nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật multiplex ligation dependent probe amplifitication để chẩn đoán đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 của gen smn1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Dương Thị Huệ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7, EXON CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI HÓA CƠ TỦY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Dương Thị Huệ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7, EXON CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI HÓA CƠ TỦY Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ BĂNG SƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sĩ Sinh học với đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến đoạn exon 7, exon gen SMN1 gây bệnh thoái hóa tủy” công trình nghiên cứu cá nhân Kết trình bày luận văn trung thực chưa tác giả công bố công trình Các trích dẫn bảng biểu, kết nghiên cứu tác giả khác; tài liệu tham khảo luận văn có nguồn gốc rõ ràng theo quy định TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng năm 2013 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Dương Thị Huệ LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Băng Sương người tận tình giúp đỡ hướng dẫn trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể Quý thầy cô Khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh dạy giúp đỡ động viên việc thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô Khoa Sinh, Bộ môn Y sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tận tình việc nghiên cứu luận văn Xin chân thành gửi lời cảm ơn tới bạn Phạm Quốc An, bạn Nguyễn Huỳnh Minh Quân toàn thể cán công tác phòng thí nghiệm môn Y sinh học phân tử, Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bệnh Viện Nhi đồng I, Bệnh viện Nhi đồng II tạo điều kiện cho tiến hành thu thập mẫu nghiên cứu luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn bè lớp SHTN Khóa 22 động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu luận văn Qua xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới Bố Mẹ anh chị động viên hỗ trợ suốt trình học tập nghiên cứu luận văn TP Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng năm 2013 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Dương Thị Huệ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair CK Creatine kinase DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DQ Dosage quotients EDTA Ethilendiaminetetraacetic acid FISH Fluorescent insitu hybridization kb Kilobase kDa Kilodalton MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information Nu Nucleotide OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SMA Spinal Muscular Atrophy SMN Survival Motor Neuron snRNP Small nuclear ribonucleoproteins TBE Tris Borate EDTA Buffer UV Ultra violet (tia tử ngoại) μl Microliter MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu .8 Đối tượng nghiên cứu .8 Nội dung nghiên cứu .9 Phạm vi nghiên cứu Đóng góp luận văn Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn .9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Đặc điểm bệnh thoái hóa tủy 11 1.1.1 Đặc điểm lâm sàng tiêu chuẩn cận lâm sàng 11 1.1.2 Di truyền bệnh SMA 12 1.1.3 Bệnh học phân tử 14 1.1.4 Chữa trị bệnh SMA 22 1.2 Các phương pháp xác định đột biến gen smn1 .23 1.2.1 Phương pháp Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification 23 1.2.2 Phương pháp PCR - Restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP) 26 1.2.3 Phương pháp lai huỳnh quang chỗ (Fluorescent insitu hybridization -FISH) 27 1.2.4 Real - time PCR 28 1.2.5 Giải trình tự gen máy tự động 29 1.3 Lược sử nghiên cứu đề tài 29 1.3.1 Lược sử nghiên cứu giới 29 1.3.2 Lược sử nghiên cứu Việt Nam 30 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 32 2.2.1 Quá trình nghiên cứu sử dụng trang thiết bị, dụng cụ sau 32 2.2.2 Hóa chất 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Xây dựng quy trình nghiên cứu 34 2.3.2 Quy trình lấy mẫu 35 2.3.3.Tách chiết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi dịch ối 35 2.3.4 Đo nồng độ độ tinh DNA 36 2.3.5 Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến đoạn exon 7, exon gen SMN1 bệnh nhân SMA 37 2.3.6 Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định người lành mang gen bệnh bố mẹ bệnh nhân 42 2.3.7 Sử dụng kĩ thuật MLPA để xác định đột biến đoạn exon 7, exon gen SMN1 mẫu dịch ối 42 2.3.8 Những lưu ý thực phản ứng MLPA 42 2.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 43 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 Kết hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại đoạn dò đặc hiệu kit SALSA MLPA P021-A2 Beckman Coulter Genomelab GeXP 44 3.2 Kết đặc điểm tuổi giới tính bệnh nhân 46 3.3 Kết xác định đột biến đoạn gen SMN1 bệnh nhân 47 3.3.1 Kết bệnh nhân bị đột biến đoạn đồng hợp tử exon 48 3.3.2 Kết bệnh nhân bị đột biến đoạn dị hợp tử exon 49 3.3.3 Kết bệnh nhân không bị đột biến đoạn exon 50 3.3.4 Kết dạng đột biến bệnh nhân 51 3.3.5 Sự phân bố đột biến đoạn gen SMN1 53 3.4 Kết xác định kiểu gen dị hợp tử bố mẹ bệnh nhân 55 3.4.1 Kết điện di mao quản xác định kiểu gen dị hợp tử bố mẹ bệnh nhân SMA55 3.4.2 Kết cặp bố mẹ có kiểu gen dị hợp tử 57 3.5 Kết chẩn đoán trước sinh 60 3.5.1 Kết phân tích thai nhi gia đình bệnh nhân SMA57 60 3.5.2 Kết phân tích thai nhi gia đình bệnh nhân SMA11 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 73 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Thoái hóa tủy (Spinal Muscular Atrophy - SMA) bệnh di truyền gen lặn nằm nhiễm sắc thể thường, bệnh mô tả nhà thần kinh học Guido Wernig (người Australia) vào năm 1891 [10] Đây bệnh thần kinh di truyền thường gặp Tần suất mắc bệnh 1/10.000 - 1/25.000 tần suất người bình thường mang gen bệnh 1/50 [40] Người ta phát gen liên quan đến bệnh, gen gồm hai có trình tự tương đối giống nhau: gen SMN (Suvival motor neuron: gồm SMN1 SMN2); Neuroral apoptosis inhibitory protein gene (NAIP ΨNAIP); Basal transcription factor subunit p44 (p44t p44c); H4F5c H4F5t [34] Nguyên nhân gây bệnh SMA đột biến gen SMN (survival motor neuron).Gen SMN nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số (5q13), gồm hai SMN1 SMN2, hai gen có trình tự gần giống nhau, khác nucleotide Gen SMN1 nằm vùng telomer, gen SMN2 nằm vùng centromer nhiễm sắc thể Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biểu chủ yếu tế bào thần kinh vận động tủy sống (spinal motor neuron) Cả hai gen SMN1 SMN2 tổng hợp protein tương ứng, nhiên khác vài nucleotide nên SMN1 tổng hợp protein có chức năng, protein gen SMN2 tổng hợp có chức hạn chế Do đó, gen SMN1 bị đột biến dẫn đến không tổng hợp protein thực chức gây bệnh SMA Các tác giả khẳng định đột biến gene SMN1 nguyên nhân gây nên bệnh SMA Các kết nghiên cứu cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa tủy bị hai gen SMN1 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp mang kiểu gen SMN1 dị hợp tử, bệnh nhân có allele SMN1 bị đột biến gen SMN1 allele mang gen SMN1 bị đột biến điểm, không tổng hợp protein SMN1 có chức [4] Nghiên cứu Ogino S cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa tủy bị đột biến hai exon gen SMN1 Sự exon chứng minh đột biến đoạn gen chứa exon exon gen SMN1 đột biến chuyển thành exon gen SMN2 Các bệnh nhân bị đột biến hai exon (SMN1) đa số kèm theo đột biến exon gen SMN1, nhiên có trường hợp mang exon [40] Ngày với phát triển kĩ thuật di truyền có nhiều phương pháp áp dụng để xác định dạng đột biến gen SMN1 như: Phương pháp PCR - Restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP), phương pháp Real- time PCR, phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH), Hiện Việt Nam, số tác giả sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để chẩn đoán bệnh thoái hóa tủy, nhiên phương pháp phát bệnh nhân bị đột biến đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát kiểu gen dị hợp tử, bỏ sót tổn thương Trong năm gần đây, Multiplex Ligation dependent Probe Amplification (MLPA) phương pháp ưu tiên chọn lựa chẩn đoán đột biến đoạn ngắn, lặp đoạn phát kiểu gen dị hợp tử với độ xác cao cho kết nhanh chóng So với phương pháp khác, MLPA có ưu điểm bật giúp phát dạng đột biến gen SMN kể đột biến nhỏ không xác định phương pháp FISH số lượng gen, không cần tiến hành xử lí enzyme cắt giới hạn sau khuếch đại góp phần tiết kiệm thời gian, kinh phí, công sức Bên cạnh xác định đoạn đồng hợp tử gen SMN1 kỹ thuật MLPA giúp phát thể mang kiểu gen dị hợp tử thông qua xác định số lượng gen SMN, giúp phát người lành mang gen bệnh [28], [36] Bên cạnh đó, kĩ thuật MLPA giúp khảo sát gen khác liên quan đến bệnh SMA NAIP ΨNAIP,… Mức độ nguy hiểm bệnh SMA xếp thứ hai bệnh lí thần kinh - di truyền sau bênh loạn dưỡng Duchenne chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, cuối bệnh nhân tử vong Trẻ em mắc bệnh SMA gánh nặng cho gia đình, xã hội thân bệnh nhân Do nhà khoa học chọn lựa phương pháp sàng lọc trước sinh với mục đích hạn chế sinh em bé mắc bệnh thoái hóa tủy Cũng bệnh di truyền khác, bệnh thoái hóa tủy, người mắc bệnh 100% nhận gen bệnh từ bố mẹ mà thân người tự đột biến trình hình thành giao tử [42] Do chẩn đoán xác vị trí đột biến người cần phải xác định kiểu gen bố mẹ bệnh nhân Nếu bố mẹ người mang gen bệnh (kiểu gen dị hợp tử) đến lần mang thai sau bắt buộc phải tiến hành chọc ối chẩn đoán xem thai nhi có bị đột biến không để tư vấn di truyền có hướng xử lý kịp thời Xuất phát từ thực tiễn đó, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến đoạn exon 7, exon gen SMN1 gây bệnh thoái hóa tủy” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỉ lệ đột biến đoạn exon exon gen SMN1 bệnh nhân thoái hóa tủy - Xác định tỉ lệ người lành mang gen bố mẹ bệnh nhân - Phân tích kiểu gen thai nhi tư vấn di truyền cho cặp vợ chồng có kiểu gen dị hợp tử mang thai Đối tượng nghiên cứu - Nhóm chứng: Gồm 30 người bình thường, không mắc bệnh SMA có 15 nam 15 nữ Được dùng để hiệu chỉnh tín hiệu khuếch đại đoạn dò làm mẫu đối chứng tiến hành phản ứng MLPA với mẫu bệnh nhân - Nhóm nghiên cứu: (1) Gồm 50 bệnh nhân: Các bệnh nhân chọn từ kết chẩn đoán dựa triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng điển sau: + Giảm vận