other.   Objectives: We studied the application of MLPA technique to diagnose deletion mutations in SMN1 gene  cause spinal muscular atrophy disease.   Patients  and  Methods:  Genomic  DNA  of  50  SMA  patients  were  extracted  from  peripheral  blood  leukocytes using the QiAgen kit. MLPA technique was performed to detect deletion mutation of SMN1 gene.   Results:  There  were  33/50  patients  with  deletion  homozygous  on  SMN1  gene  deletion,  08  patients  had  deletion heterozygotes.   Conclusion: Application successfully of MLPA method in identify deletion in SMN1 gene.  Keywords: MLPA, SMA, SMN1, Prenatal diagnosis of SMA  * **Khoa Sinh, Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh   Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh   ***Khoa Thần Kinh, Bệnh viện Nhi Đồng 2  Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương‐ ĐT: 0914007038‐ Email: suongnguyenmd@gmail.com.  Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 37 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ  Thối hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy:  SMA)  là  bệnh  di  truyền  do  gen  lặn  nằm  trên  nhiễm sắc thể thường, bệnh được mô tả đầu tiên  bởi  nhà  thần  kinh  học  Guido  Wernig  (người  Australia)  vào  năm  1891(9).  Đây  là  một  trong  những  bệnh  thần  kinh  cơ  di  truyền  hay  gặp  nhất. Tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 và tần  suất  người  bình  thường  mang  gen  bệnh  là  1/50(2,5,6). Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng  như sau: giảm khả năng vận động tiến triển với  các đặc trưng là yếu cơ đối xứng gốc chi, trương  lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất,  lưỡi  rung,  biến  dạng  lồng  ngực  và  cứng  khớp.  Trường  hợp  nặng,  bệnh  nhi  chết  trong  vòng  năm đầu tiên của cuộc đời do biến chứng viêm  phổi và suy hơ hấp(4,9).  Ngun nhân chính gây bệnh SMA là do đột  biến  gen  SMN  (survival  motor  neuron).    gen  SMN nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 5  (5q13),  gồm  hai  bản  sao  SMN1  và  SMN2,  hai  gen  này  có  trình  tự  gần  như  giống  nhau,  chỉ  khác nhau ở 5 nucleotide (Hình 1.B)(9).  Hình 1: Sơ đồ vị trí của gen SMN và sự khác nhau giữa hai  gen SMN1 và SMN2 A. Cấu trúc vùng  gen SMA  gồm 4  gen: H4F5, SMN, NAIP và p44c. B. Năm vị trí nucleotide khác nhau giữa hai  gen SMN1 và SMN2.  của gen SMN1 còn 6% bệnh nhân rơi vào trường  Gen  SMN  quy  định  tổng  hợp  protein  SMN  hợp  mang  1  allele  SMN1  bị  đột  biến  mất  đoạn  biểu  hiện  chủ  yếu  ở  các  tế  bào  thần  kinh  vận  và  1  allele  SMN1  bị  đột  biến  điểm(1,4,8).  Nghiên  động tủy sống (spinal motor neuron). Cả hai gen  cứu của Ogino S. kết luận 94% bệnh nhân thối  SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương  hóa cơ tủy bị đột biến mất cả hai exon 7 của gen  ứng,  tuy  nhiên  do  sự  khác  nhau  ở  một  vài  SMN1 và đa số có kèm theo mất cả exon 8 của  nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có  gen SMN1(5). Mức độ nguy hiểm của bệnh SMA  chức năng, trong khi protein do gen SMN2 tổng  được xếp thứ hai trong các bệnh lí thần kinh ‐ cơ  hợp  có  chức  năng  rất  hạn  chế.  Do  đó,  đột  biến  di truyền chỉ sau bênh loạn dưỡng cơ Duchenne  gen SMN1 là ngun nhân chính gây nên bệnh  và chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, cuối  SMA.  Các  kết  quả  nghiên  cứu  cho  thấy  94%  cùng  bệnh  nhân  sẽ  tử  vong.  Trẻ  em  mắc  bệnh  bệnh nhân thối hóa cơ tủy bị mất cả hai bản sao  38 Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  SMA là một gánh nặng cho gia đình, xã hội và  chính bản thân bệnh nhân. Do vậy hiện nay các  nhà  khoa  học  chọn  lựa  phương  pháp  sàng  lọc  trước sinh với mục đích hạn chế sinh ra các em  bé mắc bệnh thối hóa cơ tủy.   Hiện  nay  ở  Việt  Nam,  một  số  tác  giả  đã  sử  dụng  kỹ  thuật  PCR  và  enzyme  cắt  giới  hạn  để  chẩn  đốn  bệnh  thối  hóa  cơ  tủy,  tuy  nhiên  phương  pháp  này  chỉ  phát  hiện  được  các  bệnh  nhân bị đột biến mất đoạn SMN1  đồng  hợp  tử  mà khơng phát hiện được kiểu gen dị hợp tử, do  vậy đã bỏ sót tổn thương(3). Hiện nay, Multiplex  Ligation‐dependent  Probe  Amplification  (MLPA)  là  phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn  đốn  đột  biến  mất  đoạn  ngắn,  lặp  đoạn  cũng  như phát hiện kiểu gen dị hợp tử  với độ  chính  xác cao và cho kết quả nhanh chóng(7). Xuất phát  từ thực tiễn đó, nghiên cứu được thực hiện với  mục tiêu: Nghiên cứu ứng dụng kĩ  thuật  MLPA  để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8  của gen SMN1.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  ‐  Nhóm  chứng:  30  người  bình  thường  (15  nam  và  15  nữ).  Được  dùng  để  hiệu  chỉnh  tín  hiệu  khuếch  đại  các  đoạn  dò  và  làm  mẫu  đối  chứng.  ‐ Nhóm nghiên cứu: 50 bệnh nhân được chẩn  đốn  mắc  bệnh  thối  hóa  cơ  tủy  dựa  trên  các  triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình  (tại Bệnh viện Nhi đồng I, Nhi đồng II).  Phương pháp nghiên cứu  Quy trình lấy mẫu  Bệnh  nhân  được  lấy  2  ml  máu  tĩnh  mạch  chống đơng EDTA (1,5 mg/ml). Quy trình được  đảm bảo tuyệt đối vơ trùng.  Nghiên cứu Y học Dùng  phương  pháp  kết  tủa  và  ly  tâm  qua  cột  lọc  để  tách  chiết  DNA  từ  mẫu,  kit  sử  dụng  của hãng QiAgen.  Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA  Sản  phẩm  được  kiểm  tra  bằng  máy  Nano‐ drop để đánh giá độ tinh sạch và xác định nồng  độ  DNA. Các mẫu DNA có nồng độ  từ  50  đến  250ng/μl và đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch được  sử dụng để chạy phản ứng MLPA.  Tiến hành phản ứng MLPA  Sử dụng kit SALSA MLPA P021‐A2 của Hà  Lan. Sản phẩm sau khuếch đại được phân tách  đoạn  trên  hệ  thống  điện  di  mao  quản  GenomeLab  GeXP  (Beckman  Coulter).  Kết  quả  sau khi chạy điện di sẽ được phân tích tự động  để tìm đột biến nhờ vào phần mềm GeneMarker  version 1.6 (Softgenetics).   Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng bảng và  dạng  biểu  đồ  sóng.  Mỗi  đỉnh  tín  hiệu  (peak)  là  sản  phẩm  của  một  probe.  Kích  thước  của  mỗi  peak được xác định nhờ so sánh với thang kích  thước  và  mẫu  đối  chứng  để  tính  ra  tỉ  lệ  DQ  (Dosage quotients). Từ đó tính được số bản sao  của  gen  SMN1  và  SMN2  (theo  protocol  của  MRC‐Holland).  KẾT QUẢ  Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của  các đoạn dò đặc hiệu của kit SALSA MLPA  P021‐A2  Beckman  Coulter  Genomelab  GeXP  Tiến hành phân tích 30 mẫu DNA tách chiết  từ  30  người  bình  thường  khỏe  mạnh  với  hỗn  hợp  probe  P021‐A2,  sau  đó  thu  thập  tín  hiệu  khuếch  đại  của  các  đoạn  dò  tương  ứng  với  các  exon  để  tính  giá  trị  trung  bình,  từ  đó  thiết  lập  nên  thang  chuẩn  phù  hợp  cho  hệ  thống  GenomeLab GeXP (Beckman Coulter).  Tách chiết DNA  Bảng 1: Tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu exon  SALSA MLPA probe ( gen) Exon Hiệu chỉnh tín hiệu đoạn dò Trước hiệu chỉnh (theo protocol) Sau hiệu chỉnh Q - fragments 64 – 70 – 76 – 82 64-70-76-82 X 100 100 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 39 Nghiên cứu Y học  SALSA MLPA probe ( gen) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Exon Y Reference probe 01061– 0L0727 Reference probe 01254– L00815 Reference probe 01112– L00549 Reference probe 01448– L00932 Reference probe 00808– L00638 GTF2H2 probe 01256– L00972 Reference probe 01115– L00005 RAD17 probe 01257– L00184 Reference probe 01220– L00689 GTF2H2 probe 01813– L00818 Reference probe 01120– L00060 NAIP probe 01259– L00811 Reference probe 00816– L00334 Reference probe 00807– L00325 SMN1 probe 01260– L00966 SMN2 probe 01260– L00967 Reference probe 00824– L00970 SMN1 probe 01812– L01373 SMN2 probe 01812– L01372 Reference probe 00871– L00461 Reference probe 01042– L00791 GTF2H2 probe 01262– L00971 Reference probe 00812– L00330 NAIP probe 01263–L00812 Reference probe 00965–L00552 SMN1/2 probe 01814–L00807 Reference probe 01046–L00624 SMN1/2 probe 01265–L00808 Reference probe 01160–L00716 SMN1/2 probe 01816–L00809 Reference probe 00963–L09340 SMN1/2 probe 01815–L00810 Reference probe 01108–L00679 Reference probe 01057– L00630 Reference probe 00802–L00320 SERF1B 01269–L00813 Reference probe 00846–L00377 12q15 5p13 3q12 17p11 18q21 C>G 7q21 RAD17 10p15 G>A 11q13 NAIP1 21q11 18q23 Exon Exon 3q25 Exon Exon 13q34 8q24 GTF2H2 21q21 NAIP2 2p13 SMN1/2 8p11 SMN1/2 3p25 SMN1/2 2p16 SMN1/2 8q23 17q12 13q34 SERF1B 12q24 Nhận xét: Thang chuẩn phù hợp với hệ thống  tín hiệu theo protocol của hãng cho thấy tín hiệu  của các đoạn dò là ổn định.  Kết  quả  xác  định  đột  biến  mất  đoạn  gen  SMN1 đồng hợp tử của bệnh nhi   Các  mẫu  DNA  của  bệnh  nhi  sau  khi  được  khuếch  đại  và  chạy  điện  di  mao  quản  được  phân  tích  tự  động  nhờ  vào  phần  mềm  GeneMarker version 1.6 sau đó đối chiếu với giá  40 Hiệu chỉnh tín hiệu đoạn dò Trước hiệu chỉnh (theo protocol) Sau hiệu chỉnh 105 105 140 148 157 166 175 185 193 202 210 218 229 238 247 255 270 276 285 294 300 310 319 328 337 346 355 364 373 382 391 400 409 419 427 433 445 454 463 140 148 157 166 175 185 193 202 210 218 229 238 247 255 270 276 285 294 300 310 319 328 337 346 355 364 373 382 391 400 409 419 427 433 445 454 463 trị  DQ  thu  được  kết  quả  các  trường  hợp  bệnh  nhi như hình 1, 2, bảng 2.  Ở người bình thường xuất hiện hai đỉnh ở vị  trí probe 270nt (biểu hiện sản phẩm của exon 7)  và 294nt (biểu hiện sản phẩm của exon 8), trong  khi đó ở bệnh nhân lại khơng xuất hiện hai đỉnh  này (tương ứng với giá trị DQ=0), chứng tỏ các  probe  đặc  hiệu  khơng  được  gắn  vào  hai  exon  Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  này, do đó kết luận gen SMN1 bị mất hai exon 7  Nghiên cứu Y học và 8 trên cả hai allele, tức kiểu gen đồng hợp tử.  Hình 2: Kết quả điện di mao quản ở bệnh nhi mã số SMA57. Màu nhạt (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân SMA57.  Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen SMN1 dị hợp tử của bệnh nhi   Hình 3: Kết quả điện di mao quản ở bệnh nhi mã số SMA61. Màu nhạt (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên  phải): mẫu bệnh nhân SMA57.  