L ỜI CẢM ƠN
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
1.2.1. Phương pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Multiplex Ligation - dependent Probe Amplification (MLPA) còn gọi là kĩ thuật
khuếch đại đa đoạn dò, được mô tả lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Schouten J.P. và cs, đây
là phiên bản mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ
bằng 1 cặp mồi. Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai với phân tử
DNA đích đặc hiệu. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligoncleotide có kích thước khác nhau (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào các exon của phân tử DNA đích, sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang. Đoạn đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch đại sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao quản. Nếu exon bị đột biến mất đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe đó sẽ không được khuếch đại, do đó khi điện di mao quản sẽ không thấy hình ảnh exon bị đột biến mất đoạn. Nếu gen có đột biến lặp đoạn, kết quả trên hình ảnh điện di mao quản cho thấy đỉnh tín hiệu của probe tương ứng với exon bị đột biến sẽ tăng cao khác biệt so với bình thường [40].
Đến nay có hơn một triệu phản ứng MLPA được thực hiện mỗi năm trên khắp thế giới và được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người, di truyền tế bào và
nghiên cứu ung thư, cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh chóng và chính
24
Ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy cao, chính xác với thời gian thực hiện
khoảng 2 ngày, cần lượng mẫu nhỏ, thao tác đơn giản và có thể thực hiện cùng lúc số lượng
mẫu lớn.
* Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh SMA
Thường được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen SMN1 và phát hiện người lành mang gen bệnh.
Trong chẩn đoán bệnh SMA việc xác định số lượng bản sao của gen SMN1 và SMN2
dựa vào các đoạn dò có vị trí nối tại nucleotide khác nhau giữa hai gen này ở vị trí exon 7.
Ở gen SMN1 vị trí nối của đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược là nucleotide C, do đó nếu xảy ra đột biến mất đoạn exon 7, exon 8 hoặc chuyển C thành T thì sẽ không xảy ra hiện tượng lai đặc hiệu với exon 7 của DNA đích và đoạn dò exon 7 sẽ không được khuếch đại. Chính vì
vậy ở bệnh nhân đột biến mất exon 7 thể đồng hợp tử, kết quả điện di mao quản sẽ không
nhìn thấy hình ảnh của exon 7 trên gen SMN1, mà chỉ thấy đỉnh exon 7 của gen SMN2.
Trong trường hợp có mặt cả hai exon 7 của gen SMN1 và gen SMN2 thì thông qua điện di
mao quản sẽ xuất hiện đỉnh 270nt tương ứng với exon 7 của gen SMN1 và đỉnh 276nt ứng
với exon 7 của gen SMN2, chiều cao các đỉnh này xấp xỉ với chiều cao đỉnh tương ứng ở
mẫu đối chứng. Đối với trường hợp mất đoạn dị hợp tử chúng ta thấy đỉnh của exon 7 của
gen SMN1 chỉ bằng ½ so với mẫu đối chứng. Hai đoạn dò được sử dụng là 1260-L0966 (để
khảo sát exon 7 của gen SMN1, kích thước 270nt) và 1260-L0967 (để khảo sát exon 7 của
gen SMN2, kích thước 276nt) (theo protocol MRC-Holland).
Đối với việc xác định đột biến mất đoạn exon 8 sử dụng hai đoạn dò 1812-L1373 &
1812-L1372 (294nt và 300nt) (theo protocol MRC- Holland) dựa trên nucleotide khác nhau
của hai gen SMN1 và SMN2 tương ứng là G và A. Với exon 8 của gen SMN1 xuất hiện
25
B
Hình 1.9. Kết quả điện di mao quản phát hiện đột biến mất đoạn exon 7 và 8 của gen SMN1
A. Người bình thường (màu đỏ): Xuất hiện hai đỉnh của exon 7 và 8 Bệnh nhân (màu xanh): Không xuất hiện đỉnh exon 7 và 8.
B. Người bị mất đoạn dị hợp tử exon 7, 8 của SMN1: Xuất hiện đỉnh chỉ bằng ½ so với mẫu đối chứng
(Nguồn: Theo protocol MRC-Holland)
Đoạn dò exon 8 cũng có thể được sử dụng để xác định số lượng bản sao của gen SMN1 và SMN2, tuy nhiên trong trường hợp kết quả không trùng khớp với đoạn dò exon 7
thì chỉ nên sử dụng kết quả của đoạn exon 7. Nguyên nhân là do trong một số trường hợp có
đột biến chuyển đổi gen SMN1 thành SMN2: C chuyển thành T ở vị trí exon 7 trong khi đó ở vị trí exon 8 vẫn giữ nguyên.
26