Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn nái mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản(PRRS), ứng dụng kĩ thuật RT PCR để chuẩn đoán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS), ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT – PCR ðỂ CHẨN ðOÁN CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LAN HÀ NI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS), ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT – PCR ðỂ CHẨN ðOÁN CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LAN HÀ NỘI - 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan công trình nghiên cứu này là của riêng cá nhân tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Hà Nội, tháng 9 năm 2013 Tác giả luận văn Lê Thị Toan Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện ñề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập thể, cá nhân, bạn bè ñồng nghiệp trong và ngoài trường. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến cô giáo PGS. TS. Nguyễn Thị Lan, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Các thầy cô giáo khoa thú y ñặc biệt các thầy cô Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, ñã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng cao chất lượng luận văn. - Các cán bộ phòng thí nghiệm Trọng ñiểm công nghệ sinh học Thú y khoa Thú y , Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý Thú y. - Lãnh ñạo và cán bộ Huyện uỷ Phúc Thọ nơi tôi công tác ñã tạo ñiều kiện ñể tôi yên tâm học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñến những người thân, gia ñình ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 9 năm 2013 Tác giả luận văn Lê Thị Toan Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii PHẦN I MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích ñề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới và Việt Nam 3 2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới 3 2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam 5 2.2 Virus PRRS 6 2.2.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS 6 2.2.2 Phân loại virus PRRS 8 2.2.3 Sức ñề kháng của virus PRRS 9 2.3 Dịch tễ học của bệnh 9 2.3.1 ðộng vật cảm nhiễm 9 2.3.2 Phương thức truyền lây 9 2.3.3 Cơ chế sinh bệnh 10 2.4 Triệu chứng của lợn mắc PRRS 13 2.4.1 Lợn nái 13 2.4.2 Lợn ñực giống 13 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 2.4.3 Lợn con theo mẹ 14 2.4.4 Lợn con cai sữa và lợn choai 14 2.5 Bệnh tích của lợn mắc PRRS 14 2.5.1 Lợn nái mang thai 14 2.5.2 Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo 14 2.5.3 Lợn con theo mẹ 15 2.6 Các phương pháp chẩn ñoán PRRS 15 2.6.1 Chẩn ñoán lâm sàng 15 2.6.2 Chẩn ñoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh 15 2.6.3 Chẩn ñoán bằng phương pháp huyết thanh học 15 2.6.4 Kỹ thuật RT- PCR 16 PHẦN III ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 ðối tượng, phạm vi ñịa ñiểm nghiên cứu 18 3.2 Nội dung nghiên cứu 18 3.3 Nguyên liệu 18 3.3.1 Mẫu bệnh phẩm 18 3.3.2 Hoá chất 19 3.3.3 Dụng cụ 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 19 3.4.2 Phương pháp mổ khám 19 3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể 20 3.4.4 Phương pháp RT - PCR 22 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Khái quát về ñiều kiện tự nhiên kinh tế xã hội của huyện Phúc Thọ 26 4.2 Tình hình chăn nuôi lợn tại huyện Phúc Thọ 26 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 4.3 Tình hình dịch bệnh và sử dụng vacxin trên ñàn lợn tại huyện Phúc Thọ 28 4.4 Tình hình dịch bệnh PRRS trên ñàn lợn nuôi tại huyện Phúc Thọ 29 4.4.1 Nguyên