Dùng phản ứng RT- PCR phân tắch mẫu máu (ựược lấy trong giai ựoạn ựầu của pha cấp tắnh) ựể xác ựịnh sự có mặt của virus, ựây là phản ứng tương ựối nhạy và chắnh xác.
Kỹ thuật RT Ờ PCR hay còn là phản ứng PCR ngược là một phản ứng nhân một ựoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR bao gồm hai giai ựoạn: Giai ựoạn thứ nhất là chuyển ựổi một sợi RNA là khuôn thành cDNA, sau ựó qua giai ựoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn ựể tiếp tục thực hiện phản ứng PCR.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 17
Hình 2.6. Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR
RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ựó có Adenine, Guanine, Cytsein, Uracil. Chuỗi nucleotit này phải ựược chuyển ựổi thành DNA hai sợi mà thành phần Uracil ựược thay thế bằng Thyamine. Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ ựến vai trò của enzyme phiên mã ngược. Do vậy giai ựoạn này ựược gọi là giai ựoạn chuyển ngược. Khi ựã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một ựoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai ựoạn nói trên ựược gọi là phản RT ỜPCR hay phản ứng PCR ngược. Thay ựổi nhiệt ựộ ựể phù hợp cho mỗi chu kỳ (Lê Thanh Hoà, 2006).
Có thể phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch amidan,Ầtuy nhiên virus PRRS có ựặc ựiểm khó phân lập và khó quan sát bệnh tắch tế bào.. Virus thắch hợp nhất trên tế bào ựại thực bào ở phổi lợn, tuy nhiên mỗi lần phân lập ựều phải sản xuất lại tế bào, giữa các lô tế bào ựược sản xuất ra có sự biến ựổi khác nhau và ựộ mẫn cảm với virus PRRS cũng khác nhau. Trong phòng thắ nghiệm PRRS thắch ứng trên các loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc-145Ầtrong ựó tế bào thận khỉ châu Phi Marc-145 thường ựược sử dụng nhiều nhất (Anette, 1997).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 18
PHẦN III
đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 đối tượng, phạm vi ựịa ựiểm nghiên cứu - đối tượng nghiên cứu:
Nghiên cứu ựược tiến hành với ựối tượng là lợn nái nghi mắc PRRS ở huyện Phúc Thọ, thành phố Hà Nội bao gồm:
+ Lợn nái mang thai + Lợn nái nuôi con
- địa ựiểm thực hiện ựề tài:
đề tài ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm trọng ựiểm công nghệ sinh học khoa Thú y, phòng thắ nghiệm bộ môn bệnh lý khoa Thú y trường đại học nông nghiệp Hà Nội.
3.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn nái mắc PRRS.
- Nghiên cứu biến ựổi bệnh lý ựại thể chủ yếu của một số cơ quan của lợn nái mắc PRRS.
- Nghiên cứu bệnh tắch vi thể chủ yếu của một số cơ quan của lợn nái mắc PRRS.
- Ứng dụng phương pháp RT Ờ PCR ựể chẩn ựoán chắnh xác lợn nái mắc PRRS.
3.3 Nguyên liệu
3.3.1 Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm ựược sử dụng trong nghiên cứu là: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá lách, thận, tử cungẦ. của các lợn nghi mắc PRRS.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 19
3.3.2 Hoá chất
- Hoá chất sử dụng làm tiêu bản vi thể, trong nuôi cấy tế bào, nhuộm hóa miễn dịch: Formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin, ....
- Hoá chất sử dụng cho phản ứng RT Ờ PCR: Kắt chiết tách ARN (QIAamp), Nuclease free Water, dNTP, enzym, primers, TBE, agarose....
3.3.3 Dụng cụ
- Tủ lạnh, tủ ấm 370C, tủ sấy, buồng cấy vô trùng.
- Máy ựúc tự ựộng, máy cắt Microton, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy ựiện di, máy chụp ảnh gel.
- Các dụng cụ khác gồm: Lam kắnh, kắnh hiển vi, bình nuôi cấy tế bào, ống eppendoft, pipet, găng tayẦ
3.4 Phương pháp nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học.
để xác ựịnh ựược triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện lâm sàng của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theo.
3.4.2 Phương pháp mổ khám
để xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Lợn bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá láchẦ ngâm trong formol 10% làm tiêu bản vi thể.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 20
3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tắch vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin Ờ Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội. Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Cốựịnh bệnh phẩm:
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%. - Vùi bệnh phẩm:
Tiến hành lần lượt các bước sau:
+ Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h. + đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng. Hệ thống máy chuyển ựúc mẫu tự ựộng bao gồm 12 bình.
