PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR TỪ MẪU PHÂN LẬP VÀ DỊCH CHIẾT CÂY MÍA BỆNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR TỪ MẪU PHÂN LẬP VÀ DỊCH CHIẾT CÂY MÍA BỆNH Ngành học : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : DANH QUỐC TRANG Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR TỪ MẪU PHÂN LẬP VÀ DỊCH CHIẾT CÂY MÍA BỆNH Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS LÊ ĐÌNH ĐƠN DANH QUỐC TRANG ThS HÀ ĐÌNH TUẤN Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Để có điều kiện học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, tất Quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập trường TS Lê Đình Đơn tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp ThS Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu phát triển mía đường Bến Cát, Bình Dương tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi thời gian thực khóa luận Thầy Nguyễn Văn Lẫm, anh Nguyễn Phan Thành toàn thể bạn sinh viên thực khóa luận Viện công nghệ sinh học môi trường, Trường ĐH Nông Lâm TPHCM giúp đỡ nhiều suốt thời gian qua Bạn bè thân yêu lớp DH07SH chia sẻ vui buồn thời gian học hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Sau cùng, xin bày tỏ lòng kính u biết ơn sâu sắc ba mẹ; cảm ơn ba mẹ anh chị tin tưởng, yêu thương, tạo điều kiện cho học tập hồn tốt khóa luận Sinh viên thực Danh Quốc Trang i TÓM TẮT Ở nước ta nhiều nước giới nay, mía nguyên liệu để chế biến đường ăn Đồng thời, mía mang hiệu kinh tế cao cho người trồng nên xóa đói giảm nghèo cho nơng dân Tuy nhiên, mía có nhiều loại sâu bệnh gây hại, số có bệnh cằn mía gốc Bệnh gây thiệt hại từ – 15% sản lượng mức tổn thất lên đến 50% vụ mía gốc vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) gây chủ yếu cản trở vận chuyển nước chất dinh dưỡng làm cho bị còi cọc làm giảm suất phẩm chất mía Từ thực tiễn trên, đề tài thực nhằm nghiên cứu phương pháp phát vi khuẩn Lxx nhanh chóng xác, góp phần vào chiến lược kiểm soát hạn chế tác hại bệnh cằn mía gốc cách hiệu Đề tài tiến hành đánh giá ảnh hưởng bệnh cằn mía gốc giống ngồi sản xuất phương pháp nhuộm STM Sau dịch chiết bị bệnh cấy trang lên môi trường MSC SC nhằm phân lập dòng vi khuẩn Lxx khu vực Đơng Nam Bộ Đồng thời quy trình phát vi khuẩn Lxx từ dịch chiết mía từ mẫu phân lập kỹ thuật PCR khảo sát Kết nhuộm STM cho thấy phần lớn giống sản xuất bị nhiễm bệnh với mức độ khác Một số dòng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx phân lập môi trường SC MSC Bên cạnh đó, quy trình phản ứng PCR để phát vi khuẩn Lxx từ dịch chiết mẫu phân lập cách nhanh chóng xác với cặp primer Lx1/Lx2 thiết lập thành công ii SUMMARY Thesis title “Detection Leifsonia xyli subsp xyli cause ratoon stunting disease on sugarcane by PCR from isolated samples and fibrovascular fluid of infected sugarcane plants” Recently, sugarcane is the raw material to make processing into sugar in Viet Nam as well as many countries in the world Simultaneously, sugarcane offer high economic efficiency for the plant cane growers that attitude to reduce poverty for farmers However, the sugarcane have a lot of pests and diseases One of them is Ratoon stunting disease (RSD) It can cause losses yield from to 15% , even up to 50% for original sugarcane crop Bacterial Leifsonia xyli subsp xyli (Lxx) caused of this disease has mainly hindered the transport of water and nutrients within plant Hence, it makes sugarcane become stunt and reduces the yield as well as the quality of sugarcane From those practical, this study was made to investigate a method for detection Lxx bacteria quickly and exactly, contributing to strategic of the effectively control and limit for the harmful effect of RSD Affection of RSD on sugarcane cultivars were assessed by the Staining by Transpiration Method (STM) Next, extract liquid of infected plants was outspreaded on MSC and SC medium in other to isolate Lxx bacteria strains in the Eastern South of Vietnam region Simultaneously, a protocol for detecting Lxx bacteria in the sugarcane-extracted liquid and isolated specimens was assayed by the PCR reaction Result of staining STM showed that most of sugarcane cultivars are susceptible with different levels Several strains of Lxx bacteria were isolated on SC and MSC medium Finally, PCR protocol for detecting Lxx bacteria in sugarcane-extracted liquid and isolated specimens quickly and exactly with a pair of primers Lx1/Lx2 was established successfully Keywords: Leifsonia xyli subsp xyli, ratoon stunting disease, sugarcane iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nội dung nghiên cứu .2 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Nội dung Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu sơ lược mía (Saccharum spp.) .3 2.1.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển .3 2.1.2 Phân bố 2.1.3 Phân loại học 2.1.4 Đặc điểm mía 2.1.5 Giá trị kinh tế mía .7 2.2 Các loại bệnh hại mía 2.3 Sơ lược bệnh cằn mía gốc 11 2.3.1 Nguồn gốc phân bố 11 2.3.2 Tác nhân gây bệnh .11 2.3.2 Triệu chứng 12 2.3.3 Tác hại dịch bệnh 14 2.3.4 Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh 14 2.3.5 Biện pháp ngăn chặn kiểm soát dịch bệnh .15 2.4 Các phương pháp chẩn đoán phát vi khuẩn Lxx .15 2.4.1 Chẩn đốn qua triệu chứng bên ngồi 15 iv 2.4.2 Chẩn đốn trực tiếp kính hiển vi .15 2.4.3 Phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method ) .16 2.4.4 Phương pháp huyết học .16 2.4.5 Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử .18 2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 19 2.5.1 Trên giới 19 2.5.2 Trong nước 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu hóa chất thí nghiệm 21 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 21 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 21 3.2.3 Thiết bị, dụng cụ 22 3.3 Phương pháp tiến hành 22 3.3.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 22 3.3.2 Phương pháp ly trích dịch mía từ bệnh 24 3.3.3 Quan sát hình thái gram vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram 24 3.3.4 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 25 3.3.5 Phương pháp ly trích DNA vi khuẩn Lxx 25 3.3.6 Phương pháp kiểm tra DNA tổng số 27 3.3.7 Phương pháp PCR phát vi khuẩn Lxx 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết phát bệnh quan sát vi khuẩn Lxx kính hiển vi .29 4.2 Kết nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx 30 4.3 Kết phát vi khuẩn Lxx dịch chiết mía kỹ thuật PCR 33 4.4 Kết phát vi khuẩn Lxx kĩ thuật PCR từ mẫu phân lập 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : base pair CTAB : Cetyltrimethlyammonium bromide ctv : cộng tác viên dNTP : Deoxyribonucleoside triphosphate EB – ELISA : Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay FADCF : Flourescent antibody directed counting filter FAT : Indirect flourescent antibody technique LT – EIA : Liquid Transfer Enzyme immunoassay Lxx : Leifsonia xyli subsp xyli IgG : Immunoglobulin ITS : Intergenic transcribed spacer region Mb : Mega bases mM : Mili mol NCM : Nitrose cellulose membrance PBS : Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 sodium azide PCR : Polymerase Chain Reaction rRNA : Ribosome ribonuleic acid RNase : Ribonuclease RSD : Ratoon Stunting Disease STM : Staining by Transpiration Method Taq : Thermus aquaticus TBIA : Tissue Blot Enzym Immunoassay TRITC : Tetramethylrhodamine isothiocyanate µl : Micro litre µg : Micro gram µM : Micro mol vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách bệnh hại mía quan trọng phổ biến nấm Bảng 2.2 Danh sách bệnh hại mía quan trọng phổ biến vi khuẩn Bảng 3.1 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 28 Bảng 3.2 Thành phần cho phản ứng PCR .28 Bảng 4.1 Kết chẩn đoán bệnh cằn mía gốc phương pháp STM 29 Bảng 4.2 Kết đo OD DNA ly trích từ dịch chiết 34 Bảng 4.3 Kết đo OD DNA ly trích từ mẫu phân lập 36 Bảng 4.4 Chương trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR .36 Bảng 4.5 Mã số trình tự vi khuẩn Lxx công bố giới 36 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cây mía Hình 2.2 Các phận phát triển từ hom mía sau trồng Hình 2.3 Bệnh nấm Hình 2.4 Bệnh vi khuẩn 10 Hình 2.5 Bệnh virus 10 Hình 2.6 Cây mía có dấu hiệu bệnh cằn mía gốc 11 Hình 2.7 Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli kính hiển vi điện tử 12 Hình 2.8 Triệu chứng mía bị bệnh cằn mía gốc 13 Hình 3.1 Quy trình nhuộm STM để chuẩn đốn mía bệnh 23 Hình 4.1 Lát mỏng cắt ngang thân mía sau nhuộm STM 29 Hình 4.2 Vi khuẩn Lxx từ dịch mía sau nhuộm gram .30 Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn Lxx 31 Hình 4.4 Vi khuẩn Lxx kính hiển vi .33 Hình 4.5 Vi khuẩn Lxx kính hiển vi điện tử 33 Hình 4.6 Kết điện di DNA tổng số .33 Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR từ primer Cxx1/Cxx2 33 Hình 4.8 Kết điện di DNA tổng số vi khuẩn Lxx từ mẫu phân lập 35 Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm PCR từ mẫu nuôi cấy dịch mía 37 Hình 4.10 Kết so sánh trình tự DNA vi khuẩn từ mẫu dịch chiết 38 Hình 4.11 Kết so sánh trình tự DNA vi khuẩn từ mẫu phân lập 38 Hình 4.12 Kết so sánh tương đồng DNA Lxx dịch chiết phân lập 39 viii μm A 0.5 μm B Hình 4.5 Vi khuẩn Lxx kính hiển vi điện tử (A) độ phóng đại 2.000 lần; (B) độ phóng đại 6.000 lần hình chụp Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương (Hai Bà Trưng, Hà Nội) Lxx loại vi khuẩn khó ni cấy phát triển mơi trường ni cấy SC (Davis ctv, 1980) MSC (Brumbley ctv, 2006), môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng phức tạp lại ủ thời gian dài (15 – 42 ngày) nên tạp nhiễm dễ xảy ra; để hạn chế điều này, nalidixic acid bổ sung vào môi trường nuôi cấy qua màng lọc nitrocellulose (0,2 m) Brumbley ctv (2006) chứng minh vi khuẩn Lxx có khả kháng lại nalidixic acid nhạy cảm cao ampicillin (100 g/ml); tetracycline (2 g/ml) kanamycin (50 g/ml) Vi khuẩn Lxx có gen dài 2,6 Mb, có tỉ lệ G – C 68% chứa khoảng 2022 khung đọc mở (open reading frame); thiếu gen trao đổi chất sinh tổng hợp acid amine, đặc biệt gen sinh tổng hợp cystein methionin nên chúng trở nên khó ni cấy Monteiro – Vitorello ctv (2004) tiến hành thí nghiệm phát phát triển vi khuẩn nhanh bổ sung cystein methionine vào môi trường ni cấy Trình tự nhiễm sắc thể vi khuẩn Lxx có số lượng lớn pseudogen (gen khuyết) Pseudogen đoạn gen hình thành xê dịch khung đọc mở, nucleotide đột biến điểm dẫn tới thừa thiếu codon kết thúc tạo gen khơng hồn chỉnh (Monteiro – Vitorello ctv, 2004), theo tác giả thối hóa mặt di truyền quần thể Lxx Ông cho 32 thối hóa xảy q trình thích nghi kí chủ phổ kí chủ hẹp; pseudogen Lxx xác định bao gồm 51 gen mã hóa transposase, gen cần thiết cho biến dưỡng galactose glutarate, gen cần cho tổng hợp cystein methionine, 20 gen gây bệnh gây độc; số lượng lớn gen rối loạn chức giải thích chịu đựng dinh dưỡng Lxx, qua đó, lý giải loại vi khuẩn sống bó mạch mía khó ni cấy 4.3 Kết phát vi khuẩn Lxx dịch chiết mía kỹ thuật PCR Song song với q trình ni cấy tiến hành phát vi khuẩn từ dịch chiết mía phương pháp PCR, bước ly trích DNA bước quan trọng Nếu thực bước ly trích khơng tốt kết sản phẩm PCR khơng mong muốn Vì mẫu ly trích phải yêu cầu tinh sạch, phải đảm bảo khơng ảnh hưởng đến q trình phản ứng PCR Trong bước ly trích để thu sản phẩm DNA tinh với nồng độ cao thao tác quan trọng có ý nghĩa định hút dịch DNA, loại bỏ protein hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol Nếu thao tác khơng cẩn thận sản phẩm không tinh sạch, lẫn tạp phenol ảnh hưởng không tốt đến phản ứng PCR Để xác định độ tinh dùng phương pháp điện di để kiểm tra DNA tổng số mẫu ly trích có kết sau DNA tổng số Hình 4.6 Kết điện di DNA tổng số Giếng 1: VN84-4137, giếng 2: VN85-1427, giếng3:My55-14, giếng 4: R570, giếng 5: ROC16, giếng 6: K84-200, giếng 7: Comus 33 Kết điện di hình 4.6 cho thấy DNA tổng số có độ tinh tương đối, bị đứt gẫy nhiều trình thao tác, vortex, ly tâm với tốc độ cao Ngoài để kiểm tra độ tinh DNA tổng số tiến hành đo OD, kết bảng 4.2 cho thấy đa số mẫu có tỷ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,7 – 1,9 Chứng tỏ DNA ly trích có độ tinh đủ tiêu chuẩn để chạy phản ứng PCR Bảng 4.2 Kết đo OD DNA ly trích từ dịch chiết TT Giống mía OD260nm/OD280nm DNA (µg/ml) VN84-4137 1,831 5,38 VN85-1427 1,753 4,04 My55-14 1,802 5,38 R570 1,742 4,42 ROC16 1,797 5,63 K84-200 1,833 1,86 Comus 1,718 1,73 DNA tổng số pha loãng trước tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi Cxx1/Cxx2 thu kết sau 438 bp 400 bp Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm PCR từ primer Cxx1/Cxx2 Giếng1:My55-14, giếng 2: VN84-4137, giếng 3: R570, giếng 4: ROC16, giếng 5: leader 100 bp, giếng 6: K84-200, giếng 7: VN85-1427, giếng 8: Comus 34 Trong trình thực phản ứng PCR tiến hành điều chỉnh điều kiện phản ứng cho tối ưu Tuy nhiên, sản phẩm thường xuyên không ổn định, lẫn tạp nhiều band khác Điều DNA tổng số chưa thật tinh sạch, điều kiện phản ứng chưa tối ưu hóa nhiệt độ, thời gian thành phần phản ứng Mặc dù vậy, kết điện di hình 4.7 cho thấy sản phẩm PCR xuất vị trí band có kích thước khoảng 438 bp Kích thước sản phẩm PCR phù hợp với nghiên cứu công bố trước sử dụng cặp mồi Cxx1/Cxx2 (Davis ctv, 1998; Gao ctv, 2008) Chính tính ổn định cặp mồi Cxx1/Cxx2 q trình thực khơng cao, nên cần phải tiến hành thiết kế cặp mồi Lx1/Lx2 dựa vùng ITS gen rRNA 16S 23S operon rRNA vi khuẩn Lxx 4.4 Kết phát vi khuẩn Lxx kĩ thuật PCR từ mẫu phân lập Vi khuẩn từ đĩa khuẩn lạc có đặc điểm mơ tả: tròn lồi, có rìa khơng có sắc tố, đường kính 0,1 – 0,3 mm quan sát kính hiển vi điện tử, hình 4.5 cho thấy, vi khuẩn qua ni cấy có hình dạng tương tự Lxx mơ tả (Davis ctv, 1980, 1984) Nhưng số vi khuẩn kính hiển vi điện tử có đường kính lớn 0,5 m, cần sử dụng phương pháp PCR để khẳng định vi khuẩn Lxx Thu sinh khối cách dùng que cấy chấm vào khuẩn lạc khuấy vào eppendorf có chứa 200 µl nước cất vơ trùng Sinh khối thu tiến hành ly trích DNA, DNA ly trích kiểm tra phương pháp điện di đo OD kết thu DNA tổng số Hình 4.8 Kết điện di DNA tổng số vi khuẩn Lxx từ mẫu phân lập Giếng1:My55-14, giếng 2: VN 84-4137 đĩa 1, giếng 3: VN84-4137 đĩa 2, giếng 4: K84-200, giếng 5: Comus 35 Bảng 4.3 Kết đo OD DNA ly trích từ mẫu phân lập TT Giống mía OD260nm/OD280nm DNA (µg/ml) My55-14 1,937 18,15 VN 84-4137(1) 1,883 15,29 VN84-4137(2) 1,813 28,45 K84-200 1,762 21,97 Comus 1,831 14,67 (1) đĩa nuôi cấy 1; (2) đĩa nuôi cấy Kết điện di hình 4.8 cho thấy mẫu có nồng độ độ tinh cao Bên cạnh đó, kết đo OD bảng 4.3 cho thấy đa số DNA ly trích từ mẫu phâp lập có tỷ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng khoảng 1,7 – 2,0, chứng tỏ DNA ly trích đủ tiêu chuẩn dùng cho phản ứng PCR DNA tổng số ly trích từ mẫu ni cấy có nồng cao nên tiến hành pha lỗng trước dùng cho phản ứng PCR Cùng với mẫu ly trích trực tiếp từ dịch chiết, mẫu ni cấy sau nhiều lần chạy phản ứng PCR với chương trình nhiệt khác nhau, kết thu band đặc hiệu (363 bp) (hình 4.9) phù hợp với lý thuyết thiết kế mồi Dựa sở khuếch đại primer Lx1/Lx2 với chuơng trình nhiệt tối ưu trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Chương trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR phát Lxx Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) 40 Thời gian 95 phút 95 30 giây 55 30 giây 72 phút 72 10 phút Giữ 40C Sau khuếch đại, sản phẩm PCR gửi cho công ty Việc Á để giải trình tự nhằm xác định đoạn gen vi khuẩn khuếch đại 36 363 bp 400 bp Hình 4.9 Kết điện di sản phẩm PCR từ mẫu ni cấy dịch mía Giếng 1: My55–14, giếng 2: VN 84–4137 phân lâp, giếng 3: Comus phân lập, giếng 4: VN 84–4137, giếng 5: ROC16, giếng 6: VN85-1427, giếng 3: Comus, giếng 8: leader 50 bp Với kết giải trình tự sản phẩm PCR sau khuếch đại cặp mồi Lx1/Lx2 từ mẫu dịch chiết phân lập giống VN84–4137 BLAS NCBI để so sánh tương đồng với chủng công bố giới (bảng 4.5) Bảng 4.5 Mã số trình tự vi khuẩn Lxx công bố giới Mã số Tác giả Nơi phân lập Năm AF034641.1 Fegan ctv Australia 1998 AF056003.1 Pan ctv Mỹ 1998 AE016822.1 Monteiro-Vitorello Brazil 2004 DQ232616.2 Young ctv Australia 2007 EU723209.1 Gao ctv Trung Quốc 2008 Kết BLAS NCBI (hình 4.10 4.11) cho thấy mẫu vi khuẩn thu trực tiếp từ dịch chiết cho tỷ lệ tương đồng cao (85 – 89%) với chủng vi khuẩn công bố Mức độ che phủ 100% so với mã số DQ232616, AE016822 AF056003 Đồng thời tỷ lệ thấp so sánh với mã số AF034641 (97%) EU723209 (69%) Tương tự, kết mẫu vi khuẩn qua phân lập môi trường nhân tạo cho độ tương đồng cao (81 – 84%) Độ che phủ giống với mẫu dịch chiết khác biệt 37 mã số EU723209 (76% 69%) Điều chứng tỏ mẫu vi khuẩn thu thập Lxx có khác biệt nhỏ so với Lxx giới mức độ phân tử Hình 4.10 Kết so sánh trình tự DNA vi khuẩn từ mẫu dịch chiết (giống VN844137) với kết cơng bố GenBank Hình 4.11 Kết so sánh trình tự DNA vi khuẩn từ mẫu phân lập (giống VN84-4137) với kết công bố GenBank Để kiểm tra lại trình tự DNA mẫu dịch chiết mẫu phân lập từ giống VN84-4137 tiến hành so sánh với trình tự cơng bố phần mềm CLUSTALX Kết hình 4.12 cho thấy mức độ tương đồng cao (trên 80%) so với chủng công bố giới Với kết thu cho thấy phương pháp PCR với cặp mồi Lx1/Lx2 phát vi khuẩn Lxx mẫu phân lập dịch chiết mía Vì vậy, áp dụng phương pháp việc chẩn đốn nhanh ruộng mía bị nhiễm bệnh 38 Hình 4.12 Kết so sánh trình tự tương đồng DNA vi khuẩn từ mẫu dịch chiết phân lập (giống VN84-4137) với kết công bố GenBank 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu rút số kết luận sau: - Phương pháp STM có ý nghĩa quan trọng cơng tác khảo sát đánh giá nhanh trạng đồng ruộng bị nhiễm RSD - Sau khoảng thời gian nuôi cấy phân lập dòng khuẩn lạc có đặc điểm giống mô tả khuẩn lạc vi khuẩn Lxx (đường kính phổ biến 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa khơng có sắc tố) nhận thấy loại vi khuẩn khó ni cấy, đòi hỏi mơi trường dinh dưỡng phức tạp thời gian nuôi cấy dài nên tạp nhiễm dễ xảy - Phương pháp PCR với cặp mồi Lx1/Lx2 phát vi khuẩn Lxx dịch chiết trực tiếp từ mía qua ni cấy nhân tạo 5.2 Đề nghị  Xây dựng thiết lập quy trình chẩn đốn sớm bệnh cằn mía gốc giai đoạn nhỏ Vì phần lớn phương pháp xác định bệnh mía tháng tuổi  Cần phải thiết lập quy trình ni cấy vơ trùng hiệu tìm mơi trường thích hợp SC MSC để rút ngắn thời gian giảm tạp nhiễm q trình ni cấy  Ứng dụng phương pháp PCR với cặp mồi Lx1/Lx2 việc kiểm dịch giống mía phát nhanh Lxx cơng tác sản xuất giống mía bệnh cho vùng mía nguyên liệu trọng điểm 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Nguyễn Anh Khoa 2006 Phát bệnh khảm mía kĩ thuật ELISA bước đầu nghiên cứu phát bệnh cằn mía gốc kĩ thuật PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông LâmTP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất nơng nghiệp Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp ứng dụng Nhà xuất Nông Nghiệp HCM Trang 87-96, 107-119 Đoàn Thị Thanh Nhàn 1996 Chương 8: Cây mía Giáo trình cơng nghiệp (Đồn Thị Thanh Nhàn) Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Chu Thị Bích Phượng 2007 Nghiên cứu phát vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli tác nhân gây bệnh cằn mía gốc Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Trần Văn Sỏi 2003 Cây mía Nhà xuất Nghệ An Trần Thùy 1996 Kỹ thuật trồng mía Nhà xuất Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh Trang – 8 Hà Đình Tuấn 2004 Điều tra thành phần bệnh hại mía số giống nhập nội khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng vùng mía ngun liệu miền Đơng Nam Bộ Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Huy Ước 1999 Cây mía kĩ thuật trồng Nhà xuất Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh Trang 11 – 16 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 10 Bailey R A and Tough S A 1992 Ratoon Stunting Disease: survival of Clavibacter xyli subsp xyli, in field soil and its spread to newly planted sugarcane Proceedings South African Sugar Techonogists Association Annual Congress 66: 75 – 77 11 Brumbley S M., Petrasovits L A., Hermann S R., Young A J and Croft B J 2006 Recent advances in the molecular biology of Leifsonia xyli subsp xyli, causal organism of ratoon stunting disease Australian Plant Pathology 35: 681 – 689 12 Comstock J C., Shine J M., Davis M J., and Dean J L 1996 Relationship between resistance to Clavibacter xyli subsp xyli colonization in sugarcane and spread of ratoon stunting disease in the field Plant Disease 80: 704 – 708 13 Comstock J C and Lentini R S 2005 Sugarcane Ratoon Disease Florida Sugarcane Handbook, an electronic publication of the Agronomy Department 14 Damann K E 1992 Effect of sugarcane cultivar susceptibility on spread of ratoon stunting disease by the menichal harvester Plant Disease 76: 1148 – 1149 15 Davis M J and Bailey R A 2000 Ratoon stunting A Guide to Sugarcane Diseases (Eds Rott P., Bailey R A., Comstock J C., Croft B J and Saumtally A S.) Montpellier, France p 49 – 54 41 16 Davis M J and Dean J L 1984 Comparison of diagnostic techniques for determining incidence of ratoon stunting disease of sugarcane in Florida Plant Disease 68: 896 – 899 17 Davis M J., Gilaspie A G., Harris R W., and Lowson R H 1980 Ratoon Stunting Disease of sugarcane: Isolation of the causal bacterium Science 210: 1365 – 1367 18 Fegan M., Croft B.J., Teakle D.S., Hayward A.C and Smith G.R 1998 Sensitive and specific detection of Clavibater xyli subsp xyli, causal agent of ratoon stunting disease of sugarcane, with a polymerase chain reaction-based assay Plant Pathology, 47: 495-504 19 Frison E A and Putter C A J., 1993 FAO/IBPGR Technical guidelines for the safe movement of sugarcane germplasm The International society of sugar cane technologists 20 Gao S J, Pan Y B, Chen R K, Chen P H, Zhang H·and Xu L P 2008 Quick detection of Leifsonia xyli subsp xyli by PCR and nucleotide sequence analysis of PCR amplicons from Chinese Leifsonia xyli subsp xyli isolates Sugar Tech 10(4) : 334-340 21 Grisham M P., Pan Y B., and Richard E P 2007 Early detection of Leifsonia xyli subsp xyli in sugarcane leaves by Real – Time Polymerase Chain Reaction Plant disease 91: 430 – 434 22 Giglioti E A., Comstock J C., Davis M J., Matsuoka S and Tokeshi H 1999 Combining tissue blot enzyme immunoassay and staining by transpiration methods to evaluate colonization of sugarcane stalks by Clavibacter xyli subsp xyli and its effects on the xylem functionality Summa Phytopathologica 25: 125 – 132 23 Gillaspie A G., Teakle D S 1989 Ratoon Stunting Disease Diseases of sugarcane: major diseases (Eds Ricaud C., Egan B T., Gillaspie A G., Hughes C G.) Elsevier Science Publishing, Inc., New York p 59 – 80 24 Hoy J W., Grisham M P., Damann K E., 1999 Spread and increase of ratoon stunting disease of sugarcane and Comparision of disease detection methods Plant Disease 12: 1170 – 1175 25 Kao J and Damann K E 1978 Microcolonies of the bacterium associated with ratoon stunting disease found in sugarcane xylem matrix Phytopathology 68: 545 – 551 26 Monteiro – Vitorello Claudia B., Camargo Luis E A and Sluys Marie A Van 2004 The Genome sequence of the Gram – Positive Sugarcane Pathogen Leifsonia xyli subsp xyli Molecular Plant – Microbes interaction: p 827 – 836 27 Pan Y B., Grisham M P., and Burner D M 1998 A Polymerase Chain Reaction Protocol for the Detection of Clavibacter xyli subsp xyli, the causal bacterium of Sugarcane Ratoon Stunting Disease Plant Disease 82: p 285 – 290 28 Ricaud C., Egan B.T., Gillaspie A G and Hughes C.G., 1989 Disease of sugarcane: Major diseases International Society of Sugarcane Technologist 29 Taylor P W J., Petrasovits L A., Velde R Vander, Birch R G., Croft B J., Fegan M., Smith G R and Brumbley S M., 2003 Development of PCR- based markers for detection of Leifsonia xyli subsp xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane plants Australasian Plant Pathology 32: 367 – 375 42 30 Young A J., Brumbley S M 2004 Ratoon stungting disease: history, management and current research Sugarcane pathology Vol III: Bacterial and nematode diseases (Eds Rao G P., Saumtally A S., Rott P.) Science Publishers, Inc.: Enfield, NH p 97 – 124 31 Young A J., Petrasovits L A., Croft B J., Gillings M and Brumbley S M 2006 Genetic uniformity of international isolates of Leifsonia xyli subsp xily, causal agent of ratoon stunting disease of sugarcane Australasian Plant Pathology 35: 503 – 511 32 Westphal Andreas and Mirkov T Erik, 2003 Need for improved detection of Ratoon Stunting Disease in sugarcane in South Texas Subtropical Plant Science 55: 68 – 71 Tài liệu tham khảo từ Internet 33 34 35 36 37 http://www.apsnet.org/online/slideset/sugrcane/images.htm http://www.leifsonia.lncc.br/lxxsite/index.php http://www.pakissan.com/english/allabout/crop/sugarcane.shtml http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://giongmia.wordpress.com/ 43 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli Bảng Thành phần môi trường SC (cho lít mơi trường) Thành phần hấp - Thành phần lọc Cornmeal = 15 g Agar = 15 g Soytone = g K2HPO4 = g KH2PO4 = g MgSO4.7H2O = 0,2 g Bovine hemine chloride = 15 mg H2O = 800 ml - Bovine serum albumine = g Glucose = 0,5 g Cystein = 0,5 g H2O = 200 ml Hòa tan thành phần hấp nước điều chỉnh pH môi trường giá trị pH 6,6 với NaOH 1N HCl 1N Hòa tan thành phần lọc nước cất vô trùng Hấp tiệt trùng môi trường, để nguội đến khoảng 55C; sau đó, cho thành phần lọc nalidixic acid (10 mg/l) vào qua màng lọc vô trùng (Davis ctv 1980) Bảng Thành phần môi trường MSC (cho lít mơi trường) Thành phần hấp - Corn meal agar = 17 g Bacto – agar = g Bacto – peptone = g Bovine hemine chloride = 30 ml (Dung dịch 0,1% NaOH 0,05N) MgSO4 7H2O = 0,2 g K2HPO4 (0,1 M) = 13 ml KH2PO4 (0,1 M) = 87 ml H2O = 800 ml Thành phần lọc - Glucose = g Cystein = 0,5 g Bovine serum albumine = g H2O = 100 ml Hòa tan thành phần hấp nước điều chỉnh pH môi trường giá trị pH 7,5 với NaOH 5N Các bước tiến hành tương tự cách chuẩn bị môi trường SC (Brumbley ctv 2006) Phụ lục 2: Một số hình ảnh q trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc A B C D Hình Chẩn đốn thu thập mẫu bệnh phương pháp nhuộm STM (A) ruộng mía có dấu hiệu bệnh, (B) mía nhuộm dung dịch Safranin trời nắng, (C) mía sau nhuộm, (D) khác biệt bó mạch mía nhuộm khơng nhuộm A B C D Hình Q trình chuẩn bị mẫu mía cho ly trích dịch (A) mẫu mía bệnh sau chà lớp cặn bùn bám bên ngồi, (B) mẫu mía sau khử trùng, (C) tách lớp vỏ bên để ly trích dịch, (D) khuẩn lạc ni cấy từ dịch chiết xuất sau 20 ngày ủ ... mía đường phát triển, đáp ứng đủ nhu cầu nước xuất Trước thực tiễn đề tài "Phát vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc kỹ thuật PCR từ mẫu phân lập dịch chiết mía bệnh" ... vi khuẩn Lxx kính hiển vi .29 4.2 Kết nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx 30 4.3 Kết phát vi khuẩn Lxx dịch chiết mía kỹ thuật PCR 33 4.4 Kết phát vi khuẩn Lxx kĩ thuật PCR từ mẫu phân lập. .. cằn mía gốc thu dịch chiết từ mía bệnh Sau đó, xác định diện vi khuẩn Lxx dịch chiết mía kính hiển vi - Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết mía bị bệnh môi trường thạch MSC SC - Phát vi khuẩn