Luận văn : NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC part 4 ppt

31 Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay (EB – ELISA): phương pháp EB - ELISA do Croft và ctv. đưa ra năm 1994 để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Dịch chiết nước mía được ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong 5 phút. Dịch nổi được loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm. Mẫu phân tích được cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 35°C. Sau khi ủ, mẫu được đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể. Phương pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường với mật độ thấp hơn 10 5 tế bào/ml và 5.10 5 tế bào/ml trong dịch chiết. Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT – EIA): Leaman và ctv. (1991) sử dụng phương pháp LT - EIA để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc và so sánh phương pháp này với phương pháp FADCF. Phương pháp LT - EIA phát hiện được Lxx ở nồng độ 5.10 1 tế bào/ml dịch chiết và cho độ chính xác đến 98 %. FADCF có khả năng phát hiện 5.10 1 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100 %. Tuy nhiên, FADCF không thể thực hiện nhiều mẫu cùng một lúc còn LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lượng mẫu lớn (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Mặc dù những kĩ thuật này được chấp nhận vì đủ độ nhạy, tương đối rẻ tiền và hiệu quả nhưng đòi hỏi người phân tích phải có kinh nghiệm, đặc biệt khi giải thích các kết quả kiểm tra âm tính. Tất cả các kĩ thuật huyết thanh để phát hiện vi khuẩn này đều dựa vào huyết thanh miễn dịch đa dòng chống lại tất cả các vi khuẩn. Theo Davis và Dean (1984), giới hạn phát hiện là 10 4 tế bào/ml dịch chiết có thể được cải thiện bằng cách dùng các kháng thể đơn dòng. 2.4.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử Dưới kính hiển vi hay bằng phương pháp miễn dịch học ta có thể phát hiện được Lxx vào cuối vụ mía lúc mà nồng độ vi khuẩn cao nhất trong cây (Pan và ctv., 1998). Tuy nhiên, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh trên mía có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong các chương trình trao đổi giống để tránh sự lan truyền bệnh từ vùng này sang vùng khác hay từ quốc gia này sang quốc gia khác (Taylor và ctv., 2003). Gần đây, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và phát hiện vi khuẩn Lxx ở cây mía đã đem lại các kết quả đáng tin cậy, có độ nhạy, 32 độ đặc hiệu cao trong giai đoạn sớm. Theo Taylor và ctv. (2003), phương pháp chẩn đoán dựa vào kĩ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao hơn (10 4 tế bào/ml) so với các phương pháp khác: phương pháp kiểm tra miễn dịch học (10 4 - 10 5 tế bào/ml) (Gilaspie và Harris, 1979; Davis và Dean, 1994); quan sát vi khuẩn Lxx trên nền kính hiển vi đối pha (10 6 tế bào/ml). Chẩn đoán dựa vào việc sử dụng các probe DNA: Chung và ctv. (1994) đã sử dụng probe DNA để làm tăng độ nhạy trong phát hiện vi khuẩn Lxx ở nồng độ 10 4 tế bào/ml. Tuy nhiên, kĩ thuật này dựa vào sự lai của mỗi mẫu vi khuẩn với các probe DNA được đánh dấu, chậm và tốn kém nên không hiệu quả trong công tác chẩn đoán bệnh (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Kỹ thuật PCR: Pan và ctv. (1998); Taylor và ctv. (2003); Grisham và ctv. (2007) đã thành công trong chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kĩ thuật PCR. Primer cho các phản ứng này được thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx. 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới Bệnh cằn mía gốc là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất tác động đến năng suất và sản lượng mía trên thế giới. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc. Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia (trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Đến năm 1980, Davis và ctv. đã thành công khi phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết nước mía trên môi trường nhân tạo. Năm 1998, Pan và ctv. dùng kĩ thuật PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch khuẩn lạc nuôi cấy và dịch chiết nước mía; cặp mồi Cxx được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA dài 438 bp đặc hiệu cho tác nhân gây bệnh. Hoy và ctv. (1999) đã tiến hành so sánh hiệu quả của các phương pháp khác nhau trong phát hiện dịch bệnh cằn mía gốc trên cánh đồng. Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chuyển gen và gây đột biến Transposon thành công trên đối tượng vi khuẩn Lxx. Cặp mồi có độ nhạy và tính đặc 33 hiệu cao hơn cho phản ứng PCR phát hiện Lxx trong dịch chiết nước mía đã được phát triển bởi Taylor và ctv. (2003). Năm 2004, Monteiro-Vitorello và ctv. đã thành công trong quá trình nghiên cứu trình tự genome của vi khuẩn Gram dương Lxx. Cũng trong năm này, viện khoa học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc đã phát hiện được vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR. Đến năm 2006, Young và ctv. đã chứng minh sự ổn định về mặt di truyền của 105 quần thể Lxx được phân lập từ các vùng trồng mía có sự phân bố địa lý khác nhau trên thế giới (Indonesia, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Brazil, Mali, Zimbabwe, Nam Phi và Réunion). Gần đây nhất, vào tháng 4 năm 2007, Grisham và ctv. đã tuyên bố thành công trong việc chẩn đoán sớm dịch bệnh cằn mía gốc trên cánh đồng. Tác giả đã tiến hành phản ứng Real – Time PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx từ lá của cây mía còn non. Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong chiến lược đề phòng và kiểm soát dịch bệnh từ giai đoạn sớm nhằm giảm thiệt hại do bệnh gây ra. 2.5.2. Trong nƣớc Bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện ở nước ta từ rất lâu và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với nhiều vùng sản xuất (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, loại bệnh này vẫn chưa thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. Các nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trong nước chỉ tập trung vào khía cạnh điều tra, khảo sát, đánh giá tỉ lệ bệnh cũng như tác hại của bệnh trên cánh đồng. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. 34 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 năm 2007 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại phòng Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm Mẫu mía bệnh làm vật liệu thí nghiệm thuộc các giống C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427 được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, Bình Dương. Cây mía được chọn là cây có các biểu hiện bên ngoài của bệnh cằn mía gốc (cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, có vết đổi màu trong thân). Cây con nuôi cấy mô trong thí nghiệm chủng được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương và trồng tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm Hóa chất trong dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: Safranin (BDH Chemicals, Anh), cồn 96 . Hóa chất trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lxx: cornmeal agar (Việt Nam), Bactoagar (BioRad, Mỹ), Bactopeptone (Himedia, Ấn Độ), bovine hemine chloride (Nacalai Tesque, Nhật), MgSO 4 . 7H 2 O (Merk, Đức), K 2 HPO 4 (Merk, Đức), KH 2 PO 4 (Merk, Đức), glucose (Merk, Đức), cystein (Nacalai Tesque, Nhật), bovine serum albumine (Nacalai Tesque, Nhật), nalidixic acid (Nacalai Tesquie, Nhật), soytone (Nacalai Tesquie, Nhật), hemine chloride (Sigma, Đức). Ngoài ra, HCl (Merk, Đức) và NaOH (Merk, Đức) được sử dụng để điều chỉnh pH môi trường về giá trị thích hợp cho sự sống của vi khuẩn. 35 Hóa chất trong các thử nghiệm sinh hóa khẳng định vi khuẩn Lxx: dung dịch KOH 3 % (Merk, Đức), proteone peptone (Oxoid, Anh), NaCl (Merk, Đức), beef extract (Himedia, Ấn Độ), phenol red (Merk, Đức), manitol (Merk, Đức), sorbitol (Merk, Đức), H 2 O 2 30 % (Trung Quốc), dung dịch thuốc thử KI (Trung Quốc), peptone (Himedia, Ấn Độ), starch (Việt Nam), agar (Việt Nam), casein (Oxoid, Anh), ferric citrate (Trung Quốc). 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong toàn bộ quá trình thí nghiệm bao gồm: kính hiển vi quang học, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow), máy đo pH, tủ định ôn, màng lọc vô trùng (0,2 m và 0,45 m), màng parafilm, cối, chày, dao, hộp nhựa, bercher, kim tiêm, túi nilon, ống nghiệm, ống Durham, bình tam giác, đĩa petri, micropipet và đầu típ các loại. 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu Bệnh cằn mía gốc không tạo ra các triệu chứng biểu hiện rõ rệt và đặc trưng nên rất khó phát hiện cây bị bệnh (Pan và ctv., 1998; Brumbley và ctv., 2006; Taylor và ctv., 2003). Do đó, cần phải rất thận trọng trong quá trình thu thập mẫu để chọn đúng cây bị bệnh vì đây là khâu quan trọng đầu tiên quyết định thành công của tất cả các thí nghiệm. Chỉ tiêu quan sát Cây sinh trưởng và phát triển chậm, có đường kính nhỏ, lóng ngắn hơn so với các cây xung quanh. Tuy nhiên, nếu hầu hết cây trong ruộng mía đều bị bệnh thì sẽ không có sự khác biệt (Comstock và Lentini, 2005). Do đó, chúng tôi tiến hành so sánh với cây trong một ruộng khác có các điều kiện canh tác tương tự (cùng giống, cùng thời gian trồng, cùng lượng nước tưới và phân bón). Ngoài ra, cây bị bệnh còn có sự đổi màu của các bó mạch ở phía dưới mắt mía (khi dùng dao chặt chéo thân qua phần mắt mía có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn) (Comstock và Lentini, 2005; Brumbley và ctv., 2006; Pan và ctv., 1998). 36 37 3.3.2. Phƣơng pháp nhuộm STM Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: hòa tan 2,5 g safranin trong 100 ml cồn 96 . Sau đó, thêm nước cất vào dung dịch cho vừa đủ 1000 ml. Quy trình nhuộm STM để phát hiện cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.1): nhổ cây mía, chặt sát gốc, nhúng vào dung dịch thuốc nhuộm safranin 2,5 ‰ và để dưới trời nắng. Sau khoảng 30 phút, lấy cây mía ra; cây mía được lóc bỏ vỏ để lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Cắt thân mía thành từng lát mỏng theo chiều ngang và quan sát màu của các bó mạch dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần. Tiến hành ghi nhận số liệu tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng của thân mía đem nhuộm STM (trong đó, bó mạch đỏ là bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn; bó mạch vàng là bó mạch bị nhiễm vi khuẩn). Mức độ nhiễm bệnh của cây có thể được đánh giá dựa vào tỉ lệ của các loại bó mạch. Theo đó, cây mía được đánh giá là nhiễm nặng, nhiễm trung bình hay nhiễm nhẹ khi có tỉ lệ mạch đỏ lần lượt chiếm < 70 %, 70 – 84,9 % và 85 – 99,9 %. Ngược lại, cây mía không bị bệnh cằn mía gốc khi không có sự hiện hiện của mạch vàng, tức tỉ lệ mạch đỏ là 100 % (Hà Đình Tuấn, 2004). 3.3.3. Phƣơng pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh Tiến hành chủng bệnh cho cây nuôi cấy mô ba tháng tuổi bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.2). Quy trình chủng bệnh được tiến hành như sau: cắt ngang ngọn của cây mía nuôi cấy mô ở ngay phía trên phần mô phân sinh ngọn, dùng kim tiêm bơm 1ml dịch chiết từ cây mía bị nhiễm bệnh lên bề mặt mới cắt. Sau đó, bọc túi nilon vào phần ngọn mới cắt và cột lại để tránh sự tấn công của côn trùng phá hoại (Young và Brumbley, 2004). 3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn Dùng que cấy lấy dịch vi khuẩn và khuấy đều trong giọt KOH trên miếng lam. Sau đó, nhấc nhẹ que cấy, nếu xuất hiện dịch nhớt kéo theo que cấy (dài 2 – 3 cm) thì 38 39 vi khuẩn cần xác định là vi khuẩn Gram (-). Ngược lại, ở vi khuẩn Gram (+) không có dịch nhớt (Malcolm và Charles, 1997). 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate Tiến hành kiểm tra khả năng lên men của các dòng vi khuẩn phân lập được với 2 loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Cách thực hiện như sau: hút 20 l dịch vi khuẩn cho vào các ống nghiệm chứa môi trường Phenol Red Carbohydate Broth (phụ lục 4; trong đó, carbohydrate là manitol hoặc sorbitol). Chỉ tiêu quan sát: sau khi ủ ở 28 C trong 48 h, khả năng lên men của vi khuẩn được đánh giá dựa vào khả năng sinh acid và khả năng sinh hơi. Vi khuẩn có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường không đổi màu. Vi khuẩn có khả năng sinh hơi khi có bọt khí xuất hiện trong ống Durham và ngược lại. Nếu vi sinh vật lên men chậm, sự đổi màu thường không rõ ràng và không có bọt khí xuất hiện trong ống Durham, cần phải so sánh với ống đối chứng không cấy vi sinh vật hoặc thực hiện lại thử nghiệm để thu được kết quả chính xác (Trần Linh Thước, 2003). 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật Thử nghiệm Catalase: tất cả các vi sinh vật hiếu khí chứa chuỗi chuyền điện tử cytochrome đều có enzyme catalase, đây là enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử thông qua quá trình thủy phân H 2 O 2 thành H 2 O và O 2 . Thử nghiệm được tiến hành bằng cách nhỏ trực tiếp 1 ml dung dịch H 2 O 2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt môi trường thạch SC; phản ứng được ghi nhận thông qua hiện tượng sủi bọt khí. Thử nghiệm Catalase được ghi nhận dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí; ngược lại, thử nghiệm âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2003). Thử nghiệm amylase: trong thí nghiệm này, môi trường Starch Agar (phụ lục 5) và dung dịch thuốc thử KI được sử dụng để xác định hoạt động phân giải tinh bột của enzyme amylase ngoại bào. Phản ứng được thực hiện bằng cách chuyển 20 l dịch vi khuẩn phân lập được lên đĩa môi trường Starch Agar. Sau khi ủ ở 28 C 40 trong 24 h, tiến hành kiểm tra lượng tinh bột trên đĩa môi trường bằng dung dịch KI. Phản ứng amylase được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải tinh bột xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn. Ngược lại, phản ứng âm tính khi không có vòng phân giải tinh bột quanh vùng phát triển của vi khuẩn (Schaad, 1994). Thử nghiệm protease: nhằm xác định khả năng phân giải protein bởi enzyme protease ngoại bào của vi sinh vật. Thử nghiệm này được thực hiện trên môi trường SC có bổ sung 1% (w/v) casein và 0,05 % (w/v) ferric citrate (trong đó, nguồn protein được thử nghiệm là casein, đây là loại protein chính có trong sữa). Phản ứng được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải trong suốt xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn; ngược lại là phản ứng âm tính (Schaad, 1994). 3.4. Bố trí thí nghiệm Luận văn bao gồm bốn thí nghiệm như sau: Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi và thống kê tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch vàng) trong mỗi lóng; từ đó suy ra vị trí lóng có mật độ vi khuẩn cao nhất (tức là lóng có tỉ lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn cao nhất). Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Dịch chiết này được lọc qua màng lọc 0,45 m và chủng bệnh vào các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi. Sau các khoảng thời gian 15, 30, 45, 60 ngày, khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp STM. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Sau đó, lọc dịch . 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx. 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới Bệnh cằn mía gốc là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất tác động đến năng suất và. đến nay, ở Vi t Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. 34 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ ngày. hiển vi hay bằng phương pháp miễn dịch học ta có thể phát hiện được Lxx vào cuối vụ mía lúc mà nồng độ vi khuẩn cao nhất trong cây (Pan và ctv., 1998). Tuy nhiên, vi c phát hiện sớm tác nhân gây