Bình Hoá chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600C 1:00 2 Cồn 600C 1:00 3 Cồn 700C 1:30 4 Cồn 800C 1:30 5 Cồn 960C 1:30 6 Cồn 1000C 1:30 7 Cồn 1000C 1:30 8 Cồn 1000C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 21
- đúc block
đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin - Cắt dán mảnh và cốựịnh tiêu bản
+ Cắt mảnh: Bằng máy cắt microtom
+ Tãi mảnh: Tãi lát cắt bằng phẳng trên phiến kắnh trong nước ấm 480C. Sau ựó ựể tủ ấm 370C ựến khi bệnh phẩm khô là có thể ựem nhuộm ựược.
- Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I : 6h
Xylen II : 6h Xylen III : 12h
+ Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 lần (mỗi lần 1 phút)
Cồn 950 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 500 : 1 lần
+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân tế bào)
Nhỏ Haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước. Sau ựó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 500 : 1 lần Cồn 700 : 1 lần Cồn 950 : 1 lần Cồn 1000 : 2 lần Rửa tiêu bản
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 22 + Nhuộm Eosin (nhuộm nguyên sinh chất của tế bào)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5 Ờ 10 phút, rửa nước. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản ựi qua xylen. - Gắn Baume canada (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kắnh hiển vi quang học.
3.4.4 Phương pháp RT - PCR
a. Chiết tách ARN
để tiến hành phản ứng RT Ờ PCR cần tách chiết ARN của virus làm khuôn cho quá trình tổng hợp gen. Mẫu bệnh phẩm (2g) ựược nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau ựó ựược ựồng nhất trong dung dịch nghiền mẫu (thể tắch 600 ộl có bổ sung 10% kháng sinh, bảo quản ở - 800C cho ựến khi sử dụng). Mẫu ựã ựồng nhất ựược làm tan băng và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
Quy trình chiết tách RNA theo KIT QIAgen
Chuẩn bị: Pha hồn hợp buffer (AVL + AVE Ờ carier RNA ựể dùng cho kit) (5600 ộl AVL + 56 ộl AVE Ờ carier RNA cho 10 mẫu)
Bước 1: Cho 560 ộl buffer vào ống eppendorff Bước 2: Thêm 140 ộl mẫu
Votex 15 giây Bước 3: Spin down
Bước 4: Ủ nhiệt ựộ phòng 10 phút Bước 5: thêm 560 ộl cồn 96 -1000
Votex 15 giây
Spin down loại bỏ các giọt trên nắp Bước 6: Hút 630 ộl từ ống eppendorff vào cột QIA.
Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 23 Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại
Bước 8: Thêm 500 ộl AW 1
Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 9: Thêm 500 ộl AW2
Ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 10: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ hoàn toàn AW2
Bước 11: đặt cột QIA sang ông eppendorff sạch Thêm 60 ộl AVE
Ủ nhiệt ựộ phòng 1 phút
Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút
Tiếp tục ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút
Thu ựược 60 ml dịch chiết ARN, bảo quản ở nhiệt ựộ -200 C
b. Tiến hành phản ứng RT Ờ PCR
Mẫu ARN sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần ựược trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu RNA 5 Primer Forwad 0.5 Primer Reverse 0.5
RT/Platium Taq Mix 0.5
Nước cất 6
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 24 Trình tự nucleotide của ORF5 primer
Primer Primer sequence PCR product
size (bp) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Forward: ATG TTG GGG AGG TGC TTG ACC ORF5 Reverse: CTA GAG AGC ACC CCA TTG TTC
CGC
700
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp cADN 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 Duỗi mạch 95 15 giây Gắn mồi 50 30 giây 2 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 35 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞ c. điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, ựun sôi trong lò vi sóng, ựể nguội ựến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 ul Syber green, ựổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ựiện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR
- Chuẩn bị bể ựiện di: Chuyển thạch ựã ựông vào bể ựiện di, thêm TBE 1X ựến ngập thạch.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 25 - Nhỏ marker và sản phẩm PCR ựã trộn với loading dye vào các giếng với thể tắch 6ộl maker 100bp và 10ộl sản phẩm PCR mỗi giếng.
- điện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
- Quan sát kết quả ựiện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
d. Phương pháp xử lý số liệu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 26
PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Khái quát về ựiều kiện tự nhiên kinh tế xã hội của huyện Phúc Thọ
Huyện Phúc Thọ nằm ở phắa tây bắc, cách thủ ựô Hà Nội khoảng 30km2, phắa tây giáp với thị xã Sơn Tây, phắa nam giáp với huyện Thạch Thất, phắa ựông giáp với huyện đan Phượng, phắa bắc giáp với tỉnh Vĩnh Phúc.
Tổng diện tắch tự nhiên là 117,7 km2 gồm 22 xã và 1 Thị trấn, chia thành 2 vùng rõ rệt là vùng ựồng và vùng bãi, dân số là 17,6 vạn người, dân số nông thôn là chủ yếu chiếm 96%. Nhân dân sống chủ yếu bằng sản xuất nông nghiệp, chăn nuôi; công nghiệp, tiểu thủ công nghiệp chưa phát triển, tỷ trọng chăn nuôi chiếm 55% trong sản xuất nông nghiệp. Thu nhập bình quân ựầu người ựạt 17,6 triệu ựồng/năm.
4.2 Tình hình chăn nuôi lợn tại huyện Phúc Thọ
Chăn nuôi chiếm tỷ trọng lớn trong sản xuất nông nghiệp, chăn nuôi lợn tại Phúc Thọ chủ yếu là chăn nuôi hộ gia ựình, nguồn thức ăn chắnh cho lợn là thức ăn công nghiệp và thức ăn tận dụng những sản phẩm nông nghiệp. Trong những năm qua tình hình chăn nuôi luôn ổn ựịnh và phát triển ựồng ựều ở tất cả các xã, thị trấn trong huyện. Bảng 4.1 cho thấy tỷ lệ chăn nuôi ựàn lợn nái 16,3%, lợn nuôi thịt và lợn con theo mẹ 83,5 %, lợn ựực giống tỷ lệ 0,2%.
Những số liệu trên cho thấy tình hình chăn nuôi lợn của huyện Phúc Thọ khá phát triển, các hộ chăn nuôi chuyển dịch cơ cấu dần sang chăn nuôi tập trung, xa khu dân cư.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 27
Bảng 4.1 Tình hình ựàn lợn tắnh ựến cuối tháng 4/2012tại huyện Phúc Thọ
(Trước khi xảy ra hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản)
Trong ựó Lợn nái Lợn nuôi thịt và lợn con theo mẹ Lợn ựực giống STT Tên xã Số lợn (con) Số con Tỷ lệ % Số con Tỷ lệ % Số con Tỷ lệ % 1 Sen chiểu 4600 816 17,7 3772 82,0 12 0,3 2 Phương ựộ 950 195 26 755 74 3 Võng xuyên 4207 739 17,5 3448 81,9 20 0,6 4 Cẩm ựình 689 110 15,9 579 84,1 5 Xuân phú 1627 329 20,2 1293 79,5 5 0,3 6 Vân Phúc 1996 625 31,3 1363 68,3 8 0,4 7 Vân nam 1425 299 21,0 1122 78,7 4 0,3 8 Vân hà 750 147 19,6 603 80,4 9 Thanh ựa 1545 264 17 1274 82,5 7 0.5 10 Tam thuấn 1642 209 12,7 1433 87,3 11 Hát môn 1432 262 18,3 1170 81,7 12 Liên hiệp 8111 766 9,4 7345 90,6 13 Hiệp thuận 1664 105 6,4 1559 93,6 14 Tam hiệp 1252 133 10,7 1116 89,1 3 0,2 15 Ngọc tảo 1400 285 20,4 1113 79,5 2 0,1 16 Phụng thượng 2627 528 20,1 2091 79,6 8 0,3 17 Thượng cốc 4021 605 15 3407 84,8 9 0,2 18 Long xuyên 2780 291 10,4 2484 89,4 5 0,2 19 Phúc Hoà 3080 508 16,5 2558 83 14 0,5 20 Thị trấn 1596 198 12,4 1395 87,4 3 0,2 21 Thọ lộc 3578 603 16,9 2960 82,7 15 0,4 22 Trạch mỹ lộc 2042 348 17 1690 82,8 4 0,2 23 Tắch giang 4080 943 23,2 3128 76,6 9 0,2 Tổng 57094 9308 16,3 47658 83,5 128 0,2
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 28
4.3 Tình hình dịch bệnh và sử dụng vacxin trên ựàn lợn tại huyện Phúc Thọ
Trạm Thú y huyện Phúc Thọ là một ựơn vị chỉ ựạo tốt công tác phòng chống dịch trên ựịa bàn huyện, hàng năm công tác tiêm phòng cho ựàn lợn ựược chia làm 2 ựợt vào tháng 3 và tháng 8, vacxin sử dụng gồm 4 loại : dịch tả lợn, tụ dấu, lở mồm long móng, PRRS (Tai Xanh).
Bảng 4.2 Kết quả tiêm phòng cho ựàn lợn nuôi tại huyện Phúc Thọ năm 2012 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Trước khi xẩy ra dịch rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn tháng 5/2012)
Vacxin sử dụng TT Tên xã Số lợn (con) Dịch tả lợn (liều) Tỷ lệ % Tụ dấu lợn (liều) Tỷ lệ % LMLM (liều) Tỷ lệ % PRRS (liều) Tỷ lệ % 1 Sen chiểu 4600 3000 65,2 500 10,8 500 10,8 400 8,7 2 Phương ựộ 950 580 61 80 8,4 80 8,4 80 8,4 3 Võng xuyên 4207 3450 82 450 10,6 450 10,6 400 9,5 4 Cẩm ựình 689 620 89,9 120 17,4 120 17,4 120 17,4 5 Xuân phú 1627 1300 79,9 300 18,4 300 18,4 200 12,3 6 Vân Phúc 1996 1250 62,6 250 12,5 250 12,5 200 10,0