động xu hương gốc chi (khả ngồi, khả đứng, khả đi, khả bú, ảnh hưởng tới hô hấp: Tiếng khóc bé, thở nông) + Giảm trương lực + Mất giảm phản xạ gân xương + Teo gốc chi + Phát triển tinh thần bình thường + Không có rối loạn cảm giác + Biểu co cứng cục bộ: Lưỡi rung, rung tay + Biến chứng xương khớp: Cong vẹo cột sống, biến dạng lồng ngực, cứng khớp + Biến chứng xương khớp: Cong vẹo cột sống, biến dạng lồng ngực, cứng khớp (2) Xác định kiểu gen dị hợp tử bố mẹ bệnh nhân: 07 cặp vợ chồng bố mẹ bệnh nhân xác định có đột biến đoạn exon 7, gen SMN1 phân tích gen để phát kiểu gen dị hợp tử Điều kiện chọn lựa: Bố mẹ bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu (3) Chẩn đoán trước sinh: 02 thai phụ mẹ bệnh nhân SMA mang 02 thai nhi thực chẩn đoán trước sinh Điều kiện chọn lựa: Gia đình bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu 53 Tomaszewicz K., Kang P., Wu B.L.(2005), “Detection of homozygous and heterozygous SMN deletions of spinal muscular atrophy in a single assay with multiplex ligation-dependent probe amplification”, Beijing Da Xue Xue Bao; 18;37(1), pp 55-57 54 TranV.K., TakeshimaY., HaradaY., NishioH., NguyenD.N.T., NguyenH.T., Bui T.P.andMatsuo M (2002), "Molecular Genetic Analyses of Five Vietnamese Patients with Spinal Muscular Atrophy",Kobe J Med Sci.; Vol 48, No 6, pp 177182 55 Tran V.K., Sasongko T.H., Dang D.H., Nguyen T.H.,Vu C.D., Lee M.J., Gunadi, Takeshima Y., Matsuo M., and Nishio H (2008), “SMN2 and NAIPgene dosages in Vietnamese patients with spinal muscular atrophy”, Pediatrics International, 50, pp 346-351 56 Van der Steege G., Grootscholten P., Van der Vlies P., Draaijers T.G., Osinga J., Cobben J.M., Scheffer H., Buys C.H.C.M., (1995), "PCR based DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy" Lancet 345, pp.985-986 57 Van der Steege G., Grootscholten P.M., Cobben M., Zappata S., Scheffer H., den Dunneu J.T., van Ommen GJB., Brahe C., and Buys CHCM (1996), “Apparent gene conversion involving the SMN gene in the region of the spinal muscular atrophy locus onchromosome 5”, Am J Hum Genet58, pp 834-838 58 Wang C.C., Jong Y.J., Chang J.G., Chen Y.L and Wu S.M (2010), "Universal Fluorescent multiplex PCR and capillary electrophoresis for evaluation of gene conversion between SMN1 and SMN2 in spinal muscular atrophy", Anal Bioanal Chem, 397, pp 2375-2383 59 Yoon S., Lee C.H., and Lee K.A (2010), “Determination of SMN1 and SMN2 copy numbers in a Korean population using multiplex ligation-dependent probe amplification”, Korean J Lab Med., 30, pp 93-96 60 Zeng J., Ke L.F., Deng X.J., Cai M.Y., Tu X.D., Lan F.H (2001), “Gene deletion patterns in spinal muscular atrophy patients with different clinical phenotypes”, Journal of Biomedical Science.March-April, Volume 8, Issue 2, pp 191-196 71 Tài liệu từ internet 61 http://ditruyen.com/ditruyen-176/benh-thoai-hoa-co-tuy-sma.html 62 http://hawaii.gov/health/family-child-health/genetics/glossary.html 63 QIAquick® Spin Handbook 72 PHỤ LỤC Phụ lục MỘT SỐ MÁY MÓC, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Máy Spin Máy luân nhiệt Máy điện di mao quản Berman Coulter 73 Tủ an toàn sinh học cấp II Esco AC2 Máy li tâm Máy ủ nhiệt Máy vortex 74 Phụ lục MỘT SỐ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH GEN SMN1 CỦA CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ ĐIỆN DI MAO QUẢN MỘT SỐ BỆNH NHÂN SMA45 Bình thường SMA46 Bình thường 75 SMA47 Bình thường SMA24 Dị hợp tử 76 SMA25 Dị hợp tử SMA55 Dị hợp tử 77 SMA01 Đồng hợp tử SMA03 Đồng hợp tử 78 SMA06 Đồng hợp tử SMA11 Đồng hợp tử 79 SMA34 Đồng hợp tử SMA41 Đồng hợp tử KẾT QUẢ ĐIỆN DI MAO QUẢN MỘT SỐ BỐ MẸ BỆNH NHÂN 80 SMA65 Bình thường SMA29 Dị hợp tử 81 SMA36 Dị hợp tử SMA18 Dị hợp tử 82 Phụ lục DANH SÁCH ĐỔI TƯỢNG NGHIÊN CỨU DANH SÁCH BỆNH NHÂN Stt Họ tên Tuổi Giới tính Phan Đăng T 11th Nữ Phạm Nguyễn Sông T 2t Nữ Nguyễn Hữu P 3th Nam Lê Anh T 3th Nữ Nguyễn Minh T 3th Nam Ông Gia T 11th Nam Võ Hoàng Anh Q 10t Nam Ngô Quốc T 4th Nam Nguyễn Ngọc Phương M 1t Nữ 10 Võ Mạnh Quân 2t Nam 11 Trần Quốc M 4t Nữ 12 Võ Kiều Nhi N 4th Nữ 13 Phan Nguyễn Tường V 1t Nữ 14 Nguyễn Quỳnh A 7th Nữ 15 Hoàng Thị N 1t Nữ 16 Nguyễn Thị Ngọc H 5th Nữ 17 Bùi Thảo L 2t Nữ 18 Lê Thị Như H 9th Nữ 19 Lê Minh Tuấn K 1t Nữ 20 Nguyễn Thu H 6th Nữ 21 Tăng Hải T 4th Nam 22 Y Ly A 6th Nữ 23 Trần Văn Huy K 3t Nam 24 Nguyễn Khải Đ 7th Nam Stt 25 Họ tên Hoàng Anh T Tuổi Giới tính 6th Nam 83 Ghi Ghi 26 Ngô Bích H 3th Nữ 27 Lê Đình Đ 1t Nam 28 Lê Đặng Ngân H 7th Nữ 29 Lê Ng Ngọc Bảo T 10th Nữ 30 Châu Gia H 2th Nữ 31 Trần Tú N 1t Nữ 32 Đố Cao Duy K 1t Nam 33 Phạm Viết Chung T 1t Nam 34 Chu Trần Thái D 1t Nam 35 Phạm Minh T 11th Nam 36 Lê Hữu Hoàng A 10th Nam 37 Mai Tấn P 6t Nam 38 Đinh Hồ Nhật N 1t Nam 39 Phan Minh T 2t Nữ 40 Trương Bá H 1t Nam 41 Quách Hải L 5th Nam 42 Nguyễn Tôn N 4th Nam 43 Nguyễn Thị T 6th Nữ 44 Nguyễn Mạnh Q 2t Nam 45 Lê Thị L 1t Nữ 46 Trần Quốc M 5t Nam 47 Nguyễn Mạnh Q 1t Nam 48 Lê Ánh T 6th Nữ 49 Phùng Tâm K 2t Nam 50 Nguyễn Thị M 7th Nữ DANH SÁCH BỐ MẸ BỆNH NHÂN Stt Họ tên Ngô Văn Q Năm sinh Giới tính 1981 Nam 84 Ghi Võ Ngọc T 1986 Nữ Trần Văn Đ 1982 Nam Trần Thị T 1986 Nữ Hà Huy P 1968 Nam Trần Thị Kim N 1976 Nữ Trần Văn T 1982 Nam Hoàng Thị D 1987 Nữ Bùi Mạnh H 1984 Nam 10 Nguyễn Thị T 1984 Nữ 11 Nguyễn Thị Mỹ H 1977 Nữ 12 Trần Huy T 1976 Nam 13 Đinh Ngọc D 1990 Nam 14 Hồ Thị Tuyết N 1986 Nữ 85 [...]... dung nghiên cứu - Phát hiện đột biến mất đoạn exon 7 và exon 8 của gen SMN1 cho các bệnh nhân thoái hóa cơ tủy - Xác định số lượng bản sao exon 7, exon 8 của gen SMN1 giúp xác định kiểu gen của bố mẹ từ đó đề nghị chẩn đoán trước sinh cho các cặp cha mẹ mang gen - Bước đầu chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền cho một số cặp vợ chồng 5 Phạm vi nghiên cứu - Phát hiện đột biến mất đoạn exon 7, exon 8. .. sao của gen SMN1 còn khoảng 6% bệnh nhân rơi vào trường hợp mang kiểu gen SMN1 dị hợp tử, bệnh nhân có 1 allele SMN1 bị đột biến mất gen SMN1 và 1 allele mang gen SMN1 bị đột biến điểm, không tổng hợp được protein SMN1 có chức năng [4] Nghiên cứu của Ogino S cho thấy 94% bệnh nhân thoái hóa cơ tủy bị đột biến mất cả hai exon 7 của gen SMN1 Sự mất exon 7 được chứng minh là do đột biến mất đoạn gen chứa... học như sau: 9 - Ứng dụng kĩ thuật MLPA trong chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy giúp giảm tỉ lệ mắc bệnh thoái hóa cơ tủy cũng như hạn chế được sự lan truyền gen SMN1 bị đột biến trong cộng đồng Việt Nam - Xác định tỉ lệ các kiểu gen SMN1 ở các bệnh nhân thoái hóa cơ tủy Việt Nam * Ý nghĩa thực tiễn - Chẩn đoán các đột biến gen SMN1 của một số bệnh nhân thoái hóa cơ tủy - Chẩn đoán trước sinh cho một số... minh là do đột biến mất đoạn gen chứa exon 7 hoặc do exon 7 của gen SMN1 đột biến chuyển thành exon 7 của gen SMN2 [41] Các bệnh nhân bị đột biến mất hai exon 7 (SMN1) đa số kèm theo đột biến mất exon 8 của gen SMN1, tuy nhiên có trường hợp vẫn mang ít nhất một bản sao của exon 8 [41] 1.1.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen SMN1 Gen SMN1 nằm ở vùng telomer, gen SMN2 nằm ở vùng centromer trên nhiễm... nhau của hai gen SMN1 và SMN2 tương ứng là G và A Với exon 8 của gen SMN1 xuất hiện đỉnh 294nt và gen SMN2 với đỉnh 300nt trong điện di mao quản 24 B Hình 1.9 Kết quả điện di mao quản phát hiện đột biến mất đoạn exon 7 và 8 của gen SMN1 A Người bình thường (màu đỏ): Xuất hiện hai đỉnh của exon 7 và 8 Bệnh nhân (màu xanh): Không xuất hiện đỉnh exon 7 và 8 B Người bị mất đoạn dị hợp tử exon 7, 8 của SMN1: ... mẫu đối chứng Đối với trường hợp mất đoạn dị hợp tử chúng ta thấy đỉnh của exon 7 của gen SMN1 chỉ bằng ½ so với mẫu đối chứng Hai đoạn dò được sử dụng là 1260-L0966 (để khảo sát exon 7 của gen SMN1, kích thước 270nt) và 1260-L0967 (để khảo sát exon 7 của gen SMN2, kích thước 276nt) (theo protocol MRC-Holland) Đối với việc xác định đột biến mất đoạn exon 8 sử dụng hai đoạn dò 181 2-L1373 & 181 2-L1372... cắt exon 8 của gen SMN2 và 1 vạch cao là sản phẩm không bị phân cắt exon 8 của gen SMN1; khi bệnh nhi có đột biến mất đoạn exon 8 của gen SMN1, trên hình ảnh điện di chỉ xuất hiện 2 vạch thấp 120bp và 70bp (sản phẩm phân cắt exon 8 gen SMN2) [56] Hình 1.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng DraI (exon 7) và DdeI (exon 8) của bệnh nhân SMA (Nguồn: [2]) Tuy nhiên phương pháp này chỉ phát hiện được mất đoạn. .. đột biến xảy ra có thể ở trạng thái dị hợp tử hoặc đồng hợp tử.Song chỉ dạng đồng hợp tử (đột biến xuất hiện ở cả trên 2 allele) mới biểu hiện ra kiểu hình Hình 1.6 Sơ đồ minh họa các loại đột biến gen SMN1 a Đột biến mất đoạn (một phần gen hoặc toàn bộ gen) ; b Đột biến chuyển đổi gen (từ SMN1 sang SMN2); c Các điểm đột biến ã xác định (Nguồn: [ 48] ) * Đột biến mất đoạn gen (deletion) Đoạn exon 7 bị mất. .. cột sống, biến dạng lồng ngực, cứng khớp (2) Xác định kiểu gen dị hợp tử của bố mẹ bệnh nhân: 7 cặp vợ chồng là bố mẹ của các bệnh nhân (đã được xác định có đột biến mất đoạn đồng hợp tử exon 7, 8 của gen SMN1) sẽ được phân tích gen để phát hiện người lành mang gen Điều kiện chọn lựa: Bố mẹ của bệnh nhân đồng ý tham gia vào nghiên cứu (3) Chẩn đoán trước sinh: 02 thai phụ là người lành mang gen đang... mắc bệnh mới đi khám và phân tích gen Do vậy chúng ta cần chẩn đoán đột biến gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy ở người con, sau khi xác định được kiểu gen và vị trí đột biến ở người con sẽ phân tích kiểu gen của bố mẹ xem có mang gen bệnh hay không Nếu có thì bắt buộc phải chẩn đoán trước sinh cho thai kỳ tiếp theo Đề tài này thực hiện với mục đích trên nên có ý nghĩa khoa học như sau: 9 - Ứng dụng kĩ ... MINH Dương Thị Huệ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KĨ THUẬT MULTIPLEX LIGATION - DEPENDENT PROBE AMPLIFITICATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN EXON 7, EXON CỦA GEN SMN1 GÂY BỆNH THOÁI HÓA CƠ TỦY Chuyên ngành:... Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến đoạn exon 7, exon gen SMN1 gây bệnh thoái hóa tủy Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỉ lệ đột. .. với đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification để chẩn đoán đột biến đoạn exon 7, exon gen SMN1 gây bệnh thoái hóa tủy công trình nghiên cứu cá nhân