Nhận xét: Bệnh nhân có kích thước đỉnh exon  7  (270nt)  và  exon  8  (294nt)  bằng  ½  so  với  mẫu  Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học đối  chứng,  tương  ứng  với  giá  trị  DQ=0,484  và  0,597. Điều này chứng tỏ  lượng probe đặc hiệu  41 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học  bắt  tại  hai  exon  này  chỉ  bằng  một  nửa  so  với  người bình thường, do đó kết luận gen SMN1 bị  mất hai exon 7 và 8 chỉ trên một allele, tức kiểu  gen dị hợp tử.  Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1  Bảng 2: Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1 ở bệnh  nhân SMA  Kết phân tích Mất đoạn đồng hợp tử Mất đoạn dị hợp tử Không phát đoạn Tổng số Số lượng (người) 33 08 09 50 Tỷ lệ (%) 66 16 18 100 Nhận  xét:  Kết  quả  phân  tích  đã  phát  hiện  được  33/50  (chiếm  66%)  trường  hợp  bệnh  nhi  mang  đột  biến  mất  đoạn  gen  SMN1  đồng  hợp  tử,  phát  hiện  được  08  trường  hợp  (16%)  mang  đột  biến  mất  đoạn  dị  hợp  tử.  18%  bệnh  nhân  không bị đột biến mất đoạn SMN1.  Bảng 3: Vị trí đột biến mất đoạn trên gen SMN1  Vị trí đột biến đoạn Đột biến exon Đột biến exon 7, không exon Tổng Số bệnh nhân 29 Tỷ lệ (%) 87,9 12,1 33 100 Nhận xét: Trong số 26 bệnh nhân bị đột biến  mất  đoạn  đồng  hợp  tử  gen  SMN1,  có  25  bệnh  nhân mang đột biến mất đoạn cả hai exon 7 và 8  (chiếm 89,3%), chỉ có 3/28 bệnh nhân mất đoạn  riêng lẽ exon 7 mà khơng mất đoạn exon 8.   BÀN LUẬN  Bệnh thối hóa cơ tủy có tần suất mắc bệnh  khoảng 1/10.000 đến 1/25.000, trong khi đó tỷ lệ  người  lành  mang  gen  bệnh  khá  cao  1/50  đến  1/40. Nguyên nhân đã  được  xác  định  là  do  đột  biến gen SMN1. Xác suất của cặp vợ chồng cùng  mang gen dị hợp tử sinh con mắc bệnh là 25%,  sinh con mang gen dị hợp tử là 50% và chỉ 25%  số con của họ có kiểu gen SMN1 bình thường(2, 6).  Ở các nước phát triển, bệnh đã được kiểm sốt  từ  giai  đoạn  chẩn  đốn  người  lành  mang  gen,  sau đó thực hiện kỹ thuật PGD (Preimplantation  Genetics  Diagnosis)  để  chọn  ra  các  phơi  bình  thường  và  cấy  vào  tử  cung  của  người  mẹ.  Do  vậy  tỷ  lệ  mắc  bệnh  SMA  được  khống  chế  hiệu  42 quả. Ở Việt Nam, các bệnh lý di truyền vẫn còn  là vấn đề khó khăn của ngành y tế, một số bệnh  lý  như  thalassemia  đã  được  đưa  vào  chương  trình quốc gia để kiểm sốt do tỷ lệ bệnh nhân  và người lành mang gen tăng rất cao trong cộng  đồng(9). Bệnh SMA chỉ mới được quan tâm trong  2 năm trở lại đây, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử  đã  giúp  chẩn  đốn  xác  định  bệnh,  từ  đó  giúp  phân biệt ngun nhân khó thở ở trẻ sơ sinh là  do  sự  yếu  cơ  trong  bệnh  SMA  hay  do  nguyên  nhân  khác.  Chính  việc  xác  định  nguyên  nhân  này  giúp  cho  bác  sĩ  lâm  sàng  định  hướng  điều  trị và theo dõi hiệu quả, chính xác hơn.  Có nhiều kỹ thuật chẩn đốn bệnh SMA. Ở  Việt  Nam  chỉ  một  số  labo  di  truyền  thiết  lập  được  quy  trình  chẩn  đốn  bệnh  này,  trong  đó  phương  pháp  PCR‐RFLP  được  sử  dụng  nhiều  do dễ thực hiện và giá thành hợp lý(3). Tuy nhiên  phương pháp PCR‐RFLP chỉ phát hiện các bệnh  nhân mất đoạn SMN1 ở dạng đồng hợp tử chứ  không  thể  phát  hiện  được  các  đối  tượng  mang  kiểu gen dị hợp tử(5). Để khắc phục nhược điểm  này  các  nhà  khoa  học  đã  nghiên  cứu  và  phát  hiện tính ưu việt của phương pháp MLPA trong  chẩn đốn SMA. Do tính nhạy cao, lượng probe  bắt lên DNA đích phụ thuộc vào sự có mặt của  số  lượng  bản  sao  DNA  đích,  qua  điện  di  mao  quản đã phát hiện chính xác tỷ lệ số lượng bản  sao  của  gen  SMN1.  