Bài viết Chẩn đoán nguyên nhân di truyền gây bệnh thoái hóa cơ tủy bằng kỹ thuật multiplex ligation‐dependent probe amplification có nội dung với mục tiêu nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học CHẨN ĐỐN NGUN NHÂN DI TRUYỀN GÂY BỆNH THỐI HĨA CƠ TỦY BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX LIGATION‐DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION Nguyễn Thị Băng Sương*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Dương Thị Huệ**, Lê Thị Khánh Vân***, Trần Diệp Tuấn*. TĨM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh thối hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy: SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường. Khoảng 94 % trường hợp bệnh nhân SMA bị mất cả hai bản sao của gen SMN1 còn 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp mang 1 allele SMN1 bị đột biến mất đoạn và 1 allele SMN1 bị đột biến điểm. Mục tiêu: Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 50 bệnh nhi được chẩn đốn mắc bệnh SMA dựa vào các triệu chứng lâm sàng điển hình, DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của bệnh nhân. Thực hiện phản ứng MLPA sử dụng kit SALSA MLPA P021‐A2 của Hà Lan để phát hiện đột biến mất đoạn gen SMN1. Kết quả: Phát hiện được 33/50 (chiếm 66%) trường hợp bệnh nhi mang đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử, 08 trường hợp (chiếm 16%) mang đột biến mất đoạn gen SMN1 dị hợp tử. Kết luận: Áp dụng thành cơng phương pháp MLPA trong xác định kiểu đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở bệnh nhân được chẩn đốn SMA. Từ khóa: MLPA, thối hóa cơ tủy SMA, đột biến gen SMN1, chẩn đốn trước sinh bệnh SMA. ABSTRACT DETECTION OF GENETIC MUTATION WHICH CAUSES SPINAL MUSCULAR ATROPHY DISEASE BY MULTIPLEX LIGATION‐ DEPENDENT AMPLIFICATION PROBE METHODE Nguyen Thi Bang Suong, Do Thi Thanh Thuy, Duong Thi Hue, Le Thi Khanh Van, Tran Diep Tuan. * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 36 ‐ 42 Background: Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disorder, with an incidence of about 1 in 10000 live births and with a carrier frequency of about 1 in 50. Approximately 94% of SMA patients have a homozygote deletion of exon 7 in the SMN1 gene. The remaining 6% of patients have a point mutations in one allele and a deletion in the other. Objectives: We studied the application of MLPA technique to diagnose deletion mutations in SMN1 gene cause spinal muscular atrophy disease. Patients and Methods: Genomic DNA of 50 SMA patients were extracted from peripheral blood leukocytes using the QiAgen kit. MLPA technique was performed to detect deletion mutation of SMN1 gene. Results: There were 33/50 patients with deletion homozygous on SMN1 gene deletion, 08 patients had deletion heterozygotes. Conclusion: Application successfully of MLPA method in identify deletion in SMN1 gene. Keywords: MLPA, SMA, SMN1, Prenatal diagnosis of SMA * **Khoa Sinh, Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ***Khoa Thần Kinh, Bệnh viện Nhi Đồng 2 Tác giả liên lạc: TS.BS. Nguyễn Thị Băng Sương‐ ĐT: 0914007038‐ Email: suongnguyenmd@gmail.com. Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 37 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Thối hóa cơ tủy (Spinal Muscular Atrophy: SMA) là bệnh di truyền do gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường, bệnh được mô tả đầu tiên bởi nhà thần kinh học Guido Wernig (người Australia) vào năm 1891(9). Đây là một trong những bệnh thần kinh cơ di truyền hay gặp nhất. Tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 và tần suất người bình thường mang gen bệnh là 1/50(2,5,6). Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng như sau: giảm khả năng vận động tiến triển với các đặc trưng là yếu cơ đối xứng gốc chi, trương lực cơ giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất, lưỡi rung, biến dạng lồng ngực và cứng khớp. Trường hợp nặng, bệnh nhi chết trong vòng năm đầu tiên của cuộc đời do biến chứng viêm phổi và suy hơ hấp(4,9). Ngun nhân chính gây bệnh SMA là do đột biến gen SMN (survival motor neuron). gen SMN nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 5 (5q13), gồm hai bản sao SMN1 và SMN2, hai gen này có trình tự gần như giống nhau, chỉ khác nhau ở 5 nucleotide (Hình 1.B)(9). Hình 1: Sơ đồ vị trí của gen SMN và sự khác nhau giữa hai gen SMN1 và SMN2 A. Cấu trúc vùng gen SMA gồm 4 gen: H4F5, SMN, NAIP và p44c. B. Năm vị trí nucleotide khác nhau giữa hai gen SMN1 và SMN2. của gen SMN1 còn 6% bệnh nhân rơi vào trường Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN hợp mang 1 allele SMN1 bị đột biến mất đoạn biểu hiện chủ yếu ở các tế bào thần kinh vận và 1 allele SMN1 bị đột biến điểm(1,4,8). Nghiên động tủy sống (spinal motor neuron). Cả hai gen cứu của Ogino S. kết luận 94% bệnh nhân thối SMN1 và SMN2 đều tổng hợp ra protein tương hóa cơ tủy bị đột biến mất cả hai exon 7 của gen ứng, tuy nhiên do sự khác nhau ở một vài SMN1 và đa số có kèm theo mất cả exon 8 của nucleotide nên SMN1 tổng hợp được protein có gen SMN1(5). Mức độ nguy hiểm của bệnh SMA chức năng, trong khi protein do gen SMN2 tổng được xếp thứ hai trong các bệnh lí thần kinh ‐ cơ hợp có chức năng rất hạn chế. Do đó, đột biến di truyền chỉ sau bênh loạn dưỡng cơ Duchenne gen SMN1 là ngun nhân chính gây nên bệnh và chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, cuối SMA. Các kết quả nghiên cứu cho thấy 94% cùng bệnh nhân sẽ tử vong. Trẻ em mắc bệnh bệnh nhân thối hóa cơ tủy bị mất cả hai bản sao 38 Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 SMA là một gánh nặng cho gia đình, xã hội và chính bản thân bệnh nhân. Do vậy hiện nay các nhà khoa học chọn lựa phương pháp sàng lọc trước sinh với mục đích hạn chế sinh ra các em bé mắc bệnh thối hóa cơ tủy. Hiện nay ở Việt Nam, một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR và enzyme cắt giới hạn để chẩn đốn bệnh thối hóa cơ tủy, tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện được các bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà khơng phát hiện được kiểu gen dị hợp tử, do vậy đã bỏ sót tổn thương(3). Hiện nay, Multiplex Ligation‐dependent Probe Amplification (MLPA) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đốn đột biến mất đoạn ngắn, lặp đoạn cũng như phát hiện kiểu gen dị hợp tử với độ chính xác cao và cho kết quả nhanh chóng(7). Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu ‐ Nhóm chứng: 30 người bình thường (15 nam và 15 nữ). Được dùng để hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại các đoạn dò và làm mẫu đối chứng. ‐ Nhóm nghiên cứu: 50 bệnh nhân được chẩn đốn mắc bệnh thối hóa cơ tủy dựa trên các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình (tại Bệnh viện Nhi đồng I, Nhi đồng II). Phương pháp nghiên cứu Quy trình lấy mẫu Bệnh nhân được lấy 2 ml máu tĩnh mạch chống đơng EDTA (1,5 mg/ml). Quy trình được đảm bảo tuyệt đối vơ trùng. Nghiên cứu Y học Dùng phương pháp kết tủa và ly tâm qua cột lọc để tách chiết DNA từ mẫu, kit sử dụng của hãng QiAgen. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA Sản phẩm được kiểm tra bằng máy Nano‐ drop để đánh giá độ tinh sạch và xác định nồng độ DNA. Các mẫu DNA có nồng độ từ 50 đến 250ng/μl và đạt tiêu chuẩn về độ tinh sạch được sử dụng để chạy phản ứng MLPA. Tiến hành phản ứng MLPA Sử dụng kit SALSA MLPA P021‐A2 của Hà Lan. Sản phẩm sau khuếch đại được phân tách đoạn trên hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP (Beckman Coulter). Kết quả sau khi chạy điện di sẽ được phân tích tự động để tìm đột biến nhờ vào phần mềm GeneMarker version 1.6 (Softgenetics). Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng bảng và dạng biểu đồ sóng. Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) là sản phẩm của một probe. Kích thước của mỗi peak được xác định nhờ so sánh với thang kích thước và mẫu đối chứng để tính ra tỉ lệ DQ (Dosage quotients). Từ đó tính được số bản sao của gen SMN1 và SMN2 (theo protocol của MRC‐Holland). KẾT QUẢ Kết quả hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu của kit SALSA MLPA P021‐A2 Beckman Coulter Genomelab GeXP Tiến hành phân tích 30 mẫu DNA tách chiết từ 30 người bình thường khỏe mạnh với hỗn hợp probe P021‐A2, sau đó thu thập tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò tương ứng với các exon để tính giá trị trung bình, từ đó thiết lập nên thang chuẩn phù hợp cho hệ thống GenomeLab GeXP (Beckman Coulter). Tách chiết DNA Bảng 1: Tín hiệu khuếch đại của các đoạn dò đặc hiệu exon SALSA MLPA probe ( gen) Exon Hiệu chỉnh tín hiệu đoạn dò Trước hiệu chỉnh (theo protocol) Sau hiệu chỉnh Q - fragments 64 – 70 – 76 – 82 64-70-76-82 X 100 100 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 39 Nghiên cứu Y học SALSA MLPA probe ( gen) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Exon Y Reference probe 01061– 0L0727 Reference probe 01254– L00815 Reference probe 01112– L00549 Reference probe 01448– L00932 Reference probe 00808– L00638 GTF2H2 probe 01256– L00972 Reference probe 01115– L00005 RAD17 probe 01257– L00184 Reference probe 01220– L00689 GTF2H2 probe 01813– L00818 Reference probe 01120– L00060 NAIP probe 01259– L00811 Reference probe 00816– L00334 Reference probe 00807– L00325 SMN1 probe 01260– L00966 SMN2 probe 01260– L00967 Reference probe 00824– L00970 SMN1 probe 01812– L01373 SMN2 probe 01812– L01372 Reference probe 00871– L00461 Reference probe 01042– L00791 GTF2H2 probe 01262– L00971 Reference probe 00812– L00330 NAIP probe 01263–L00812 Reference probe 00965–L00552 SMN1/2 probe 01814–L00807 Reference probe 01046–L00624 SMN1/2 probe 01265–L00808 Reference probe 01160–L00716 SMN1/2 probe 01816–L00809 Reference probe 00963–L09340 SMN1/2 probe 01815–L00810 Reference probe 01108–L00679 Reference probe 01057– L00630 Reference probe 00802–L00320 SERF1B 01269–L00813 Reference probe 00846–L00377 12q15 5p13 3q12 17p11 18q21 C>G 7q21 RAD17 10p15 G>A 11q13 NAIP1 21q11 18q23 Exon Exon 3q25 Exon Exon 13q34 8q24 GTF2H2 21q21 NAIP2 2p13 SMN1/2 8p11 SMN1/2 3p25 SMN1/2 2p16 SMN1/2 8q23 17q12 13q34 SERF1B 12q24 Nhận xét: Thang chuẩn phù hợp với hệ thống tín hiệu theo protocol của hãng cho thấy tín hiệu của các đoạn dò là ổn định. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử của bệnh nhi Các mẫu DNA của bệnh nhi sau khi được khuếch đại và chạy điện di mao quản được phân tích tự động nhờ vào phần mềm GeneMarker version 1.6 sau đó đối chiếu với giá 40 Hiệu chỉnh tín hiệu đoạn dò Trước hiệu chỉnh (theo protocol) Sau hiệu chỉnh 105 105 140 148 157 166 175 185 193 202 210 218 229 238 247 255 270 276 285 294 300 310 319 328 337 346 355 364 373 382 391 400 409 419 427 433 445 454 463 140 148 157 166 175 185 193 202 210 218 229 238 247 255 270 276 285 294 300 310 319 328 337 346 355 364 373 382 391 400 409 419 427 433 445 454 463 trị DQ thu được kết quả các trường hợp bệnh nhi như hình 1, 2, bảng 2. Ở người bình thường xuất hiện hai đỉnh ở vị trí probe 270nt (biểu hiện sản phẩm của exon 7) và 294nt (biểu hiện sản phẩm của exon 8), trong khi đó ở bệnh nhân lại khơng xuất hiện hai đỉnh này (tương ứng với giá trị DQ=0), chứng tỏ các probe đặc hiệu khơng được gắn vào hai exon Chun Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 này, do đó kết luận gen SMN1 bị mất hai exon 7 Nghiên cứu Y học và 8 trên cả hai allele, tức kiểu gen đồng hợp tử. Hình 2: Kết quả điện di mao quản ở bệnh nhi mã số SMA57. Màu nhạt (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải): mẫu bệnh nhân SMA57. Kết quả xác định đột biến mất đoạn gen SMN1 dị hợp tử của bệnh nhi Hình 3: Kết quả điện di mao quản ở bệnh nhi mã số SMA61. Màu nhạt (cột phía bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải): mẫu bệnh nhân SMA57. Nhận xét: Bệnh nhân có kích thước đỉnh exon 7 (270nt) và exon 8 (294nt) bằng ½ so với mẫu Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học đối chứng, tương ứng với giá trị DQ=0,484 và 0,597. Điều này chứng tỏ lượng probe đặc hiệu 41 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học bắt tại hai exon này chỉ bằng một nửa so với người bình thường, do đó kết luận gen SMN1 bị mất hai exon 7 và 8 chỉ trên một allele, tức kiểu gen dị hợp tử. Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1 Bảng 2: Tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1 ở bệnh nhân SMA Kết phân tích Mất đoạn đồng hợp tử Mất đoạn dị hợp tử Không phát đoạn Tổng số Số lượng (người) 33 08 09 50 Tỷ lệ (%) 66 16 18 100 Nhận xét: Kết quả phân tích đã phát hiện được 33/50 (chiếm 66%) trường hợp bệnh nhi mang đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử, phát hiện được 08 trường hợp (16%) mang đột biến mất đoạn dị hợp tử. 18% bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn SMN1. Bảng 3: Vị trí đột biến mất đoạn trên gen SMN1 Vị trí đột biến đoạn Đột biến exon Đột biến exon 7, không exon Tổng Số bệnh nhân 29 Tỷ lệ (%) 87,9 12,1 33 100 Nhận xét: Trong số 26 bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử gen SMN1, có 25 bệnh nhân mang đột biến mất đoạn cả hai exon 7 và 8 (chiếm 89,3%), chỉ có 3/28 bệnh nhân mất đoạn riêng lẽ exon 7 mà khơng mất đoạn exon 8. BÀN LUẬN Bệnh thối hóa cơ tủy có tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 đến 1/25.000, trong khi đó tỷ lệ người lành mang gen bệnh khá cao 1/50 đến 1/40. Nguyên nhân đã được xác định là do đột biến gen SMN1. Xác suất của cặp vợ chồng cùng mang gen dị hợp tử sinh con mắc bệnh là 25%, sinh con mang gen dị hợp tử là 50% và chỉ 25% số con của họ có kiểu gen SMN1 bình thường(2, 6). Ở các nước phát triển, bệnh đã được kiểm sốt từ giai đoạn chẩn đốn người lành mang gen, sau đó thực hiện kỹ thuật PGD (Preimplantation Genetics Diagnosis) để chọn ra các phơi bình thường và cấy vào tử cung của người mẹ. Do vậy tỷ lệ mắc bệnh SMA được khống chế hiệu 42 quả. Ở Việt Nam, các bệnh lý di truyền vẫn còn là vấn đề khó khăn của ngành y tế, một số bệnh lý như thalassemia đã được đưa vào chương trình quốc gia để kiểm sốt do tỷ lệ bệnh nhân và người lành mang gen tăng rất cao trong cộng đồng(9). Bệnh SMA chỉ mới được quan tâm trong 2 năm trở lại đây, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp chẩn đốn xác định bệnh, từ đó giúp phân biệt ngun nhân khó thở ở trẻ sơ sinh là do sự yếu cơ trong bệnh SMA hay do nguyên nhân khác. Chính việc xác định nguyên nhân này giúp cho bác sĩ lâm sàng định hướng điều trị và theo dõi hiệu quả, chính xác hơn. Có nhiều kỹ thuật chẩn đốn bệnh SMA. Ở Việt Nam chỉ một số labo di truyền thiết lập được quy trình chẩn đốn bệnh này, trong đó phương pháp PCR‐RFLP được sử dụng nhiều do dễ thực hiện và giá thành hợp lý(3). Tuy nhiên phương pháp PCR‐RFLP chỉ phát hiện các bệnh nhân mất đoạn SMN1 ở dạng đồng hợp tử chứ không thể phát hiện được các đối tượng mang kiểu gen dị hợp tử(5). Để khắc phục nhược điểm này các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện tính ưu việt của phương pháp MLPA trong chẩn đốn SMA. Do tính nhạy cao, lượng probe bắt lên DNA đích phụ thuộc vào sự có mặt của số lượng bản sao DNA đích, qua điện di mao quản đã phát hiện chính xác tỷ lệ số lượng bản sao của gen SMN1. Dạng đột biến mất đoạn đồng hợp tử trên gen SMN1sẽ làm sản phẩm khuếch đại khơng có hai đỉnh probe tương ứng với kích thước 270nt và 294nt, trong khi đó ở người bình thường vẫn xuất hiện hai đỉnh này. Các bệnh nhân mất đoạn dị hợp tử có đỉnh 270nt và 294nt chỉ bằng ½ so với người bình thường(4). Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã phát hiện 33/50 bệnh nhân (chiếm 66%) bị đột biến mất đoạn gen SMN1 trên cả hai allele. Bên cạnh đó phát hiện 08/50 bệnh nhân (chiếm 16%) mang đột biến dị hợp tử, chỉ mất đoạn gen SMN1 trên 1 allele, 18% bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn. Kết quả này khác biệt so với nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, theo các nghiên cứu tỷ lệ đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử ở bệnh nhân SMA là 94%. Cuvin C Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 và cộng sự đã nghiên cứu trên 193 bệnh nhân SMA và phát hiện 95,5% bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gen SMN1 đồng hợp tử(2). Năm 2008, Song F và cộng sự đã phân tích gen của 267 bệnh nhân SMA và phát hiện 68,5% bệnh nhân mất đoạn đồng hợp tử exon 7 và exon 8, ngồi ra 12,7% bệnh nhân mất đoạn đồng hợp tử chỉ exon 7, bên cạnh đó 12,4% bệnh nhân đột biến mất đoạn dị hợp tử exon 7 và 8, tỷ lệ bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn là 6,4%(8). Ở Việt Nam, nghiên cứu của Lê Thị Hương Lan cho thấy có 52/60 bệnh nhân SMA ở miền Bắc Việt Nam bị đột biến mất đoạn gen SMN1, chiếm tỷ lệ 81%. Như vậy kết quả phát hiện đột biến mất đoạn exon 7 và 8 ở bệnh nhân SMA của chúng tơi thấp hơn nhiều so với các tác giả khác. Điều này được giải thích do số lượng mẫu nghiên cứu của chúng tơi còn hạn chế. Một ngun nhân khác được phân tích là do trẻ sơ sinh SMA type 1 thường bị suy hơ hấp sớm, khó chẩn đốn phân biệt với các ngun nhân khó thở khác nên các chun gia lâm sàng thường mong muốn chẩn đoán xác định sớm để có hướng điều trị hiệu quả cho bệnh nhân, do vậy bác sĩ chỉ định xét nghiệm rộng rãi, trong khi chưa thực hiện xét nghiệm đặc hiệu để chẩn đốn phân biệt bệnh SMA với các bệnh lý cơ khác như sinh thiết cơ, điện cơ đồ,… Nghiên cứu của chúng tơi cho thấy có 4/33 bệnh nhân (chiếm 12,1%) chỉ mất đoạn exon 7 mà không mất exon 8, điều này cũng tương tự nghiên cứu của các tác giả khác, nhiều nghiên cứu đã khẳng định, đột biến exon 7 là yếu tố quyết định gây bệnh SMA cho dù có kèm đột biến exon 8 hay khơng(5). Bên cạnh đó, nghiên cứu chúng tơi còn phát hiện 08/50 bệnh nhân (chiếm 16%) bị đột biến mất đoạn dị hợp tử, tỷ lệ này tương tự như nghiên cứu của Song F. Các bệnh nhân này cần được giải trình tự để xác định đột biến điểm trên allele còn lại vì theo các nghiên cứu, có khoảng 6‐7% bệnh nhân SMA có mang đột biến điểm(8). Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Nghiên cứu đã áp dụng thành cơng phương pháp MLPA trong xác định kiểu đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen SMN1 ở bệnh nhân được chẩn đoán SMA và xác định tỷ lệ mang đột biến mất đoạn ở bệnh nhân SMA tại Việt Nam. Nghiên cứu sẽ tiếp tục thực hiện trên cỡ mẫu lớn hơn và xây dựng quy trình giải trình tự để xác định đột biến điểm ở các bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử, từ đó lập nên bản đồ đột biến gen SMN1 tại Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Clermont O, Burlet P, Benit P, Chanterau D, Saugier‐Veber P, Munnich A, et al (2004). Molecular analysis of SMA patients without homozygous SMN1 deletions using a new strategy for identification of SMN1 subtle mutations. Hum Mutat, 24: 417‐427. Cusin V, Clermont O, Chantereau D, Elion J (2003). Prevalence of SMN1 deletion and duplication in carrier and normal populations: implication for genetic counselling. JMed Genet, 40, e39. Hoàng thị Huyền, Đỗ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Thu Tâm, Nguyễn Kiến Minh, Trần Diệp Tuấn, Nguyễn Thị Băng Sương (2012). Ứng dụng kỹ thuật PCR‐RFLP (Restriction fragment length polymorphism) xác định đột biến gen SMN1 gây bệnh thối hóa cơ tủy. Y học Thành phố Hồ Chí Minh, Tập 16: tr.79‐85. Nguyễn Thị Băng Sương (2013). Bệnh thối hóa cơ tủy. In: Nguyễn Thị Băng Sương. Kỹ thuật chẩn đốn bệnh di truyền, ấn bản lần 1, tr.135‐149. NXB Y học, TP. Hồ Chí Minh. Ogino S, Wilson RB, Gold B (2004). New insights on the evolution of the SMN1 and SMN2 region: simulation and meta‐analysis for allele and haplotype frequency calculations. Eur J Hum Genet, 12: 1015‐23. Ogino S., Wilson RB. (2002). Genetic testing and risk assessment for spinal muscular atrophy (SMA). Hum Genet 111: 477‐500. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002). Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation‐dependent probe amplification. Nucleic Acids Res, 30(12):e57 Song F, Qu YJ, Zou LP, Wang LW, Long MJ, Wang X, et al (2008). Molecular analysis of survival motor neuron gene in 338 suspicious children patients with spinal muscular atrophy. Chin J Pediatr (Chin), 46: 919‐923. Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Lê Minh Khôi, Nguyễn Thị Băng Sương (2011). Bệnh Học phân tử. Nxb Y Học, 198‐206. Ngày nhận bài Ngày phản biện nhận xét bài báo Ngày bài báo được đăng: 29/08/2013. 04/09/2013. 18/10/2013 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 43 ... Minh, Tập 16: tr.79‐85. Nguyễn Thị Băng Sương (2013). Bệnh thối hóa cơ tủy. In: Nguyễn Thị Băng Sương. Kỹ thuật chẩn đốn bệnh di truyền, ấn bản lần 1, tr.135‐149. NXB Y học, TP. Hồ Chí Minh. ... tác giả đã sử dụng kỹ thuật PCR và enzyme cắt giới hạn để chẩn đốn bệnh thối hóa cơ tủy, tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện được các bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 ... một trong những bệnh thần kinh cơ di truyền hay gặp nhất. Tần suất mắc bệnh khoảng 1/10.000 và tần suất người bình thường mang gen bệnh là 1/50(2,5,6). Bệnh nhân có các triệu chứng lâm sàng