nhân dịch bệnh xẩy ra 29 4.4.2 Tổng hợp diễn biến của dịch bệnh PRRS của ñàn lợn 30 4.5 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nghi mắc PRRS 31 4.6 Biến ñổi bệnh lý của lợn nghi mắc PRRS 35 4.6.1 Bệnh tích ñại thể của lợn nghi mắc PRRS 35 4.6.2 Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn mắc PRRS 39 4.7 Kết quả phản ứng RT – PCR 45 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 48 5.1. Kết luận 48 5.2 ðề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 4.1 Tình hình ñàn lợn tính ñến cuối tháng 4/2012 tại huyện Phúc Thọ (Trước khi xảy ra hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản) 27 Bảng 4.2 Kết quả tiêm phòng cho ñàn lợn nuôi tại huyện Phúc Thọ năm 2012 (Trước khi xẩy ra dịch rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn tháng 5/2012) 28 Bảng 4.3 Tổng hợp dịch PRRS trên ñàn lợn nuôi tại huyện Phúc Thọ năm 2012 31 Bảng 4.4 Kết quả thu thập mẫu tại huyện Phúc Thọ 31 Bảng 4.5 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nái nghi mắc PRRS 32 Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích ñại thể ở lợn nghi mắc PRRS 35 Bảng 4.7 Bệnh tích vi thể chủ yếu ở phổi, hạch phổi của lợn nghi mắc PRRS 41 Bảng 4.8 Bệnh tích vi thể ở gan, lách, thận của lợn nghi mắc PRRS 42 Bảng 4.9 Bệnh tích vi thể ở ruột, hạch ruột, tử cung của lợn nghi mắc PRRS 43 Bảng 4.10 Kết quả chẩn ñoán virus PRRS bằng kỹ thuật RT – PCR 45 Bảng 4.11 Kết quả chẩn ñoán virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR so sánh với phương pháp IHC………………………………………….47 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bản ñồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 4 Hình 2.2. Hình thái Virus PRRS 7 Hình 2.3. Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS 7 Hình 2.4. ðại thực bào bình thường 13 Hình 2.5. ðại thực bào bệnh lý 13 Hình 2.6. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 17 Hình 4.1. Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng 34 Hình 4.2. Một số hình ảnh bệnh tích ñại thể 38 Hình 4.3. Một số hình ảnh bệnh tích vi thể của lợn mắc PRRS 44 Hình 4.4. Kết quả phản ứng RT – PCR 46 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum IPMA Immuno - Peroxidase Monolayer Assay OIE Office Internationable des Epizooties (Tổ chức bảo vệ sức khỏe ñộng vật thế giới) PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Repiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Repiratory Syndrome Virus RNA Ribonucleic Acid RT - PCR Reverse Transcriptase - Polymerace Chain Reaction VNT Virus Neutralization Test: phản ứng trung hòa virus [...]... n ñ tài “ Nghiên c u m t s ñ c ñi m b nh lý c a l n nái m c h i ch ng r i lo n hô h p và sinh s n (PRRS), ng d ng k thu t RT – PCR ñ ch n ñoán” 1.2 M c ñích ñ tài - Xác ñ nh các tri u ch ng lâm sàng ch y u c a l n nái m c PRRS - Xác ñ nh m t s bi n ñ i b nh lý ñ i th , vi th ch y u c a l n nái m c PRRS - Xác ñ nh chính xác s có m t c a virus PRRS các l n nái m c b nh 1.3 Ý nghĩa khoa h c và th c ti... hay do tiêm phòng vacxin (Anette, 1997) 2.6.4 K thu t RT- PCR Dùng ph n ng RT- PCR phân tích m u máu (ñư c l y trong giai ño n ñ u c a pha c p tính) ñ xác ñ nh s có m t c a virus, ñây là ph n ng tương ñ i nh y và chính xác K thu t RT – PCR hay còn là ph n ng PCR ngư c là m t ph n ng nhân m t ño n gi i h n c a khuôn RNA, theo nguyên lý c a ph n ng PCR bao g m hai giai ño n: Giai ño n th nh t là chuy... ñi m nghiên c u - ð i tư ng nghiên c u: Nghiên c u ñư c ti n hành v i ñ i tư ng là l n nái nghi m c PRRS huy n Phúc Th , thành ph Hà N i bao g m: + L n nái mang thai + L n nái nuôi con - ð a ñi m th c hi n ñ tài: ð tài ñư c th c hi n t i phòng thí nghi m tr ng ñi m công ngh sinh h c khoa Thú y, phòng thí nghi m b môn b nh lý khoa Thú y trư ng ð i h c nông nghi p Hà N i 3.2 N i dung nghiên c u - Nghiên. .. Nghiên c u tri u ch ng lâm sàng ch y u c a l n nái m c PRRS - Nghiên c u bi n ñ i b nh lý ñ i th ch y u c a m t s cơ quan c a l n nái m c PRRS - Nghiên c u b nh tích vi th ch y u c a m t s cơ quan c a l n nái m c PRRS - ng d ng phương pháp RT – PCR ñ ch n ñoán chính xác l n nái m c PRRS 3.3 Nguyên li u 3.3.1 M u b nh ph m M u b nh ph m ñư c s d ng trong nghiên c u là: Ph i, h ch ph i, tim, gan, lá lách,... dye vào 8 µl s n ph m RT- PCR - Chu n b b ñi n di: Chuy n th ch ñã ñông vào b ñi n di, thêm TBE 1X ñ n ng p th ch Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 24 - Nh marker và s n ph m PCR ñã tr n v i loading dye vào các gi ng v i th tích 6µl maker 100bp và 10µl s n ph m PCR m i gi ng - ði n di hi u ñi n th 100V trong 30 phút - Quan sát k t qu ñi n di s n ph m PCR. .. u ng, không khí, côn trùng, v t li u nhi m khu n, kí ch không ph i là l n Pháp 56% ñàn m c b nh do ti p xúc v i l n b nh, 20% do tinh d ch, 21% do v t d ng và 3% t nh ng ngu n chưa xác ñ nh ñư c các cơ s có lưu hành b nh, môi trư ng b ô nhi m, b nh lây lan quanh năm nhưng t p trung vào th i kỳ có nhi u l n nái ph i gi ng và b nh phát sinh thành d ch, v i t l cao, l n nái có h i ch ng r i lo n sinh s... Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida và Actinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus gi d i (Aujeszky), Porcine cytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus Các nhà nghiên c u ñã phân l p virus t ph i, gan, lách và huy t thanh ho c d ch cơ th l n con sinh ra c s ng và ch t nhưng không phân l p ñư c t thai ch t khô, h cũng phát hi n kháng th ch ng virus PRRS... vón không tiêu Th tr ng g y y u, l n nhanh chóng rơi vào tình tr ng t t ñư ng huy t do không bú ñư c, m t có d màu nâu, sưng mí m t và các màng quanh m t, tiêu ch y, chân choãi ra run r y, l n con r t d m c các b nh k phát và t l t vong cao 2.6 Các phương pháp ch n ñoán PRRS 2.6.1 Ch n ñoán lâm sàng D a vào tri u ch ng lâm sàng theo Anette (1997): Viêm ph i l n con và l n v béo, tri u ch ng ñư ng sinh. .. y hơn và ñư c kí hi u là ORF 2, 3 và 4 2.2.2 Phân lo i virus PRRS V tính ña d ng di truy n, virus PRRS có hai ch ng chính: ch ng virus có ngu n g c Châu Âu (virus Lelystad – LV) và ch ng virus có ngu n g c B c M (VR- 2332) Ngoài s khác bi t gi a các l n phân l p ngư i ta ñã ch ng minh ñư c có s bi n d di truy n m nh trong c hai typ phân l p Theo Murtaugh và cs (1995), Nelsen và cs (1999), Meng và cs... sàng , bi n ñ i b nh lý ñ i th , vi th , ch n ñoán chính xác s có m t c a virus PRRS l n ñ c bi t là l n nái có m t ý nghĩa r t quan tr ng trong vi c h n ch và ti n t i thanh toán h t b nh PRRS Có r t nhi u phương pháp ch n ñoán PRRS ñã ñư c các nhà khoa h c tìm ra: Phương pháp ELISA, RT – PCR, ph n ng kháng th huỳnh quang gián ti p – IFA, Phương pháp ch n ñoán b ng ph n ng RT PCR là m t phương pháp . “ Nghiên cứu một số ñặc ñiểm bệnh lý của lợn nái mắc hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS), ứng dụng kỹ thuật RT – PCR ñể chẩn ñoán”. 1.2 Mục ñích ñề tài - Xác ñịnh các triệu chứng. DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS), ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT. DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN NÁI MẮC HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS), ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT