51 Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS3) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 150 0 1 0 0,67 2 60 125 0 4 0 3,20 3 60 147 0 2 0 1,36 4 60 117 0 2 0 1,70 Trung bình 0 1,73 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS3). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 179 0 5 0 2,79 2 60 172 0 10 0 5,81 3 60 180 0 6 0 3,33 4 60 183 0 7 0 3,83 5 60 193 0 5 0 2,59 Trung bình 0 3,67 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm). Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng) 52 Hiệu quả thanh lọc cao giúp giảm bớt khó khăn trong việc xác định mô sẹo đƣợc chuyển nạp gen. Kết quả thanh lọc ở bảng 4.7 và bảng 4.8 cho thấy tỉ lệ mẫu sống sót sau khi đƣợc chuyển nạp gen ở bông vải là thấp. Hiện nay, trong chuyển nạp gen vào cây bông vải, các tác nhân thanh lọc đƣợc sử dụng chủ yếu là các kháng sinh nhƣ: kanamycin, hygromycin…và các tác giả này cũng báo cáo là hiệu quả chuyển nạp gen thấp (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Điều quan trọng ở đây đó là ý nghĩa của việc thiết kế các bƣớc thanh lọc và tác nhân đƣợc sử dụng. Các bƣớc thanh lọc nhƣ trên giúp cho các mẫu chuyển nạp gen thích nghi từ từ với sự thay đổi nồng độ đƣờng. Sự có mặt của đƣờng glucose sẽ giúp cho tất cả các mẫu đều phát triển, điều này giúp cho chúng ta tránh bị mất những mẫu chuyển gen. Một số tác giả dùng hệ thống thanh lọc với chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, hygromicin…, khi thanh lọc đặt ngay mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng có nồng độ tác nhân thanh lọc cao sau đó mới giảm dần nồng độ tác nhân thanh lọc. Ví dụ nhƣ: trong nghiên cứu của mình Chaudhary và ctv. (2003) sử dụng hệ thống thanh lọc qua 4 lần thanh lọc với nồng độ Kanmycin lần lƣợt là 50mg/l, 50mg/l, 25mg/l và 0mg/l (Chaudhary và ctv., 2003). Hay nhƣ Haq (2004) thanh lọc mẫu chuyển gen qua 4 lần thanh lọc với nồng độ kanamycin lần lƣợt là 50mg/l, 25mg/l, 25mg/l và 25mg/l (Haq, 2004). Điều này có thể làm cho chúng ta mất đi một số mẫu chuyển nạp gen vì các mẫu chuyển nạp gen chƣa kịp thích nghi, gen đƣợc chuyển chƣa hoạt động ổn định do đó chƣa giúp cho mẫu chuyển gen có thể sống sót đƣợc. Trong khi đó, nếu áp dụng các bƣớc thanh lọc nhƣ trên sẽ giúp làm giảm việc mất đi các mẫu chuyển nạp gen vì với cách thiết kế nhƣ trên tất cả các mẫu đều có điều kiện phát triển nhƣ nhau nhƣng những mẫu đƣợc chuyển gen sẽ phát triển mạnh hơn và các mẫu sẽ đƣợc thanh lọc dần qua các lần thanh lọc tiếp theo. Hơn nữa, sử dụng đƣờng mannose để thanh lọc các mẫu sẽ giúp làm giảm những lo ngại về tính an toàn của cây chuyển nạp gen khi sử dụng kháng sinh trong thanh lọc. 53 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với kết quả thu đƣợc về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và SSR60F, trong đó đã tập trung nghiên cứu về hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose ở bông vải sau khi đƣợc biến nạp, chúng tôi có những nhận xét sau: - Sau khi lây nhiễm trụ hạ diệp bằng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (vắc tơ pManCa mang gen pmi và gen gus), các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai lần thanh lọc trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở lần thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. - Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công đƣợc chính xác. - Tỷ lệ sống sót của mẫu đƣợc biến nạp gen qua thanh lọc bằng mannose ở bông vải là thấp vì vậy cần tăng số lƣợng mẫu biến nạp. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose. - Tiếp tục thực hiện các bƣớc tiếp theo để tạo ra cây biến đổi gen. - Chú ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen ở Việt Nam. 54 55 CHƢƠNG 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình, 2001. Thực trạng chuyển nạp gen ở Việt Nam. Hội Nghị Nhận Thức Về Công Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 6-8 tháng 7 năm 2001. 2. Bộ GD và ĐT, Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công Nghiệp,1996. Cây Công Nghiệp. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003. Mục tiêu và trƣơng trình phát triển năm 2003 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 1/2003: 5-8. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000.Di truyền phân tử-Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (tập II:Chuyển nạp gen ). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 5. Phạm Hoàng Hộ, 1997. Cây cỏ Việt Nam. Tái bản lần thứ ba. Nhà Xuất Bản Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. 6. Lê Kim Hỷ, 2003. Phát Triển Cây Bông Vải Ở Các Tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ. Hội nghị về phát triển cây bông vải ở Duyên Hải Nam Trung Bộ, tháng 5/2003. 7. Lê Quang Quyến, 2004. Phát Triển Cây Bông Và Nghề Trồng Bông Ở Việt Nam. Viện Nghiên Cứu Cây bông và Cây có sợi. 8. Trƣơng Thu Thủy, Nguyễn Hữu Cƣờng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Trịnh Minh Hợp, Lê Quang Quyến, 2003. Nghiên cứu quy trình tái sinh cây bông (Gossypiym hirsutum L.) từ phôi Soma. Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc, Hà Nội. 831 – 836. 56 TIẾNG NƢỚC NGOÀI 9. Binns A.N. and Costantino P., 1998. The Agrobacterium oncogens, pp: 251-266. In: The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria, (Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J. J. - editors). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 10. Brubaker C.L., Brown A.H.D., Stewart J.M., Kilby M.J. and Grace J.P., 1999. Production of fertile hybrid germplasm with diploid Australian Gossypium species for cotton improvement. Euphytica 108: 199-210. 11. Chauhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K. and Pental D., 2003. Slow desiccation to high-frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutum L. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 12. Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J., Guo S.D., Jiao G.L. and Zhao J.X., 1994. The 2,4-D resistant transgenic cotton plants produce by Agrobacterium mediated gene transfer. Scientina Agriculture Sinica 27(2): 31 – 37. 13. Chen Z.X, Zhi X.J. and Xian S.J., 2000. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of cotton using petiole explants. US Patent No.: WO 00/77230 A1. 14. Chilton M.D., Currier T.C., Farrand S.K., Bendich A.J., Gordon M.P. and Nestor E.W., 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proceeding of the National Academy of Sciences. USA 71: 3672- 3676. 15. Chlan Y.L., Lin J., Cary J.W. and Cleveland T.E., 1995. A producer for biolistic transformation and regeneration of transgenic cotton from meristematic tissues. Plant Molecular Biology Reporter 13: 31-37. 16. Deacon J., Robertson A. and Isbister A., 2005. The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. 17. Deng W., Chen L., Wood D.W., Metcalfe T., Liang X., Gordon M.P., Comai L. and Nester E.W., 1998. Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host cyclophilins. Proceeding of the National Academy of Sciences 95: 7040-7045. 57 18. Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K. and Murphy P.J., 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 19. Finer J.J. and Smith R.H., 1984. Initiation of callus and somatic embryos from explants of mature cotton (Gossypium klotzschianum Anderss). Plant cell reports 3: 41- 43. 20. Finer J.J. and McMullen M.D., 1990. Transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) via particle bombardment. Plant cell reports 8 (10): 586-589. 21. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I.N., Raska K.A. and Muray E.E., 1987. Transformation of cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants. Plant Molecular Bology 10: 105-116. 22. Gelvin S.B., 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Bology 51: 223-256. 23. Gelvin S.B., 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 24. Gould J.H. and Cedeno M.M., 1998. Adaption of shoot apex culture to Agrbacterium- mediated transformation. Plant Molecular Bology 16: 1-10. 25. Hansen G. and Chilton M.D., 1999. Lessons in gen transfer to plants by a gifted microbe. Current Topics Microbiology Immunology 240: 21-57. 26. Hoa T.T.C. and Bong B.B., 2003. Effcient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa) using mannose selection system. Viet Nam Journal of Agriculture & Rural Development 1+2: 60-63. 27. Hoekema L. 1984. A binary vector strategy base on separation of Vir- and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180. 28. Haq I.U., 2004. Agrobacterium-Mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutm L.) via vacuum infiltration. Plant Molecular Biology Reporter 22: 279- 288. 58 29. ISAAA, 2002. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2001 Feature: Bt Cotton. http://www.isaaa.org/kc/Publications/pdfs/isaaabriefs/Briefs 26b.pdf. 30. ISAAA, 2004. Preview: Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004.http://www.isaaa.org/kc/CBTNews/press_release/briefs/Esummary/Executive Summary (English).pdf. 31. Jiang B.G., 2004. Optimization of Agrobacterium mediated cotton transformation using shoot apex explants and quantitative trait loci analysis of yeild and yeild component traits in Upland Cotton (Gossypium hirsutm L.). PhD. Dissertation, Louisiana State University, USA. 32. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T., Ankenbauer R.G. and Nester E.W., 1990. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology 172: 4945- 4950. 33. Korber H., Strizhov N., Staiger D., Feldwish J., Olsson O., Sandberg. G., Palme K., Schell J. and Koncz C., 1991. T-DNA gene 5 of Agrobacterium modulates auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone an tagonist in plants. EMBO Journal 10: 3983-3991. 34. Kumria S., Sunnichan V.G, Das D.K., Gupta S.K., Reddy V.S., Bhatnagar R.K. and Leelavathi S., 2003. High-frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum L.) through metabolic stress. Plant Cell Reports 21(7): 635-639. 35. Lai E.M. and Kado C.I., 1998. Processed VirB2 Is the Major Subunit of the Promiscuous Pilus of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 180: 2711-2717. 36. McCabe D.E. and Martinell B.J., 1993. Transformation of lite cotton cultivars via particle bombardment of meristems. Bio/Technology 11: 596-598. 37. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G. and Ream W., 1992. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. Journal of Bacteriology 174: 2288-2297. 59 38. Mishra R., Wang H.Y., Yadav N.R. and Wilkins T.A., 2003. Development of a highly regenrable elite Acala cotton (Gossypium hirsutumcv. Maxxa)–a step towards genotype-independent regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 21–35. 39. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia platarum 15: 473-493 40. Nobre J., Keith J.D. and Dunwell J.M., 2001. Morphogenesis and regeneration from stomatal guard cell complexes of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports 20: 8-15. 41. Ophel K. and Kerr A., 1990. Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium biovar 3 from grapevines. International Journal of Systematic Bacteriology 40: 236-241. 42. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fruchs R.L, Sims S.R., Grennplate J.T. and Fischhoff D.A., 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technology 8: 934- 943. 43. Perlak F. J., Oppenhuizen M., Gustafson K., Voth R., Sivasupramaniam S., Heering D., Carey B., Ihrig R.A. and Roberts J.K., 2001. Development and commercial use of Bollgard ® cotton in the USA- early promises versus today’s reality. The Plant Journal 27 (6): 489-501. 44. Rajasekaran K., Hudspeth R.I., Cary J.W., Anderson D.M. and Cleveland D.M., 2000. High-frequency stable transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) by particle bombardment of embryogenic cell suspension cultures. Plant Cell Reports 19: 539- 545. 45. Rajasekaran K., 1996. Regenration of plants from cryopreserved embrygenic cell suspension and callus cultures of cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Cell Reports 3: 859-864. 46. Reichert N.A., Lim T.K. and Young M.M., 2002. Method for transformation of cotton and organogenic regeneration. US Patent No: US 6,479,287 B1. 47. de la Riva G.A., González-Cabrera J., Vázquez-Padrón R. and Ayra-Pardo C., 1998. The Agrobacterium tumefaciens gene transfer to plant cell. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. 60 48. Sakhanokho H.F., Zipf A., Rajasekaran K., Saha S. and Shama G.C., 2001. Induction of highly embryogenic calli and plant regenration in Upland (Gossypium hirsutumL.) and Pima (Gossypium barbadense L.) cottons. Crop Science 41: 1235- 1240. 49. Satyavathi V.V., Prasad V., Laskmi B.G. and Sita G.L., 2002. High efficiency tranformation protocol for three Indian cotton varieties via Agrobacterium tumefaciens. Plant Science 162: 215-223. 50. Stachel S.E., Timmerman B. and Zambryski P., 1987. Activation of Agrobacterium tumefaciens vir gene expression genrates multiple single-stranded T-strand molecules from the pTiA6 T-region: requirement for 5' virD gene products. EMBO Journal 6: 857-863. 51. Sunilkumar G. and Rathore K.S., 2001. Transgenic cotton: factors influencing Agrobaterium-mediated transformation and regeneration. Molecular Breeding 8: 37- 52. 52. Tinland B., Fournier P., Heckel T. and Otten L., 1992. Expression of a chimeric heat-shock-inducible Agrobacterium 6b oncogene in Nicotiana rustica. Plant Molecular Biology 18: 921- 930. 53. Umbeck P.F., Johnson G., Barton K. and Swain S., 1987. Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Biotechnology 5:263 – 266. 54. Valentine L., 2003. Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiology 133: 948-955. 55. Ziemienowicz A., 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta biochimica polonica 48: 623.635. 56. Zupan J. R., Citovsky V. and Zambryski P., 1996. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells. Proceeding of the National Academy of Sciences 93: 2392-2397. 57. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K. and Winans S. C., 2000. The Bases of Crown Gall Tumorigensis. Journal of Bacteriology 182: 3885- 3895. 58. Winans S.C., Allenza P., Stachel S.E., McBride K.E. and Nester E.W., 1987. Characterization of the virE operon of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6. Nucleic Acids Research 15: 825.837. . Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và SSR60F, trong đó đã tập trung nghiên cứu về hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose ở bông vải sau khi đƣợc biến nạp, chúng tôi. của cây chuyển nạp gen khi sử dụng kháng sinh trong thanh lọc. 53 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với kết quả thu đƣợc về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium. lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3 ,67 % ở giống SSR60F.