Dạng  đột  biến  mất  đoạn  đồng  hợp  tử  trên  gen  SMN1sẽ  làm  sản  phẩm  khuếch đại khơng có hai đỉnh probe tương ứng  với  kích  thước  270nt  và  294nt,  trong  khi  đó  ở  người bình thường vẫn xuất hiện hai đỉnh này.  Các  bệnh  nhân  mất  đoạn  dị  hợp  tử  có  đỉnh  270nt  và  294nt  chỉ  bằng  ½  so  với  người  bình  thường(4).  Trong  nghiên  cứu  này,  chúng  tơi  đã  phát  hiện  33/50  bệnh  nhân  (chiếm  66%)  bị  đột  biến mất đoạn gen SMN1 trên cả hai allele. Bên  cạnh đó phát hiện 08/50 bệnh nhân (chiếm 16%)  mang  đột  biến  dị  hợp  tử,  chỉ  mất  đoạn  gen  SMN1 trên 1 allele, 18% bệnh nhân không bị đột  biến  mất  đoạn.  Kết  quả  này  khác  biệt  so  với  nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, theo các  nghiên  cứu  tỷ  lệ  đột  biến  mất  đoạn  gen  SMN1  đồng hợp tử ở bệnh nhân SMA là 94%. Cuvin C  Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013  và  cộng  sự  đã  nghiên  cứu  trên  193  bệnh  nhân  SMA và phát hiện 95,5% bệnh nhân bị đột biến  mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử(2). Năm 2008,  Song  F  và  cộng  sự  đã  phân  tích  gen  của  267  bệnh nhân SMA và phát hiện 68,5% bệnh nhân  mất đoạn đồng hợp tử exon 7 và exon 8, ngồi  ra  12,7%  bệnh  nhân  mất  đoạn  đồng  hợp  tử  chỉ  exon  7,  bên  cạnh  đó  12,4%  bệnh  nhân  đột  biến  mất đoạn dị hợp tử exon 7 và 8, tỷ lệ bệnh nhân  không  bị  đột  biến  mất  đoạn  là  6,4%(8).  Ở  Việt  Nam,  nghiên  cứu  của  Lê  Thị  Hương  Lan  cho  thấy  có  52/60  bệnh  nhân  SMA  ở  miền  Bắc  Việt  Nam bị đột biến mất đoạn gen SMN1, chiếm tỷ  lệ 81%. Như vậy kết quả phát hiện đột biến mất  đoạn exon 7 và 8 ở bệnh nhân SMA của chúng  tơi thấp hơn nhiều so với các tác giả khác. Điều  này được giải thích do số lượng mẫu nghiên cứu  của  chúng  tơi  còn  hạn  chế.  Một  ngun  nhân  khác được phân tích là do trẻ sơ sinh SMA type  1  thường  bị  suy  hơ  hấp  sớm,  khó  chẩn  đốn  phân biệt với các ngun nhân khó thở khác nên  các  chun  gia  lâm  sàng  thường  mong  muốn  chẩn  đoán  xác  định  sớm  để  có  hướng  điều  trị  hiệu quả cho bệnh nhân, do vậy bác sĩ chỉ định  xét  nghiệm  rộng  rãi,  trong  khi  chưa  thực  hiện  xét  nghiệm  đặc  hiệu  để  chẩn  đốn  phân  biệt  bệnh SMA với các bệnh lý cơ khác như sinh thiết  cơ, điện cơ đồ,… Nghiên cứu của chúng tơi cho  thấy  có  4/33  bệnh  nhân  (chiếm  12,1%)  chỉ  mất  đoạn  exon  7  mà  không  mất  exon  8,  điều  này  cũng tương tự nghiên cứu của các tác giả khác,  nhiều nghiên cứu đã khẳng định, đột biến exon  7 là yếu tố quyết định gây bệnh SMA cho dù có  kèm đột biến exon 8 hay khơng(5). Bên cạnh đó,  nghiên cứu chúng tơi còn phát hiện 08/50 bệnh  nhân (chiếm 16%) bị đột biến mất đoạn dị hợp  tử,  tỷ  lệ  này  tương  tự  như  nghiên  cứu  của  Song F. Các bệnh nhân này cần được giải trình  tự để xác định đột biến điểm trên allele còn lại  vì  theo  các  nghiên  cứu,  có  khoảng  6‐7%  bệnh  nhân SMA có mang đột biến điểm(8).  Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN  Nghiên cứu đã áp dụng thành cơng phương  pháp  MLPA  trong  xác  định  kiểu  đột  biến  mất  đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở bệnh nhân  được  chẩn  đoán  SMA  và  xác  định  tỷ  lệ  mang  đột  biến  mất  đoạn  ở  bệnh  nhân  SMA  tại  Việt  Nam.  Nghiên  cứu  sẽ  tiếp  tục  thực  hiện  trên  cỡ  mẫu lớn hơn và xây dựng quy trình giải trình tự  để  xác  định  đột  biến  điểm  ở  các  bệnh  nhân  mang kiểu gen dị hợp tử, từ đó lập nên bản đồ  đột biến gen SMN1 tại Việt Nam  TÀI LIỆU THAM KHẢO  Clermont O, Burlet P, Benit P, Chanterau D, Saugier‐Veber P,  Munnich A, et al (2004). Molecular analysis of SMA patients  without  homozygous  SMN1  deletions  using  a  new  strategy  for identification of SMN1 subtle mutations. Hum Mutat, 24:  417‐427.   Cusin  V,  Clermont  O,  Chantereau  D,  Elion  J  (2003).  Prevalence  of  SMN1  deletion  and  duplication  in  carrier  and  normal populations: implication for genetic counselling. JMed  Genet, 40, e39.  Hoàng  thị  Huyền,  Đỗ  Thị  Thanh  Thủy,  Nguyễn  Thị  Thu  Tâm, Nguyễn Kiến Minh, Trần Diệp Tuấn, Nguyễn Thị Băng  Sương  (2012).  Ứng  dụng  kỹ  thuật  PCR‐RFLP  (Restriction  fragment length polymorphism) xác định đột biến gen SMN1  gây bệnh thối hóa cơ tủy. Y học  Thành  phố  Hồ  Chí  Minh,  Tập 16: tr.79‐85.  Nguyễn  Thị  Băng  Sương  (2013).  Bệnh  thối  hóa  cơ  tủy.  In:  Nguyễn Thị Băng Sương. Kỹ thuật chẩn đốn bệnh di truyền,  ấn bản lần 1, tr.135‐149. NXB Y học, TP. Hồ Chí Minh.  Ogino  S,  Wilson  RB,  Gold  B  (2004).  New  insights  on  the  evolution  of  the  SMN1  and  SMN2  region:  simulation  and  meta‐analysis for allele and haplotype frequency calculations.  Eur J Hum Genet, 12: 1015‐23.  Ogino  S.,  Wilson  RB.  (2002).  Genetic  testing  and  risk  assessment  for  spinal  muscular  atrophy  (SMA).  Hum  Genet  111: 477‐500.  Schouten  JP,  McElgunn  CJ,  Waaijer  R,  Zwijnenburg  D,  Diepvens  F,  Pals  G  (2002).  Relative  quantification  of  40  nucleic acid sequences by multiplex ligation‐dependent probe  amplification. Nucleic Acids Res, 30(12):e57  Song  F,  Qu  YJ,  Zou  LP,  Wang  LW,  Long  MJ,  Wang  X,  et  al  (2008).  Molecular  analysis  of  survival  motor  neuron  gene  in  338  suspicious  children  patients  with  spinal  muscular  atrophy. Chin J Pediatr (Chin), 46: 919‐923.  Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Lê Minh  Khôi,  Nguyễn  Thị  Băng  Sương  (2011).  Bệnh  Học  phân  tử.  Nxb Y Học, 198‐206.    Ngày nhận bài      Ngày phản biện nhận xét bài báo  Ngày bài báo được đăng:     29/08/2013.   04/09/2013.  18/10/2013      Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 43 ... Minh,  Tập 16: tr.79‐85.  Nguyễn  Thị  Băng  Sương  (2013).  Bệnh thối  hóa cơ tủy.   In:  Nguyễn Thị Băng Sương. Kỹ thuật chẩn đốn bệnh di truyền,   ấn bản lần 1, tr.135‐149. NXB Y học, TP. Hồ Chí Minh. ... tác  giả  đã  sử  dụng  kỹ thuật PCR  và  enzyme  cắt  giới  hạn  để  chẩn đốn  bệnh thối  hóa cơ tủy,   tuy  nhiên  phương  pháp  này  chỉ  phát  hiện  được  các  bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 ... một  trong  những  bệnh thần  kinh  cơ di truyền hay  gặp  nhất. Tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 và tần  suất  người  bình  thường  mang  gen  bệnh là  1/50(2,5,6). Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng