Luận văn : NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC part 5 docx

41 chiết qua màng lọc 0,45 m và tiến hành cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, các khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả khuẩn lạc Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố) (Davis, 1980) được cấy chuyền sang các đĩa môi trường khác. Tăng sinh các khuẩn lạc thuần sau 2 lần cấy chuyền trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. Thành phần các môi trường nuôi cấy được trình bày trong bảng phụ lục 1, 2, 3. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 (thí nghiệm 3) được sử dụng trong các thử nghiệm sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx. Trong thí nghiệm này, chúng tôi chỉ tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Lxx (xác định Gram, thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate (manitol, sorbitol), thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào (catalase, amylase, protease). Từ bảng liệt kê các thử nghiệm sinh hóa của Lxx (phụ lục 6) cho thấy loại vi khuẩn này cho kết quả dương tính với manitol và catalase; âm tính với sorbitol, amylase, protease. Kết quả của các phản ứng sinh hóa chính là cơ sở ban đầu nhằm phát hiện vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. 42 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, tiến hành khảo sát tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch vàng) trong từng lóng dọc theo chiều cao cây. Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây Số lóng Số bó mạch đỏ trung bình Số bó mạch vàng trung bình Tổng số bó mạch trung bình Tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình (%) 1 2 3 4 5 6 7 142 156 168 182 185 180 176 49 36 25 10 8 13 16 191 192 193 192 193 193 192 74,4 81,3 87,1 94,8 95,9 93,3 91,7 * số lóng được tính theo vị trí từ gốc lên ngọn. ** số bó mạch trung bình của 20 cây đã được làm tròn. Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình của các cây bị bệnh thấp nhất ở lóng số 1 (74,4 %), tỉ lệ này tăng dần theo chiều cao cây ở các lóng tiếp theo và cao nhất ở lóng số 5 (95,9 %). Ngoài ra, trong quá trình quan sát, sự phân bố vi khuẩn trong cùng một lóng theo tiết diện ngang của cây cũng được ghi nhận, số lượng bó mạch bị nhiễm vi khuẩn tập trung nhiều nhất ở phần lõi bên trong và ít nhất ở các bó mạch bên ngoài gần biểu bì. Ghi nhận này có độ tin cậy cao bởi theo kết quả khảo sát bằng phương pháp nhuộm STM trên 8 giống mía khác nhau của Giglioti và ctv. (2000) cho thấy sự phân bố của các bó mạch bị mất chức năng trên một lát cắt lần lượt là 29,8 %, 15,5 % và 6,7 % đối với những mô ở trong, mô ở 43 giữa và mô ở ngoài gần biểu bì. Bó mạch bị mất chức năng khi có sự xâm nhiễm của vi khuẩn Lxx gây tắc bó mạch. Nước đi lên trong mạch mộc và thoát ra ngoài khí quyển nhờ 3 lực: lực đẩy nước từ rễ, lực mao dẫn và lực kéo nước từ lá (sự thoát hơi nước). Tuy nhiên, đối với những cây cao như cây mía, lực đẩy nước do áp suất dương ở gốc (rễ) không đủ mạnh để dẫn nước trong mạch mộc đi lên, chính lá tạo sức căng lớn (áp suất thủy tĩnh âm) kéo cột nước đi lên (Bùi Trang Việt, 2002). Phương pháp nhuộm STM được thực hiện dựa vào sự thoát hơi nước của lá, trong đó, thuốc nhuộm safranin được dẫn lên thân qua các bó mạch còn chức năng tức là chỉ nhuộm được các bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn chứ không nhuộm các bó mạch bị nhiễm khuẩn. Nếu mạch mộc bị tắc ở lóng bên dưới thì không thể dẫn thuốc nhuộm safranin lên các lóng tiếp theo; do đó, tỉ lệ bó mạch đỏ trong lóng bên trên sẽ bằng hoặc giảm hơn so với lóng bên dưới nếu ở lóng này xuất hiện các mạch tắc mới do sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Vì vậy, trên lý thuyết, tỉ lệ bó mạch đỏ sẽ giảm dần trong các lóng dọc theo chiều cao cây. Tuy nhiên, kết quả thực tế ghi nhận được ở bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình thấp nhất ở lóng sát gốc và tăng dần trong các lóng tiếp theo dọc theo chiều cao cây. Có thể giải thích được sự thay đổi tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình dọc theo các lóng dựa vào cấu tạo mạch mộc. Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM a: quan sát bằng mắt thƣờng; b: quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 lần; c: quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần 1. Bó mạch vàng: bó mạch bị nhiễm vi khuẩn Lxx; 2. Nội bì; 3. Bó mạch đỏ: bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn Lxx. Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ không có vi khuẩn; c: nội bì 1 2 3 44 45 46 Theo Bùi Trang Việt (2002), sợi mộc có cấu tạo là sợi dài với vô số các lỗ trên vách và các yếu tố mạch ngắn hơn có hai đầu bị "xoi lỗ" một phần hay hoàn toàn. Các yếu tố mạch xếp chồng lên nhau, tạo nên những ống liên tục rất dài. Các yếu tố mạch cũng thông thương với nhau và với các sợi mạch qua các lỗ trên vách dọc, đây là điều kiện thuận lợi để nước vào và di chuyển khá tự do trong mạch mộc. Trong quá trình vận chuyển nước lên lá, vấn đề quan trọng của thực vật là phải tránh các bọt khí xuất hiện làm gián đoạn cột nước trong mạch mộc. Đây là một vấn đề rất phức tạp vì lực cần để loại bỏ các bọt khí trong cột nước rất lớn, hơn nữa, bóng khí nhỏ khi xuất hiện sẽ kéo dài dưới sức kéo, lan rộng cả hệ thống mạch làm thực vật bị khô và chết. Tuy nhiên, điều này thường không xảy ra vì nước có thể đi vòng bóng khí để qua các ống dẫn xung quanh nhờ các lỗ trên vách (Bùi Trang Việt, 2002). Nguyên tắc này được áp dụng để giải thích khả năng dẫn truyền của thuốc nhuộm safranin trong các mạch mộc bị vi khuẩn kí sinh. Trong trường hợp này, có thể các lỗ trên vách dọc của mạch mộc cũng đóng vai trò như một cửa thông cho phép thuốc nhuộm safranin vòng qua vị trí tắc trong mạch mộc do vi khuẩn gây ra và tiếp tục quá trình dẫn truyền lên các lóng mía phía trên. Do vậy, dựa vào sự hiện diện của bó mạch tắc và tỉ lệ bó mạch thông trong thân mía người ta có thể xác định, đánh giá mức độ nhiễm bệnh của cây trên cánh đồng (Giglioti và ctv., 1999). Phương pháp nhuộm STM được Giglioti và ctv. (1999, 2000); Hà Đình Tuấn (2004) sử dụng để phát hiện và đánh giá tình hình nhiễm bệnh cằn mía gốc. Do tính chất định tính của nghiên cứu, các tác giả này đã đề nghị thời gian thực hiện phương pháp nhuộm STM là 30 phút; tuy nhiên, khoảng thời gian 30 phút có thể là quá ngắn đối với thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây bị bệnh. Lập luận này được chứng minh thông qua sự giảm tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình ở lóng số 6 và lóng số 7, có lẽ thuốc nhuộm safranin không thể dẫn lên được toàn bộ các lóng của cây, đặc biệt là các lóng gần ngọn (lóng 6, 7, 8) sau thời gian 30 phút. Mặc dù tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình ở lóng số 6 và lóng số 7 không phù hợp với quy luật đã được khảo sát ở 5 lóng gần gốc, nhưng kết quả ở bảng 4.1 đã khẳng định lóng số 1 là nơi có sự phân bố của vi khuẩn Lxx nhiều nhất so với tất cả các lóng còn 47 lại dọc theo chiều cao của cây bị bệnh. Kết quả này phù hợp với nhận định của Grisham và ctv. (2007), tác giả cho rằng mặc dù Lxx là một loại vi khuẩn gây tắc bó mạch có sự xâm nhiễm mang tính hệ thống trên toàn cây mía nhưng mật độ vi khuẩn khác nhau giữa các mô; trong đó, Lxx tập trung nhiều nhất ở mô thân. Ông kết luận rằng mật độ vi khuẩn trong thân cao nhất ở lóng sát gốc và giảm dần ở các lóng hướng về phía ngọn. Trong các công trình nghiên cứu đã được công bố, Davis và Dean (1984) cũng thấy rằng có nhiều vi khuẩn trong thân ở các giai đoạn sau của mùa vụ và nồng độ vi khuẩn cao nhất ở phần sát gốc. Sự phân bố của vi khuẩn dọc theo các lóng của cây mía bị bệnh có thể liên quan đến hàm lượng đường trong quá trình chín của mía. Trong quá trình chín, đường được tích lũy trong cây mía theo hướng từ dưới lên trên, lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Ngoài ra, sự đổi màu bên trong bó mạch ở các đốt của thân cây mía bệnh đã trưởng thành cũng có thể liên quan đến sự phân bố của vi khuẩn trong các lóng; theo Davis và Dean (1984), sự đổi màu thường diễn ra ở lóng dưới rồi mới lên đến các lóng phía trên và các vết đổi màu này thường được định vị ở những vùng dưới bẹ lá ngay tại vị trí xuất dịch cây, đây là nơi phát sinh ra lá và nhánh của các bó mạch. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng Nguồn cây con nuôi cấy mô được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương và trồng tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Sau thời gian 3 tháng, tiến hành chủng bệnh đối với tất cả các cây trong mỗi bụi bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh cằn mía gốc. Kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1 cho thấy VN85-1427 là giống có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất trong 5 giống mía sản xuất được trồng tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương (C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427). Do đó trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất thuộc giống VN85-1427 để thu nhận dịch chiết. Dịch chiết được thu nhận từ lóng 1 (lóng có mật độ vi khuẩn cao nhất) (theo kết quả thí nghiệm 48 1) và lọc qua màng lọc 0,45 m nhằm hạn chế sự tạp nhiễm với các loại mầm bệnh khác trước khi chủng vào cây nuôi cấy mô (Brumbley và ctv., 2006). Sau các khoảng thời gian khác nhau (15, 30, 45, 60 ngày), tiến hành khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp nhuộm STM; số liệu được ghi nhận là tỉ lệ mạch đỏ của một cây mía đã được chủng trong mỗi bụi ở các thời điểm khảo sát. Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô đƣợc chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình Số liệu khảo sát được trình bày trong bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ thành công của phương pháp chủng rất cao, hầu hết các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi sau khi chủng đều bị bệnh với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình (77,5 % - 98,5 %). Sau quá trình thử nghiệm hiệu quả của các phương pháp khác nhau, Young và Brumbley (2004) cho rằng phương pháp chủng bệnh bằng cách cắt ngang cây mía ở phía trên mô phân sinh ngọn và chuyển 100 l dịch vi khuẩn nuôi cấy vào bề mặt mới cắt là tốt nhất. Các tác giả cũng đã chứng minh rằng chủng bệnh bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx được vô trùng qua màng lọc sẽ làm tăng khả năng tạo thành khuẩn lạc của vi khuẩn trong thân mía. Vi khuẩn Lxx bắt đầu phát triển làm tắc bó mạch của các cây nuôi cấy mô sau thời gian chủng khoảng 30 ngày, điều này được thể hiện trong bảng 4.2 thông qua tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình (92,9 %). Trong các lần khảo sát tiếp theo (45 ngày và 60 ngày sau chủng), tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình lần lượt là 90,4 % và 89,5 % cho thấy tỉ lệ này có sự giảm dần theo thời gian sau khi chủng bệnh, điều này đồng nghĩa với tỉ Thời gian sau chủng Tỉ lệ mạch đỏ (%) Bụi đối chứng Bụi 1 Bụi 2 Bụi 3 Bụi 4 Bụi 5 Bụi 6 Bụi 7 Trung bình 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày 100 100 100 100 100 98,5 81,8 77,5 100 93,2 91,5 89,5 100 92,0 92,1 94,0 100 97,1 86,0 94,6 100 89,4 86,7 83,0 100 83,1 96,2 94,0 100 97,3 98,4 94,1 100 92,9 90,4 89,5 49 lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn trong cây tăng dần lên theo thời gian; do đó, có thể kết luận rằng mật độ vi khuẩn Lxx trong thân mía gia tăng dần theo thời gian. Sau khi chủng khoảng 30 ngày, sự tắc mạch do vi khuẩn mới có thể phát hiện được bằng phương pháp nhuộm STM; trước khoảng thời gian này, rất khó nhận biết được sự hiện diện của vi khuẩn trong bó mạch và dường như không thể xác định được tình trạng bệnh của cây. Kết luận này phù hợp với phát biểu của nhiều nhà nghiên cứu trước đây trên thế giới. Theo Hoy và ctv. (1999), nồng độ vi khuẩn trong dịch chiết gia tăng trong suốt quá trình phát triển của cây, vì vậy giai đoạn lan truyền bệnh quan trọng nhất diễn ra trong quá trình trồng và thu hoạch. Pan và ctv. (1998) cũng cho rằng nồng độ vi khuẩn Lxx cao nhất ở trong cây vào thời điểm cuối vụ mía và có thể được phát hiện bằng kính hiển vi hoặc phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, các phương pháp này lại cho kết quả không chắc chắn nếu thực hiện vào đầu hay giữa vụ mía vì lúc này nồng độ vi khuẩn trong thân thấp hơn. Kết quả quan sát vi khuẩn của Bailey (1977) bằng kính hiển vi đối pha trên tất cả các mô và vị trí lóng cho thấy nồng độ vi khuẩn cao nhất khi cây mía đã trưởng thành (trích dẫn bởi Davis và Dean, 1984). Theo Grisham và ctv. (2007), các phương pháp miễn dịch có thể phát hiện vi khuẩn Lxx trong mô thân của cây lớn hơn 5 tháng tuổi một cách hiệu quả vì ở giai đoạn này trong thân có nồng độ vi khuẩn cao hơn. Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc a. cây mía đối chứng không bị bệnh; b. cây mía bị bệnh sau khi chủng có vết đổi màu tại các bó mạch ở phía dưới mắt mía 50 Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành chủng bệnh ở phần ngọn của cây nhưng kết quả vẫn cho thấy mật độ vi khuẩn tập trung cao nhất ở phần gốc. Để giải thích cơ chế lan truyền của vi khuẩn Lxx sau khi được chủng vào cây khỏe mạnh phải dựa vào vai trò của mạch libe và mạch mộc cũng như sự liên hệ giữa chúng trong chu trình vận chuyển vật chất của thực vật. Mạch mộc có cấu tạo là những ống liên tục, rất dài với các tế bào chết có vách thứ cấp, tẩm lignin, không còn màng và nguyên sinh chất (Bùi Trang Việt, 2002). Sau khi chủng bệnh, có thể dịch vi khuẩn lan truyền xuống phần gốc theo con đường mạch mộc. Ngoài ra, dịch vi khuẩn cũng có thể hiện diện ở phần gốc thông qua con đường dẫn truyền của mạch libe. Nếu mô mộc vận chuyển nước và các chất khoáng từ rễ tới các phần hiếu khí (lá), thì libe chuyển vị các sản phẩm đồng hóa từ lá tới các vùng đang tăng trưởng và dự trữ (thân, rễ).Tuy nhiên, giữa mạch mộc và mạch libe có sự liên hệ với nhau nhờ các tia. Tia là các dãy tế bào nhu mô nằm xuyên mô mộc, đây là con đường vận chuyển ngang của các chất dinh dưỡng, từ con đường này có sự lưu thông vật chất giữa mạch mộc và mạch libe do có sự chênh lệch về nồng độ (Bùi Trang Việt, 2002). Do đó, có khả năng vi khuẩn Lxx được chủng ở phần ngọn của cây sẽ lan truyền xuống phần gốc theo dịch nhựa luyện được tổng hợp ở lá và “cư trú” trong mạch mộc nhờ các con đường lưu thông vật chất giữa mạch mộc và mạch libe. Giả thiết này cũng có cơ sở để chứng minh do phương pháp nhuộm STM chỉ phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn trong mạch mộc sau khi chủng bệnh khoảng 30 ngày. Có lẽ trong thời gian đầu sau khi chủng bệnh, phần ngọn và lá của cây đã bị cắt mất nên không có khả năng quang hợp tạo đường; do đó, sự chuyển vị trong mạch libe diễn ra rất hạn chế, chỉ sau khi bộ lá phát triển lại đầy đủ, quá trình quang hợp xảy ra thì vi khuẩn mới có khả năng đi xuống phần gốc theo dịch libe. Steindl (1949) cũng xác nhận rằng sự di chuyển của tác nhân gây cằn mía gốc nhờ vào sự di chuyển của dịch cây và từ đó lây bệnh khắp cây (trích dẫn bởi Davis và Dean, 1984). Davis và Dean (1984) nhận thấy có sự xuất hiện của chất kết dính có màu ở bên trong các bó mạch và nằm bịt kín các mạch mộc lớn. Một số cấu trúc libe cũng bị hủy hoại và bít kín, đồng thời các tế bào nằm bên cạnh các mô này cũng bị . vi khuẩn Lxx; 2. Nội bì; 3. Bó mạch đ : bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn Lxx. Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ không có vi khuẩn; c: nội bì 1 2 3 44 45. nghiên cứu đã được công bố, Davis và Dean (1984) cũng thấy rằng có nhiều vi khuẩn trong thân ở các giai đoạn sau của mùa vụ và nồng độ vi khuẩn cao nhất ở phần sát gốc. Sự phân bố của vi khuẩn. cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, tiến hành khảo sát tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn